CN106434402B - 一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及其构建方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及构建方法，该表达木糖异构酶的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae SEB8)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11328。本发明还提供了该酿酒酵母SEB8的构建方法。本发明获得的菌株SEB8在48h的发酵时间里，能够利用33.71 g/L木糖，产生14.73 g/L的乙醇，乙醇收率达到0.44 g/g木糖；该菌株具有木糖发酵快、乙醇收率高等优点，能以木质纤维素为原料的糖化液生产燃料乙醇，大大降低了燃料乙醇的生产成本，具有广阔的应用前景。

Description

一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株及其构建方法
技术领域
本发明涉及一种重组酿酒酵母菌株，具体涉及的是一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株以及该菌株的构建方法。
背景技术
以木质纤维素为原料生产燃料乙醇被视为未来极具发展前景的一种生物能源获得方式，主要是因为木质纤维素具有来源广泛、储量大、价格低廉、可再生等优点。酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)因具有糖代谢速率快，乙醇产量高，对环境耐受能力好等优点，已被广泛的应用于第一代燃料乙醇的生产中。然而，在木质纤维素水解获得的糖液中，约有20％–30％的糖为木糖，野生型酿酒酵母不能直接利用木糖进行生长和发酵，但酿酒酵母本身能够表达木酮糖激酶(Xylulose kinase,XK)，可将木酮糖磷酸化生成木酮糖-5-磷酸，然后进入戊糖磷酸途径(Pentose Phosphate Pathway,PPP)，最后转化生成乙醇。因此只要成功的沟通木糖转到木酮糖的桥梁，就能构建出能同时发酵木糖产乙醇的工程菌株。
自然界中存在两条木糖代谢途径，在大多数能利用木糖的真菌和酵母中，木糖可被NADPH依赖型木糖还原酶(Xylose reductase,XR)还原为木糖醇，然后被NAD+依赖型木糖醇脱氢酶(Xylitol dehydrogenase,XDH)氧化为木酮糖，再磷酸化进入PPP途径。然而，XR主要为NADPH依赖型酶，而XDH则是严格的NAD+依赖型，不同的辅酶亲和性导致体内的辅酶不平衡问题，从而使菌株大量积累中间代谢产物木糖醇，大大降低了乙醇的产量。
在一些细菌和厌氧真菌中，存在木糖异构酶(Xylose isomerase,XI)基因xylA，可直接将木糖异构化生成木酮糖，然后磷酸化进入PPP途径。理论上讲，如果XI途径能够成功的在酿酒酵母中进行表达，则可以避免木糖醇的生成，从而提高乙醇的产量。但从相关报道来看，虽然xylA基因在酿酒酵母中异源表达后能产生相应的活性蛋白，但所构建的重组菌在木糖中的生长速率均比较缓慢，不能满足发酵的需求。另外，目前大多数相关研究选择了实验室酵母作为出发菌株，相关的研究成果很难应用到工业生产中。因此，在进行相关工程菌构建时，应考虑以下问题：一是选择工业酿酒酵母作为出发菌株，二是提高xylA基因的拷贝数，三是利用进化工程方式从整体提升菌株代谢木糖的能力。
发明内容
本发明的目的在于解决现有xylA基因在酿酒酵母中异源表达后，其构建的重组菌在木糖中的生长速率均比较缓慢，不能满足发酵需求的问题；提供解决上述问题的一株基于木糖异构酶途径的且能够高效发酵木糖产乙醇的絮凝性工业酿酒酵母。
为达到上述目的，本发明的技术方案如下：
本发明的第一个目的是提供一株表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株，该酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae SEB8)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11328，保藏时间为2015年9月6日。
本发明的第二个目的是提供一种表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株的构建方法，该方法包括如下步骤：
步骤1：构建出发菌株
在酿酒酵母SEB3产孢子后，筛选出单倍体菌株SEB3α25，利用同源重组的方法将单倍体菌株SEB3α25中的URA3-XYL1-XYL2片段敲除，再以KanMX为筛选标记，将单倍体菌株SEB3α25的GRE3基因敲除，获得出发菌株YC-8；
步骤2：构建表达质粒
