CN107384815B - 一株酿酒酵母菌株及其在综合利用木糖母液和木糖渣产木糖醇中的应用 - Google Patents

一株酿酒酵母菌株及其在综合利用木糖母液和木糖渣产木糖醇中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株酿酒酵母工程菌株，该菌株名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌X3kZPM，菌株已于2017年6月27日保藏在“中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心”，保藏号为CGMCC No.14362。本发明还公开了所述酿酒酵母工程菌株在利用木糖母液生产木糖醇或在综合利用木糖母液和木糖渣生产木糖醇中的应用。实验证实应用本发明所述酿酒酵母工程菌糖醇转化率高，达到理论值的100％，发酵液中木糖醇浓度显著提高，达到83‑91g L‑1，已基本具备实际产业化潜力，工业化应用前景广阔。

Description

一株酿酒酵母菌株及其在综合利用木糖母液和木糖渣产木糖 醇中的应用
技术领域
本发明涉及一株酿酒酵母及其应用，尤其涉及一株酿酒酵母工程菌株及其在综合利用木 糖母液和木糖渣产木糖醇中的应用，属于微生物技术领域。
背景技术
木糖醇是五碳多元醇，具备卡路里低、甜度高、负熔解热等优良特性，被广泛用于食品、 医药、工业制造等行业，市场需求日益增加。目前国内主要的生产方式是利用木糖含量丰富 的玉米芯作为原料，经稀酸水解，回收含有丰富木糖的水解液，水解液经浓缩，结晶析出木 糖，木糖在镍的催化下于高温高压环境加氢还原成木糖醇。上述工艺中，在水解环节未能水 解的部分，通常称为“木糖渣”，其主要组分为纤维素，通常被废弃或低值利用。在浓缩环节， 水解液中木糖的浓度比其他糖类要高很多，因而浓缩时首先析出高纯度的木糖，而当水解液 浓缩到一定程度时，若继续浓缩，木糖外的其他糖也会跟着析出影响木糖的纯度。因此，实 际生产中，析出一定量木糖后剩下的糖液就作为所谓的“木糖母液”被废弃。木糖母液和木 糖渣废弃一方面造成原料浪费，另一方面造成环境污染。
酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)是鲁棒性强，代谢旺盛的食品安全级微生物，被公 认为是极好的微生物细胞工厂，并且，酿酒酵母通常不利用木糖为碳源生长，因而可以最大 限度的转化而不消耗原料中的木糖。但是，高效利用木糖母液，或者综合利用木糖母液和木 糖渣生产木糖醇需要解决以下问题：其一，需要在酿酒酵母菌株中建立木糖转化为木糖醇的 途径；其二，需要酿酒酵母能在细胞内持续产生用于木糖还原的还原型辅酶；其三，需要酿 酒酵母细胞能快速摄取环境中的木糖；最后，需要酿酒酵母菌株能够耐受高浓度的木糖母液 中抑制物和糖产生的压力。然而，检索发现目前还未见有关用于综合利用木糖母液和木糖渣 生产木糖醇的酿酒酵母工程菌株及其应用。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株酿酒酵母菌株及其在综合利用木糖母液和木糖 渣产木糖醇中的应用。
本发明所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌X3kZPM；其是以能在含有25％木糖母液的培养基中良好生长的酿酒 酵母工业菌株作为出发菌株，在其染色体上rRNA和delta区整合木糖还原酶基因XYL1；在 XKS1基因座位整合超表达葡萄糖6磷酸脱氢酶基因ZWF1，在GRE3基因座位的一部分整合 超表达木糖专一转运蛋白的基因MGT05196(N360F)，在GRE3基因座位的剩余部分整合超表 达磷酸戊糖途径非氧化还原部分的四个基因TAL1、RPE1、TKL1、RKI1获得；该菌株的基因 型为：rRNA::loxP-TEF1p-XYL1-PGK1t,delta::loxP-TEF1p-XYL1-PGK1t,xks1::loxP -TEF1p-ZWF1-PGK1t,re3::TPI1p-RKI1-RKI1t-PGK1p-TAL1-TAL1t-FBA1p-TKL1-TKL1t-ADH1p- RPE1-RPE1t-loxP-TEF1p-Mgt01596(N360F)-PGK1t；该菌株已于2017年6月27日保藏于中国 微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.14362。
其中：所述基因XYL1优选克隆自树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis早期称为Pichia stipitis)。
