CN114317304B - 酿酒酵母产绿原酸工程菌株的构建方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了酿酒酵母产绿原酸工程菌株的构建及应用方法，通过多水平代谢工程策略首次实现了酿酒酵母以葡萄糖为碳源从头合成绿原酸，主要通过以下手段实现：比较关键酶奎尼酸脱氢酶YdiB活性，引入最佳来源的绿原酸合成途径；移除莽草酸合成路径中的限速因子来强化绿原酸合成的代谢流；通过平衡赤藓糖四磷酸E4P和磷酸烯醇式丙酮酸PEP之间的配比来增强前体供应；增加绿原酸合成途径中羟基肉桂酰‑CoA奎尼酸转移酶HQT和P450酶C3H拷贝数。本发明获得的工程菌株是迄今报道的微生物法产绿原酸的最高水平。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，涉及到一种酿酒酵母产绿原酸工程菌株的 构建及应用。
背景技术
绿原酸(Chlorogenic acid)是最重要的膳食酚酸化合物之一，常见于绿 色咖啡豆、金银花、杜仲叶等植物中，具有抗菌、抗病毒、保肝利胆、清除自 由基等药理作用，在食品和医药领域应用广泛。
目前市场的绿原酸(CGA)主要是从植物中提取的，但是，复杂的分离过程 以及植物中低含量的绿原酸和相关植物的生长速度严重阻碍了从植物中高效提 取绿原酸，被认为是能源密集型和对环境不友好且昂贵的生产方式。为了满足 不断增长的市场需求，利用合成生物学和代谢工程技术构建异源生物合成的微 生物代谢工程菌株可提供另一种可持续的生产方法。目前，使用大肠杆菌作为 底盘细胞构建的生产绿原酸微生物菌株，需要添加大量的前体咖啡酸，成本 高。而且，以葡萄糖为底物从头合成绿原酸的微生物菌株尚无报道。酿酒酵母 是食品安全菌株，与大肠杆菌等原核细胞相比，酿酒酵母具有在简单培养基中 容易生长，产物易分离纯化，酵母内质网膜环境适合P450酶表达和高效催化等 优点，因此利用酿酒酵母作为底盘细胞从葡萄糖起始合成绿原酸有明显优势， 值得进行产绿原酸的酿酒酵母代谢工程菌构建和应用。
发明内容
基于目前各种方法的缺陷，本发明首次提出了一种新型绿原酸的生产方 法，并构建了多酶共表达的酿酒酵母代谢工程菌，实现了绿原酸的高效生产。 本发明所要解决的技术问题是提供一种能以廉价底物高效生产绿原酸的重组 菌，同时本发明要解决该菌株的构建和应用的技术问题。
本发明通过多水平代谢工程策略首次实现了酿酒酵母以葡萄糖为碳源从头 合成绿原酸，主要通过以下手段实现：1.比较关键酶奎尼酸脱氢酶YdiB活 性，引入最佳来源的绿原酸合成途径；2.移除莽草酸合成路径中的限速因子来 强化绿原酸合成的代谢流，包括过表达两个DAHP合酶突变体ARO4K229L和ARO3K222L、分支酸变位酶突变体ARO7G141S以及预苯酸脱水酶PHA2；3.通过平衡 赤藓糖四磷酸E4P和磷酸烯醇式丙酮酸PEP之间的配比来增强前体供应，包括 对丙酮酸激酶PYK1进行点突变(PYK1D168N)以及过表达转酮醇酶TKL1；4.通 过过表达NADH激酶POS5增强辅助因子NADPH供应；5.增加绿原酸合成途 径中羟基肉桂酰-CoA奎尼酸转移酶HQT和P450酶C3H拷贝数。获得的酿酒酵 母代谢工程菌株YC0705摇瓶发酵可产234.8mg/L绿原酸，进一步上罐补料发 酵产量达到了806.8mg/L绿原酸(产率12.8mg/g葡萄糖)，是迄今报道的微 生物法产绿原酸的最高水平。
具体地，所述酿酒酵母产绿原酸工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
1)选取菌株和质粒：大肠杆菌DH5α用于所有质粒的构建和繁殖；以酿酒 酵母CEN.PK2-1C作为出发菌株；