获得如SEQ ID NO：1所示的PXYLA2基因，然后将PXYLA2基因连接到质粒pRS426中，构建出多拷贝表达质粒pRS426-PXYLA2；
步骤3：获得酿酒酵母菌株YCGP5
将步骤2构建的质粒pRS426-PXYLA2中的PXYLA2基因表达片段通过PCR扩增，并用δ-整合的方法多拷贝导入步骤1获得的出发菌株YC-8的基因组上，获得酿酒酵母菌株YCGP5；
步骤4：获得工程菌株SEB8
对步骤3获得的酿酒酵母菌株YCGP5进行微氧发酵驯化后，再进行筛选，获得工程菌株SEB8。
优选地，上述步骤4中微氧发酵驯化方法，具体包括以下步骤：
步骤a：将菌体接种于YNBX培养基中进行培养；
步骤b：待菌株生长到对数期时，转接入新的YNBX培养基培养至对数期，如此反复转接30代，至共计培养60天，得到菌株SEB8。
优选地，上述步骤a中菌体的起始接种量的OD660值为0.05。
优选地，上述步骤a中在YNBX培养基中培养温度为35℃。
优选地，上述步骤a中的YNBX培养基包括1.1-2.0g/L无氨基酵母氮源、9-18g/L硫酸铵和10-25g/L木糖。
更优选地，上述步骤a中的YNBX培养基包括1.7g/L无氨基酵母氮源、10g/L硫酸铵和20g/L木糖。
本发明的第三个方面提供一种表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株在乙醇生产中的应用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点及有益效果：
1)与传统技术相比，本发明公开的酿酒酵母菌株SEB8能以木质纤维素原料的糖化液生产燃料乙醇，大大降低了燃料乙醇的生产成本。
2)本发明公开的酿酒酵母菌株SEB8在低接种量(0.2g-DCW/L)的条件下，发酵48h过程中，能够利用33.71g/L木糖，产生14.73g/L的乙醇，乙醇收率达到0.44g/g-木糖，该菌株具有木糖发酵更快、乙醇收率更高等优点。
3)本发明公开的表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株的构建方法，解决了现有技术中xylA基因在酿酒酵母中异源表达后，其构建的重组菌在木糖中的生长速率均比较缓慢，不能满足发酵需求的问题。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1
一株表达木糖异构酶的重组工业酿酒酵母菌株，所述酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae SEB8)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11328。该酿酒酵母菌株SEB8的具体构建方法如下：
1)构建出发菌株：
将酿酒酵母SEB3在产孢子培养基(0.5g/L葡萄糖，20g/L醋酸钾，2g/L酵母粉，pH5.5)上培养2天后，利用溶壁酶30℃下处理10-20min后，利用显微操作系统挑取单孢子，经验证后获得单倍体细胞。本发明只选择性别为α的单倍体SEB3α25，筛选出单倍体菌株SEB3α25。
以质粒pBlu-LTKTL-TDH3为模板，利用引物Fg3/Rg3扩增出loxP-KanMX-loxP片段，然后利用醋酸锂法导入SEB3α25中，利用同源重组的方式，以KanMX为筛选标记，将loxP-KanMX-loxP片段导入菌株的GER3位点上，敲除GRE3基因，使菌株失去木糖醇生成能力，基因敲除与否利用引物Fg-v/Rg-v进行验证。
利用同样原理，以质粒pBlu-LTKTL-TDH3为模板，利用引物Fxy/Rxy扩增出loxP-KanMX-loxP片段，利用同源重组的方式，以G418为筛选标记，将loxP-KanMX-loxP片段导入菌株的URA3位点上，将SEB3α25中的URA3-XYL1-XYL2基因敲除，使菌株失去木糖利用能力，利用5-FOA平板(1.7g/L YNB w/o AA，5.0g/L(NH4)2SO4，20g/L葡萄糖，50mg/L尿嘧啶，1.0g/L 5-FOA)验证URA3基因的敲除，同时利用引物XYL1-F/XYL1-R验证XYL1的敲除情况，利用XYL2-F/XYL2-R验证XYL2基因的敲除情况，最后得到出发菌株YC-8。
本发明中URA3-XYL1-XYL2基因和GRE3基因敲除的先后顺序可以调换。
上述酿酒酵母SEB3保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11323。质粒pBlu-LTKTL-TDH3为现有质粒，公开在2013年Tomitaka等人报道的一篇文献中，该文献名称为：Isolation and characterization of a mutant recombinantSaccharomyces cerevisiae strain with high efficiency xylose utilization；作者有：Tomitaka M、Taguchi H、Fukuda K、Akamatsu T、Kida K；公开的刊物为：Journal ofBioscience and Bioengineering.2013,116(6):706-715。上述利用同源重组的方式，以KanMX为筛选标记、以及以G418为筛选标记进行位点基因敲除的方法为本行业常规技术手段，因此在此不再赘述。