其中：所述基因ZWF1、TAL1、RPE1、TKL1或RKI1优选克隆自酿酒酵母。
其中：所述基因MGT05196(N360F)是在克隆自季也蒙酵母(Meyerozymaguilliermondii) 基因MGT05196的基础上，通过点突变，使其编码蛋白第360位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸。
上述酿酒酵母工程菌菌株的构建方法是：选择能在含有25％木糖母液的培养基中良好生 长的酿酒酵母工业菌株作为出发菌株，以保证菌株能够高效发酵有抑制物的稀释木糖母液； 在出发菌株染色体上rRNA和逆转录转座子Ty1上的δ-sequence区域整合木糖还原酶基因 XYL1以使酿酒酵母具备高效还原木糖为木糖醇的能力；在XKS1基因座位整合超表达葡萄糖 6磷酸脱氢酶基因ZWF1，该步骤一方面敲除了木糖醇继续代谢需要的基因XKS1，排除了木 糖醇被进一步代谢的情况，另一方面，将葡萄糖代谢中间产物葡萄糖6磷酸更多的导入由葡 萄糖6磷酸脱氢酶(ZWF1编码)催化的反应，这一反应是磷酸戊糖途径的第一步反应，是 限速步骤，这一步反应及磷酸戊糖途径接下来的一步反应都能够产生NADPH，用于木糖醇 的还原；在GRE3基因座位的一部分整合超表达磷酸戊糖途径非氧化还原部分的四个基因 TAL1、RPE1、TKL1、RKI1，使磷酸戊糖途径下游代谢更顺畅，使葡萄糖能更多的经由磷酸 戊糖途径代谢，从而提供更多的NADPH；在GRE3基因座位的剩余的另一部分整合木糖专一 转运蛋白的基因MGT05196(N360F)以促进菌株对木糖的吸收，最终获得的酿酒酵母工程菌 株，该工程菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌X3kZPM。
本发明所述酿酒酵母工程菌株在利用木糖母液生产木糖醇中的应用。
其中：所述应用的方法是利用补料发酵工艺生产木糖醇；具体是：以稀释的木糖母液为 主要原料，在稀释的木糖母液中葡萄糖耗尽后流加葡萄糖。
具体的，是以20％(v/v)木糖母液、1％酵母粉、2％蛋白胨为初始原料，菌株初始接种量1gDCW L-1，30℃、pH 6.0(DCW，dry cell weight,细胞干重)。发酵8h后以1.125g L-1 h-1的量开始流加葡萄糖作为共碳源以持续产生还原型辅酶。发酵72小时，木糖醇体积生成 速率、木糖比消耗速率、木糖醇比生成速率分别达到1.446±0.006gxylitol L-1h-1，3.518±1.187gxylose gDCW -1h-1，和3.359±1.322gxylitol gDCW -1h-1。木糖醇得率为1.01±0.01gxylitolgxylose -1，达到理论值100％，木糖醇在发酵液中的终浓度为104g L-1。
本发明所述酿酒酵母工程菌株在综合利用木糖母液和木糖渣生产木糖醇中的应用。
其中：所述应用的方法是利用半同步糖化发酵工艺生产木糖醇；具体是：以稀释的木糖 母液和木糖渣为主要原料，在稀释的木糖母液中葡萄糖耗尽后，添加纤维素酶以使木糖渣中 的纤维素缓慢降解，释放出葡萄糖。
具体的，是以20％(v/v)木糖母液、1％酵母粉、2％蛋白胨以及55.0g L-1干重的脱木 素木糖渣为初始原料，菌株初始接种量1gDCW L-1，pH 5.5，发酵温度为30-35℃。发酵8小时后，添加10-20FPU gcellulose -1纤维素酶。优选在35℃条件下添加11.8FPU gcellulose -1纤维素酶。 该发酵条件下，转化了原料中76％的木糖，木糖醇体积生成速率分别为1.264±0.008gxylitol L-1 h-1，木糖醇得率分别为1.01±0.04gxylitol gxylose-1。木糖醇在发酵液中的终浓度为91g L-1。发 酵底物产物浓度见图4。
本发明公开的酿酒酵母工程菌株对木糖母液耐受性好，能有效发酵20％的木糖母液。木 糖转化为木糖醇的转化率高，达到理论值100％，没有木糖被作为碳源利用，高于天然利用木 糖生产木糖醇的微生物的得率。目前已报道部分基因工程酿酒酵母转化纯木糖时也能达到理 论得率，但该工程酵母是在纯木糖葡萄糖培养条件下发酵，而非在有抑制物的木质纤维素水 解液或木糖母液中[Dasgupta,D.,et al.Challenges and prospects ofxylitol production with whole cell bio-catalysis:A review.Microbiol Res,2017,197,9-21.]。