2)DNA操作：所有天然启动子、基因和终止子均通过使用酿酒酵母 CEN.PK2-1C基因组DNA或可用质粒作为模板进行PCR扩增；对于密码子优化 的异源基因，使用合成片段或可用质粒进行PCR扩增；来自拟南芥的At4CL1 通过使用拟南芥cDNA作为模板进行扩增；密码子优化的三个基因AtPAL2、 AtC4H和AtATR2均来自拟南芥，从质粒pCfB2584和pCfB2767获得；两个表 达盒包括来自酿酒酵母的CYB5和密码子优化的来自拟南芥的At4CL2分别从pCfB2767和pCfB2584直接扩增；密码子优化的HaTAL和AtC3'H及其P450 还原酶基因AtATR1均来自拟南芥，从质粒pTAL和pLC-c3提供；EcYdiB和 EcaroL扩增来自大肠杆菌基因组DNA，并分别从相应的克隆载体pHQT2、 pQDH2和pQa3扩增了密码子优化的三个基因CsHQT2、PtQDH2和NcQa3；然 后，将这些候选基因、启动子或终止子克隆到辅助质粒pH1、pH2、pH3、pH4、 pH5、pH6或pUC19使用限制性连接或Gibson组装获得基因表达盒质粒；
3)菌株构建：采用CRISPR/Cas9系统，使用Cas9和gRNA表达质粒在 酿酒酵母菌株中进行基因缺失和DNA片段位点特异性整合；为了促进基因操 作，从p42H-spCas9扩增了Cas9表达盒，并将其整合到酿酒酵母CEN.PK2- 1C中的IX-1基因组位点，由此产生的菌株YT00：CEN.PK2-1C、IX1::TEFp- SpCas9-ADH2t被用作DNA整合和生物合成途径工程的宿主；然后使用 LiAc/ssDNA/PEG酵母转化法将等摩尔量的纯化线性化片段与相应的gRNA质 粒共转化到S.cerevisiae，并在补充有200μg/L G418的YPD平板上选择 转化子；使用GreenTaq Mix通过菌落PCR验证克隆；随后，这些具有正确 模块整合的克隆在YPD液体培养基中培养过夜，然后在不含抗生素的平板上划 线以环出gRNA载体。
还可以包括步骤4)，包括下列子步骤：
4.1)基于苯丙氨酸途径利用葡萄糖从头合成对香豆酸途径的构建：在 YT00菌株基础上通过引入苯丙氨酸裂解酶AtPAL2、肉桂酸羟化酶AtC4H构建了 酿酒酵母中从苯丙氨酸到香豆酸CIA的路径，标记菌株YT01；后继分别引入 P450还原酶AtATR2，并过表达酵母天然细胞色素CYB5，构建CIA到对香豆酸 p-HCA的生物合成途径，获得菌株YT02；
4.2)葡萄糖从头合成绿原酸途径的构建：在YT02菌株基础上通过整合奎 宁酸脱氢酶EcYdiB、羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶CsHQT2、对香豆酸3'-羟 化酶AtC3'H连同细胞色素P450还原酶AtATR2和4-香豆酸-CoA连接酶1 At4CL1，获得菌株YC01；
4.3)通过释放莽草酸途径中的碳通量提高绿原酸产量：在YC01菌株基础 上选择过表达ARO4K229L突变体，最大限度地增加进入SA途径的碳通量，提高 CGA产量；得到菌株YC02，YC01,△trp1::TEF1p-ARO4K229L-CYC1t，CGA产量达 51.7mg/L，比YC01提高了40％；
4.4)优化L-苯丙氨酸分支并平衡p-HCA和QA的通量提高CGA产量：通过 在YC02菌株基础上过表达Aro7G141S，构建菌株YC05，即YC02,△ho- 1::ARO7G141S-PGKp-TPIp-ARO3K222L；然后，在YC05的p-HCA生物合成途径中系统 地过表达了来自大肠杆菌的异源莽草酸激酶EcaroL、内源性苯酚酸脱水酶 PHA2，获得了菌株YC06即YC05，△ho-2::PDC1p-EcaroL、YC07即YC06、 III1::GPM1p-PHA2；然后构建单PHA2过表达的菌株YC0701，即YC05,III1:: GPM1p-PHA2；