2)构建表达质粒：
2.1)将源自于P.ruminicolaTC2-24的木糖异构酶原始基因序列XI的密码子进行酿酒酵母偏好型优化，获得如SEQ ID NO：1所示的PXYLA2基因。
2.2)以质粒pXR为模板，利用引物T7-F及TDH3t-R将TTHD3扩增出来，引物T7-F及TDH3t-R上分别带有酶切位点XhoI和SalI，pRS426质粒经XhoI和SalI双酶切后，利用T4连接酶将TTHD3连接入经双酶切的pRS426质粒上，形成pRS426-TTDH3。
质粒pXR也为现有质粒，与质粒pBlu-LTKTL-TDH3相同，也公开在2013年Tomitaka等人报道的该篇文献中。
2.3)同理，以质粒pXR为模板，利用引物TDH3p-F及T3-R将PTHD3扩增出来，引物TDH3p-F及T3-R上分别带有酶切位点BamHI和NotI，pRS426质粒经BamHI和NotI双酶切后，利用T4连接酶将PTHD3连接入经双酶切的pRS426质粒上，形成pRS426-PTDH3-TTDH3。
2.4)利用引物PXYLA2-F/PXYLA2-R将PXYLA2基因扩增出来，将PXYLA2基因片段及质粒pRS426-PTDH3-TTDH3经EcoRI酶切后，用T4连接酶连接，经酶切、测序验证后，即获得多拷贝表达质粒pRS426-PXYLA2。
3)以质粒pRS426-PXYLA2为模板，利用引物δ-XI-F2/δ-XI-R对PTDH3-xylA-TTDH3片段进行扩增，并对扩增片段进行纯化。
4)利用醋酸锂法将纯化后的PTDH3-xylA-TTDH3片段导入酵母菌株YC-8中，利用2％YNBX平板(1.7g/L无氨基酵母氮源、5.0g/L硫酸铵、20g/L木糖、20g/L琼脂)筛选出阳性转化子，即为木糖利用菌株，以2％YPX培养基(20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、20g/L葡萄糖)于试管中进行震荡培养48h，并测定其OD660，选择OD660最高的6株菌，即生长最好的6株菌，进行发酵筛选。
发酵筛选：菌株在5％YPD培养基(20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、50g/L葡萄糖)中预培养48h后，取10mL菌液离心后除去上清液，接入含100mL的4％YPX培养基(20g/L蛋白胨、10g/L酵母粉、40g/L葡萄糖)的100mL三角瓶中，塞上塞子，置于200rpm的水浴锅中35℃下发酵48h。于0h、8h、24h、48h取一定量的培养液，按一定比例稀释之后测定木糖消耗和乙醇生成，选择木糖消耗速率、乙醇生成速率、以及乙醇收率最高的菌株YCGP5。
5)对YCGP5进行微氧发酵驯化后获得菌株SEB8。
发酵驯化：将菌株按起始OD660＝0.05的接种量，接入含100mL 2％的YNBX培养基的300mL三角瓶中，于水浴锅中35℃下200rpm的转速培养，待菌株生长到对数期时，将菌株按OD660＝0.05转接入新的培养基中，如此反复传代培养30代，共计60天后，通过生长和发酵筛选得到菌株SEB8。生长和发酵筛选方法与上述步骤4)中所述方法相同。
上述各步骤中所用引物的序列如表1所示。
表1
Figure BDA0001126659500000061
实施例2
本实施例对菌株SEB8的发酵情况及酶活情况进行了测定，其中发酵方法与上述步骤4)中的方法相同，此处不再赘述。
酶活测定：取发酵24h时的发酵液2mL，4℃下离心收集菌体。将菌体用1mL的TEA缓冲液洗涤3次后，用1mL的TEA缓冲液悬浮菌体，将菌悬液转入含0.5g直径为0.5mm玻璃珠的破碎管中，向破碎管中加入终浓度为1mM的PMSF和0.5mM的DTT。然后于破碎仪上以4500rpm转速破碎30s后于冰上放置2min，如此反复破碎5次，然后于4℃下12000g离心15min，取上清液，即为粗蛋白液。利用布拉班德法测定蛋白的总浓度。所述TEA缓冲液由0.5M的三乙醇胺、0.5mM的EDTA构成，该TEA缓冲液的pH为7.0。
配制0.5mL酶反应体系，在37℃下反应10min，然后于沸水浴中灭活3min，然后测定底物木酮糖的生成浓度。酶反应体系由150mM pH为7.5的Tris-HCl buffer、10mM MgCl2、66.6mM木糖、0.1mL粗蛋白液构成。
本发明中木糖异构酶酶活(U/mg-protein)定义为单位时间内每产生1μmol木酮糖所需的酶量。
菌株SEB8的发酵性能和酶活测定结果如表2所示。
表2