而在已报道的净化木糖母液 产木糖醇的工艺中，同时利用细菌和酵母取得了较好的结果，但两种微生物需要先后发酵， 工艺复杂[Cheng,H.,et al.Xylitolproduction from xylose mother liquor:a novel strategy that combines the useof recombinant Bacillus subtilis and Candida maltosa.Microb Cell Fact,2011,10, 5.]。在本发明所述酿酒酵母工程菌株在综合利用木糖母液和木糖渣生产木糖醇的应用中，本 发明除利用玉米芯产木糖醇工艺中的木糖母液外，还同时利用另一种废弃物，即木糖渣，能 够进一步提高生产厂家的原料利用率，降低生产成本，减少环境污染。并且发酵液中木糖醇 浓度高，达到83-91g L-1，已基本具备实际产业化潜力，应用前景广阔。
附图说明
本发明所述酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌X3kZPM已于2017年6 月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区 北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.14362。
图1筛选对木糖母液耐受性高的出发菌株。
其中：(A)酿酒酵母菌株在含有20％木糖母液的YPD平板上的生长特征；(B)酿酒酵母菌株在含有25％木糖母液的YPD液体培养基中的生长特征。
图2质粒P-K-δ1δ2-XR结构。
图3分批补料发酵木糖母液产木糖醇。
其中：■,木糖；●,木糖醇；▲,葡萄糖。
图4半同步糖化脱木素木糖渣发酵木糖母液产木糖醇。
其中：(A)30℃发酵；(B)35℃发酵。
■,木糖；●,木糖醇；▲,葡萄糖。
具体实施方式
一般性说明：
木糖母液来源于木糖醇生产厂家，其主要组分是：～400g L-1木糖，～180g L-1阿拉伯糖， ～150g L-1葡萄糖，～130g L-1半乳糖，～16g L-1木糖醇，～4g L-1羟甲基糠醛，～3g L-1木质素 等化合物。如下实施例中涉及的木糖母液取自山东龙力生物科技股份有限公司。木糖渣取自 木糖醇生产线废弃产物，经碱处理[Zhao,X.,et al.Comparativestudy on chemical pretreatment methods for improving enzymatic digestibilityof crofton weed stem.Bioresour Technol,2008, 99(9),3729-36.]获得脱木素木糖渣。如下实施例中涉及的木糖渣取自山东龙力生物科技股份有 限公司，其制备的脱木素木糖渣干物料中含有～70％的纤维素。
实施例1 Cre-LoxP位点特异性重组系统以及利用该系统去除筛选标记基因
Cre-LoxP位点特异性重组系统包括两个模块。模块一是拟在酿酒酵母染色体上整合的基 因，以及筛选标记基因KanMX4表达框。其中，KanMX4表达框上下游各有一个LoxP序列， 且两个LoxP序列同向，本发明涉及到的该LoxP-KanMX4-LoxP框均克隆自质粒pUG6(GenBank:AF298793.1)。模块二是附加体质粒YEp-CH(中国发明专利申请，申请号201510747241.7)，该质粒在酿酒酵母中的筛选标记为潮霉素抗性基因hygB，以及诱导型重组 酶表达框GAL1p-Cre-CYC1t。
该系统的使用步骤是：(1)模块一转化酿酒酵母，在含有400mg L-1的G418的YPD平板上筛选转化子。(2)将质粒YEp-CH转入步骤(1)中获得的菌株中，并在含有200mg L-1潮霉素的YPD平板上筛选转化子。(3)收集步骤(2)中获得的菌株的菌体，用无菌水洗涤 两次再重悬于半乳糖培养基(2％半乳糖，1％酵母粉、2％蛋白胨)中，30℃振荡培养两小 时诱导Cre重组酶表达(重组酶表达将引起染色体上两个LoxP序列发生位点特异性重组，能 够将两个序列之间的KanMX4表达框从染色体上移除)。然后将菌液划线于YPD平板，30℃ 培养两天分离单菌落。(4)将步骤(3)中获得的单菌落分别点滴于无G418的YPD平板和 含G418的YPD平板，30℃培养两天后选择无G418抗性的菌落，通过PCR验证后得到正 确发生Cre-loxP重组的重组子。(5)将步骤(4)中所得重组子在液体YPD中转接培养5次， 然后将菌液划线于YPD平板30℃培养两天分离单菌落，将单菌落分别点滴于无潮霉素B的 YPD平板和含潮霉素B的YPD平板，30℃培养两天后选择无潮霉素B抗性的菌落，该菌落 中的细胞中质粒YEp-CH已经自然丢失。
实施例2 筛选适用于发酵木糖母液生产木糖醇的出发菌株