4.5)优化莽草酸途径前体供应提高CGA产量：在YC0701菌株基础上，通 过CRISPR引导PYK11D147N体内定向诱变，所得菌株YC0702，即YC0701, PYK11::PYK11D147N；进一步过表达TKL1之后，得到菌株YC0703，即YC0702， XII5::PGK1p-TKL1；
4.6)通过再生NADPH和调整CGA合成基因的拷贝数优化绿原酸生物合成： 通过在菌株YC0703中过表达POS5，以促进细胞内NADPH的产生，从而优化CGA 生物合成，得到菌株YC0704，即YC0703,△ho-2::GPDp-POS5；通过整合CGA 生物合成途径基因AtC3H和CsHQT2提高CGA产量，得到菌株YC0705，即 YC0704,X2::ENO2p-HQT2-TPI1p-C3H。
本发明还提供所述工程菌YC0705在发酵生产绿原酸中的应用，有以下两种 应用方式：
将工程菌株YC0705接种于无机盐培养基中，于30℃、220rpm培养24 h，获得种子液；以初始菌体浓度OD660＝0.05接种于含有50mL种子培养基的 250mL三角瓶中，在30℃，220rpm摇瓶发酵，分别间隔12h、24h、48h、 72h、96h取样获得绿原酸的发酵液；无机盐液体培养基组成：25g/L葡萄 糖、15g/L(NH4)2SO4，8g/L KH2PO4，3g/L MgSO4，10mL/L微量元素溶液，12mL/L微生物母液。
或：
将工程菌株YC0705的单菌落接种到5mL基本培养基中，并在30℃、 220rpm下孵育24小时；然后将2mL的种子培养物(4％)转移到两个250 mL的烧瓶中，每个烧瓶都含有50mL新鲜的基本培养基，并再生长22小 时；将所得培养物100mL转移到含有0.5L初始OD660为0.9的基本培养 基的1-L生物反应器中，生物反应器中的发酵在30℃、300-800rpm、1 L/min的空气流速下进行，以保持DO高于40％，并通过自动添加氢氧化铵将 pH保持在5.5；当乙醇浓度降至3g/L以下时，进料处于活性状态；进料溶 液含有500g/L葡萄糖、9.0g/L KH2PO4，2.5g/L MgSO4，3.5g/L K2SO4， 0.28g/L Na2SO4、10mL/L微量元素溶液和12mL/L维生素溶液。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：
本发明首次在酿酒酵母体内构建了以葡萄糖为底物从头合成绿原酸的生物 合成途径，工程菌株YC0705能够在摇瓶中分别以234.8mg/L和1-L补料分 批发酵罐中的806.8mg/L的滴度生产绿原酸(CGA)，是迄今利用微生物法生 产绿原酸的最高报道，也为绿原酸及其衍生代谢物的生物合成建立了平台。
附图说明
图1是菌株YC0705补料分批发酵中的菌体生长OD660和产CGA过程曲线。
具体实施方式
本实施例中，酿酒酵母产绿原酸工程菌株按如下方法构建：
1、菌株和质粒
大肠杆菌DH5α用于所有质粒的构建和繁殖。本发明的出发菌株是酿酒酵 母CEN.PK2-1C(MATa；ura3-52；trp1-289；leu2-3112；his3Δ1；MAL2-8C； SUC2)。本发明使用的所有的工程菌株、质粒和基因都列在表1、表2和表3 中。其中CsHQT2(来自Cynarascolymus)、PtQDH2(来自毛果杨)、NcQa3 (来自粗糙脉孢子)和MtPDH1(来自Medicagotruncatula)是在Generay Biotech进行密码子优化和合成。Gibson组装试剂盒购自NewEngland Biolabs(Ipswich，USA)。PrimeStar DNA聚合酶、限制性内切酶和DNA连 接酶购自TaKaRa Bio(中国大连)。质粒小量制备和DNA纯化试剂盒购自 Thermo Fisher Scientific(Waltham,USA)。基因组提取试剂盒、RNA提取试 剂盒和逆转录试剂盒购自CWBIO(中国江苏)。标准品奎宁酸(QA)、对香豆酸 (p-HCA)、咖啡酸(CA)和绿原酸(CGA)购自Sigma-Aldrich(美国圣路易 斯)。以上未提及的所有化学试剂均购自生工生物(中国上海)，使用到的所有 引物在擎科引物(中国杭州)合成(见表4)。