Figure BDA0001126659500000071
表2中的试验结果均为两次重复试验平均值±SEM；表2中的木糖比消耗速率、乙醇产率、及乙醇收率均是基于48h的发酵结果计算而来。
通过上述试验数据可知：经过48h的发酵，表达了XR-XDH途径的木糖利用菌株SEB3α25能够消耗掉35.94g/L的木糖，同时生成10.38g/L的乙醇。然而，该菌株同时也产生了11.21g/L的木糖醇，正是由于大量木糖醇的生成，致使乙醇的收率大大降低，仅为0.31g/g-木糖，即仅有60.8％的木糖转化生成了乙醇。表达了XI途径的YCGP5菌株，其木糖利用量较菌株SEB3α25有所下降，仅为26.10g/L，但由于没有木糖醇的生成，其乙醇产量与菌株SEB3α25相当，乙醇收率达到了0.40g/g-木糖，即能将78.4％的木糖转化为乙醇。经过微氧驯化后，菌株SEB8的木糖发酵速率和乙醇生成速率均得到显著的提升，经48h发酵能够消耗掉33.71g/L的木糖，与菌株SEB3α25相当，高于未驯化菌株YCGP5。同时，该菌株能产生14.73g/L的乙醇，均高于上述两株菌株，其乙醇收率达到0.44g/g-木糖，即能将86.3％的木糖转化为乙醇。另外，对比菌株YCGP5和SEB8中XI的酶活发现，经过微氧发酵驯化后，菌株SEB8中的XI酶活较YCGP5提高了133％。
本研究得到的菌株SEB8无论是在木糖代谢速率，还是乙醇收率，均高于国内外报道的同类菌株。
以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只是作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对本发明进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。
Figure IDA0001126659570000011
Figure IDA0001126659570000021
Figure IDA0001126659570000031
Figure IDA0001126659570000041
Figure IDA0001126659570000051
Figure IDA0001126659570000061

Claims (3)

1.一种构建表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：构建出发菌株
在酿酒酵母SEB3产孢子后，筛选性别为α的单倍体菌株SEB3α25，利用同源重组的方法将单倍体菌株SEB3α25中的URA3-XYL1-XYL2片段敲除，再以KanMX为筛选标记，将单倍体菌株SEB3α25的GRE3基因敲除，获得出发菌株YC-8；
步骤2：构建表达质粒
获得如SEQ ID NO：1所示的PXYLA2基因，然后将PXYLA2基因连接到质粒pRS426中，构建出多拷贝表达质粒pRS426-PXYLA2；
步骤3：获得酿酒酵母菌株YCGP5
将步骤2构建的质粒pRS426-PXYLA2中的PXYLA2基因表达片段通过PCR扩增，并用δ-整合的方法多拷贝导入步骤1获得的出发菌株YC-8的基因组上，获得酿酒酵母菌株YCGP5；
步骤4：获得工程菌株SEB8
对步骤3获得的酿酒酵母菌株YCGP5进行微氧发酵驯化后，再进行筛选，获得工程菌株SEB8；
其中，所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae SEB8)菌株保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏号为CGMCC11328；
其中，所述的步骤4中微氧发酵驯化方法，具体包括以下步骤：
步骤a：将菌体按OD660=0.05的接种量接种于2%YNBX培养基中进行培养；
步骤b：待菌株生长到对数期时，按OD660=0.05的接种量转接入新的2%YNBX培养基培养至对数期，如此反复转接30代，至共计培养60天，得到菌株SEB8；
所述的步骤a中在YNBX培养基中培养温度为35℃；
所述酿酒酵母SEB3 保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，保藏编号为CGMCC11323；
所述的步骤a中的YNBX培养基包括1.1-2.0g/L无氨基酵母氮源、9-18 g/L 硫酸铵和10-25 g/L木糖。
2.根据权利要求1所述的构建表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株的方法，其特征在于，所述的步骤a中的YNBX培养基包括1.7 g/L无氨基酵母氮源、10 g/L 硫酸铵和20 g/L木糖。
3.根据权利要求1所述的方法构建的表达木糖异构酶的酿酒酵母菌株在乙醇生产中的应用。
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