适用于发酵木糖母液生产木糖醇的出发菌株需要具备良好的在木糖母液中的生长能力。 野生型工业酵母具有对抑制因子更高的抗性，因此，测试了市购的几株(BSIF、RC212、6508、 GZ-4、GZ-5、NAN-27等)野生型工业酵母，将其培养后离心收集菌体，重悬于无菌水中使 菌悬液OD600＝1。对该菌悬液进行十倍梯度稀释，每个梯度取4mL点滴在20％(v/v)木糖 母液、1％酵母粉、2％蛋白胨的平板上，培养3天，观察菌落生长情况，结果显示RC212、 6508、GZ-5对木糖母液的耐受性高于其他菌株(图1A)。将RC212、6508、GZ-5培养于25％ (v/v)木糖母液、1％酵母粉、2％蛋白胨的液体培养基中，测试其生长曲线，三个菌株都 生长良好，其中6508和GZ-5更优于RC212(图1B)。
选择酿酒酵母6508菌株作为出发菌株应用于如下实施例中。
实施例3 构建木糖醇生产菌株
(1)在rDNA和逆转录转座子Ty1上的δ-sequence区域整合木糖还原酶基因XYL1，使酿酒酵母具备高效还原木糖为木糖醇的能力。
重组质粒pYMIKP-XYL1上XYL1基因在酵母组成型强启动子PGK1p控制之下，该质粒上有rDNA同源序列作为整合臂。在整合臂中HpaI位点酶切pYMIKP-XYL1将其线性化， 之后以LiAc法转化酿酒酵母6508，转化液在含400μg mL-1G418的YPD平板上得到转化子。 随机挑选的转化子转接到含有20000μg mL-1G418的YPD平板上筛选得到生长优势明显的转化子XGH2[李敏等，稳定高效表达木糖还原酶基因工业酿酒酵母的构建及木糖醇发酵的初步研究，《食品与发酵工业》，2006，32(1):1-5]。再利用Cre-LoxP位点特异性重组系统去除上述操作引入到基因组上的G418抗性基因KanMX4表达框，具体步骤见实施例2。
构建质粒P-K-δ1δ2-XR：利用引物Delta2-F和Delta2-R从6508基因组中扩增上下游的 δ-sequence的同源臂δ2，酶切后连接到质粒pUC19(GenBank:M77789.2)的SphI与ApaI酶 切位点之间，同时利用引物Delta1-F和Delta1-R从6508基因组中扩增上下游的δ-sequence 的同源臂δ1，酶切后连接到质粒pUC19的BamHI与NdeI两酶切位点之间，得到质粒pUC19-δ1δ2。利用引物LoxKan-F和LoxKan-R，从pUG6质粒(GenBank:AF298793.1)中扩 增loxp-KanMX4-loxp片段，连接到质粒pUC19-δ1δ2的ApaI与XhoI两酶切位点之间，获得 质粒P-K-δ1δ2。利用引物TEFp-F和PGKt-R，从质粒pJX1[Peng,B.,et al.Improvement ofxylose fermentation in respiratory-deficient xylose-fermenting Saccharomycescerevisiae.Metabolic Engineering,2012,14(1),9-18.]中扩增带有TEF1强启动子与PGK1终止子的来源于毕赤酵母 的木糖还原酶基因XYL1的表达框，并酶切连接到质粒P-K-δ1δ2-的BamH1和SalI的酶切位 点之间，获得的质粒命名为P-K-δ1δ2-XR(图2)。
利用限制性内切酶SphI与NdeI对P-K-δ1δ2-XR进行双酶切，回收3750bp片段，转化XGH2，在含有400mg μL-1G418的YPD固体培养基的平板上筛选获得转化子。转化子利用Cre-LoxP位点特异性重组系统去除上述操作引入到基因组上的G418抗性基因KanMX4表达框后再用上述回收的3750bp片段转化，如此重复共计3次，以增加染色体上XYL1基因的拷贝数，最终获得重组菌株X3。
(2)在XKS1位点超表达ZWF1，一方面敲除了木糖醇继续代谢需要的基因XKS1，另一方面促进菌株生产更多NADPH供应木糖还原。
使用引物T1-F和T1-R从6508基因组中扩增出DNA片段T1(532bp)，T1经过酶切后连接于质粒载体pUG6(GenBank:AF298793.1)的NdeI和BsiWI间，得到质粒pUT1。使用 引物T3-F和T3-R从6508基因组中扩增出DNA片段T3(470bp)，T3经过酶切后连接于质 粒pUT1的SpeI和SacII间，得到质粒pUT13。使用引物T2-F和T2-R从6508基因组中扩增 出DNA片段T2(498bp)，T2经过酶切后连接于质粒pUT13的NdeI和BsiWI之间，得到质 粒pUT23。