2、DNA操作
所有天然启动子、基因和终止子均通过使用酿酒酵母CEN.PK2-1C基因组 DNA或可用质粒作为模板进行PCR扩增。对于密码子优化的异源基因，使用合 成片段(从GenerayBiotech获得)或可用质粒进行PCR扩增。At4CL1(来 自拟南芥)通过使用拟南芥cDNA作为模板进行扩增。密码子优化的三个基因 AtPAL2、AtC4H和AtATR2(均来自拟南芥)从质粒pCfB2584和pCfB2767获 得。两个表达盒包括CYB5(来自酿酒酵母)(PGK1p-CYB5-ADH1t)和密码子优 化的At4CL2(来自拟南芥)(PGK1p-At4CL2-ADH1t)分别从pCfB2767和 pCfB2584直接扩增。密码子优化的HaTAL和AtC3'H及其P4还原酶基因 AtATR1(均来自拟南芥)从质粒pTAL和pLC-c3提供。EcYdiB和EcaroL扩 增来自大肠杆菌基因组DNA，并分别从相应的克隆载体pHQT2、pQDH2和pQa3 扩增了密码子优化的三个基因CsHQT2、PtQDH2和NcQa3。然后，将这些候选 基因、启动子或终止子克隆到辅助质粒(pH1、pH2、pH3、pH4、pH5、pH6)或 pUC19使用限制性连接或Gibson组装获得基因表达盒质粒。此外，这些基因 盒被扩增并使用DNA组装方法组装成多基因途径，这些途径被整合到选定的基 因组位点，这些位点已被证明可以提供稳定和高水平的异源基因表达。所有使 用的整合盒都列在表4中。所有向导RNA(gRNA)质粒都是通过Gibson组装 构建的，使用相应的引物对与质粒pKan100-ADE2.1作为模板。向导RNA (gRNAs)是在E-CRISP网站(http://www.e-crisp.org)上设计的。本研究中 所有使用的gRNA序列和靶位点列于表5。通过重叠延伸PCR产生突变基因 ARO3K222L、ARO4K229L、ARO7G141S和PYK1D147N。为了构建p413-CsHQT2-At4CL2，两个 片段，包括来自pCfB2584的At4CL2盒(PGK1p-At4CL2-ADH1t)、来自pH3- CsHQT2的CsHQT2盒(ENO2p-CsHQT2-PGK1t)通过Gibson组装方法克隆到 p413中。为了构建pUC19-AtATR2-CYB5，四个片段，包括来自pCfB2767的 CYB5盒(PGK1p-CYB5-ADH1t)、HXT7启动子(HXT7p)、CYC1终止子(CYC1t) 和AtATR2，通过Gibson组装方法克隆到pUC19中。为了构建pUC19- EcaroL-LEU2、pUC19-ZWF1-LEU2或pUC19-PHA2-URA3，通过PCR扩增四个片 段，包括标记盒、靶基因、相应的启动子和终止子，并使用Gibson组装试剂 盒进行环化。为了构建pH5-EcYdiB-HIS3、pH3-CsHQT2-LEU2或pH4-AtC3'H- TRP1，将标记盒扩增并克隆到相应质粒(pH5-EcYdiB、pH3-CsHQT2或pH4-AtC3'H)分别使用Gibson组装方法。
3、菌株构建