使用引物ZT3-F和T3-R从6508基因组中扩增出DNA片段ZT3(485bp)；使用 引物ZWF1-F和ZWF1-R从质粒pJFE3-ZWF1[Wang,X.,et al.Identification and functional evaluation of fthereductases and dehydrogenases from Saccharomyces cerevisiae involved invanillin resistance.BMC Biotechnol,2016,16,31.]上扩增ZWF1表达框ZWF1T3(2382bp)；将 ZT3与ZWF1T3按照等摩尔比的比例配置融合PCR体系，加入引物ZWF1-R和T3-R进行融合PCR获得片段T3-ZWF1(2822bp)。片段T3-ZWF1经过酶切后连接于质粒pUT13/pUT23的 SpeI和SacII之间，得到质粒pUT13Z/pUT23Z。
用NdeI和SacII酶切pUT13Z，回收4914bp的DNA片段，转化实施例4中获得的菌株X3，在含有400mg μL-1G418的YPD固体培养基的平板上筛选获得转化子。转化子利用 Cre-LoxP位点特异性重组系统去除上述操作引入到基因组上的G418抗性基因KanMX4表达 框。用NdeI和SacII酶切pUT23Z，回收4878bp的DNA片段，转化上述操作获得的菌株， 在含有400mg μL-1G418的YPD固体培养基的平板上筛选获得转化子。转化子利用Cre-LoxP 位点特异性重组系统去除上述操作引入到基因组上的G418抗性基因KanMX4表达框，获得 的重组菌株命名为X3kZ。
(3)在GRE3位点超表达非氧化磷酸戊糖途径相关基因，使葡萄糖能更多的经由磷酸戊 糖途径代谢，从而提供更多的NADPH。
质粒pJPPP3和pJPPP4[Li,H.,et al.Engineering a wild-type diploidSaccharomyces cerevisiae strain for second-generation bioethanolproduction.Bioresour Bioprocess,2016,3(1),51.] 中含有L-核酮糖-5-磷酸4-差向异构酶基因RPE1表达框，核糖-5-磷酸异构酶基因RKI1表达 框，转醛酶基因TAL1以及转酮酶基因TKL1表达框。用限制性内切酶SmiI处理质粒pJPPP3, 回收10620bp目的片段，转化步骤(2)中获得的重组酵母X3kZ,在含有400mg μL-1G418 的YPD固体培养基的平板上筛选转化子。转化子利用Cre-LoxP位点特异性重组系统去除上 述操作引入到基因组上的G418抗性基因KanMX4表达框。用限制性内切酶SmiI处理质粒 pJPPP4,回收10610bp目的片段，转化上述步骤中获得的重组菌株，在含有400mg μL-1G418 的YPD固体培养基的平板上筛选转化子。转化子利用Cre-LoxP位点特异性重组系统去除上 述操作引入到基因组上的G418抗性基因KanMX4表达框，获得重组菌株命名为X3kZP。
(4)在剩余的GRE3位点序列整合木糖专一转运蛋白的基因MGT05196(N360F)，促进菌株对木糖的吸收。
质粒pUC19-N360F[Li,H.,et al.Engineering a wild-type diploidSaccharomyces cerevisiae strain for second-generation bioethanolproduction.Bioresour Bioprocess,2016,3(1),51.]，带有木 糖专一运输蛋白基因表达框。用SwaI酶切pUC19-N360F，回收8187bp的片段并转化X3kZP， 在含有400mg μL-1G418的YPD固体培养基的平板上筛选转化子，由此获得酿酒酵母工程菌 株，该工程菌株命名为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌X3kZPM。
上述酿酒酵母工程菌株(工程菌X3kZPM)已于2017年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，其保藏编号为CGMCC No.14362。
上述实施例中PCR所用引物序列如下表
Figure BDA0001369242700000061
Figure BDA0001369242700000071
实施例4 分批补料发酵木糖母液产木糖醇
本发明所述酿酒酵母工程菌株在利用木糖母液生产木糖醇中的应用：
发酵罐中发酵，以20％(v/v)木糖母液、1％酵母粉、2％蛋白胨为初始原料，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌X3kZPM菌株初始接种量1gDCW L-1，30℃，搅拌转速500rpm，通气量为1vvm，用浓氨水和2M HCl调pH 6.0。发酵8h后以1-2g L-1h-1的 量开始流加葡萄糖作为共碳源以持续产生还原型辅酶。优选以1.125g L-1h-1的的量流加葡萄糖发酵72小时，木糖醇体积生成速率、木糖醇得率、木糖比消耗速率、木糖醇比生成速率分别达到1.446±0.006gxylitol L-1h-1，1.01±0.01gxylitol gxylose -1，3.518±1.187gxylose gDCW -1h-1，和3.359±1.322gxylitol gDCW -1h-1。
发酵底物产物浓度见图3。
实施例5 半同步糖化脱木素木糖渣发酵木糖母液产木糖醇
所述酿酒酵母工程菌株在综合利用木糖母液和木糖渣生产木糖醇中的应用：
发酵罐中发酵，以20％(v/v)木糖母液、1％酵母粉、2％蛋白胨以及55.0g L-1干重的 脱木素木糖渣为初始原料，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)基因工程菌X3kZPM菌株 初始接种量1gDCW L-1，拌转速500rpm，通气量为1vvm，用浓氨水和2M HCl调pH 5.5， 发酵温度为30-35℃。发酵8小时后，添加10-20FPU gcellulose -1纤维素酶。优选在35℃条件下 添加11.8FPU gcellulose -1纤维素酶。该发酵条件下，转化了原料中76％的木糖，木糖醇体积生成速率分别为1.264±0.008gxylitol L-1h-1，木糖醇得率分别为1.01±0.04gxylitol gxylose -1。木糖醇 在发酵液中的终浓度为91gL-1。
发酵底物产物浓度见图4。

Claims (7)

1.一株酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述工程菌株是酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)基因工程菌X3kZPM，其是以能在含有25％木糖母液的培养基中良好生长的酿酒酵母工业菌株作为出发菌株，在其染色体上rRNA和delta区整合木糖还原酶基因XYL1；在XKS1基因座位整合超表达葡萄糖6磷酸脱氢酶基因ZWF1，在GRE3基因座位的一部分整合超表达木糖专一转运蛋白的基因突变体，该突变体是在克隆自季也蒙酵母(Meyerozymaguilliermondii)基因MGT05196的基础上，通过点突变，使其编码蛋白第360位的天冬酰胺突变为苯丙氨酸，表示为MGT05196N360F；在GRE3基因座位的剩余部分整合超表达磷酸戊糖途径非氧化还原部分的四个基因TAL1、RPE1、TKL1、RKI1获得；该菌株的基因型为：rRNA::loxP-TEF1p-XYL1-PGK1t,delta::loxP-TEF1p-XYL1-PGK1t,xks1::loxP-TEF1p-ZWF1-PGK1t,re3::TPI1p-RKI1-RKI1t-PGK1p-TAL1-TAL1t-FBA1p-TKL1-TKL1t-ADH1p-RPE1-RPE1t-loxP-TEF1p-MGT01596N360F-PGK1t；该菌株已于2017年6月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.14362。
2.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述基因XYL1克隆自树干毕赤酵母(Scheffersomyces stipitis)。
3.根据权利要求1所述的酿酒酵母工程菌株，其特征在于：所述基因ZWF1、TAL1、RPE1、TKL1或RKI1克隆自酿酒酵母。
4.权利要求1所述酿酒酵母工程菌株在利用木糖母液生产木糖醇中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述应用的方法是利用补料发酵工艺生产木糖醇，具体是：以稀释的木糖母液为主要原料，在稀释的木糖母液中葡萄糖耗尽后流加葡萄糖。
6.权利要求1所述酿酒酵母工程菌株在综合利用木糖母液和木糖渣生产木糖醇中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于：所述应用的方法是利用半同步糖化发酵工艺生产木糖醇，具体是：以稀释的木糖母液和木糖渣为主要原料，在稀释的木糖母液中葡萄糖耗尽后，添加纤维素酶以使木糖渣中的纤维素缓慢降解，释放出葡萄糖。
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