采用CRISPR/Cas9系统，使用Cas9和gRNA表达质粒在酿酒酵母菌株中 进行基因缺失和DNA片段位点特异性整合(表5)。为了促进基因操作，从 p42H-spCas9扩增了Cas9表达盒，并将其整合到酿酒酵母CEN.PK2-1C中的 IX-1基因组位点，由此产生的菌株YT00(CEN.PK2-1C、IX1::TEFp-SpCas9- ADH2t)被用作DNA整合和生物合成途径工程的宿主。然后使用LiAc/ssDNA 将等摩尔量的纯化线性化片段(50-100ng/kb)与相应的gRNA质粒(～300- 500ng)共转化到S.cerevisiae/PEG方法，并在补充有200μg/L G418的 YPD平板上选择转化子。使用Green Taq Mix(Vazyme Biotech，中国南京) 通过菌落PCR验证克隆。随后，这些具有正确模块整合的克隆在YPD液体培 养基中培养过夜，然后在不含抗生素的平板上划线以环出gRNA载体。
上述操作完成后，进行下列具体步骤：
(1)比较不同来源的奎尼酸脱氢酶活性，对酿酒酵母合成绿原酸产量的影 响
根据推测CGA合成途径，为了确定酿酒酵母中绿原酸(CGA)生物合成的可 行性，将三种奎尼酸脱氢酶：来自粗糙脉孢霉的NcQa3、来自毛果杨的PtQDH2 和来自大肠杆菌的EcYdiB分别构建过表达质粒，与来自拟南芥的At4CL2和来 自朝鲜蓟的CsHQT2过表达质粒(见表2)，分别共转化野生型酵母CEN.PK2- 1C，获得目标菌株SC01、SC02和SC03(见表1)。培养基中额外添加前体物质 200mg/L咖啡酸(CA)和200mg/L奎尼酸(QA)考察三种奎尼酸脱氢酶对CGA 生产的贡献。HPLC分析表明，在未添加QA培养基中的SC01、SC02和SC03中 均检测到新化合物，该化合物的保留时间(10.7分钟)与CGA标准品的保留时 间相同。进一步进行LC-MS分析确认该新化合物为CGA。比较各菌株CGA产量 可以看出，菌株SC03(EcYdiB)产生55.3mg/L CGA，分别比SC01(CsQDH2) 的19.9mg/L CGA和SC02(NcQa3)的25.3mg/L CGA高出2.2倍和2.7倍。 本结果表明，来自大肠杆菌的奎宁酸脱氢酶EcYdiB将SA途径的DHQ流向QA的 效果最好，因此用EcYdiB人工构建酿酒酵母中CGA生物合成途径可行性相对较 高。
(2)基于苯丙氨酸途径利用葡萄糖从头合成对香豆酸途径的构建
首先，通过引入苯丙氨酸裂解酶(AtPAL2)构建了酿酒酵母中从苯丙氨酸 到香豆酸(CIA)的路径；后继分别引入肉桂酸羟化酶(AtC4H)、P450还原酶 (AtATR2)，并过表达酵母天然细胞色素b5(CYB5)，构建CIA到对香豆酸(p- HCA)的生物合成途径。所得菌株YT01(YT00,XII2::GPM1p-AtPAL2-GPDp- AtC4H)能够在培养基中产生9.9mg/L p-HCA。当细胞色素P450还原酶 (AtATR2)与酵母天然细胞色素b5(CYB5)一起过表达时，C4H的活性明显增强， 所得菌株YT02(YT01,XI3::(CYB5-PGK1p-HXT7p-AtATR2))的p-HCA滴度进一 步增加至20.7mg/L，是YT01菌株的两倍。
(3)葡萄糖从头合成绿原酸途径的构建
通过整合奎宁酸脱氢酶(EcYdiB)、羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶 (CsHQT2)、对香豆酸3'-羟化酶(AtC3'H)连同细胞色素P450还原酶(AtATR2)和4-香豆酸-CoA连接酶1(At4CL1)，获得菌株YC01(YT02， X3::GPDp-AtATR1-ENO2p-CsHQT2-TPI1p-AtC3'H-TEF1p-EcYdiB-PGK1p- At4CL1)，YC01发酵液HPLC分析表明，YT01中的p-HCA消失，并检测到新化合物，该化合物的保留时间(14.6min)与CGA标准品和SC03的保留时间相 同。为进一步确认该化合物，对YC01菌株样品的峰2物质进行了LC-MS分析， 两个明显的离子峰出现在m/z377.24(M+Na)+和355.14(M+H)+处，这与 CGA的分子量(MW＝354.31)一致。因此，我们推断YC01产生的这种新化合物 是CGA，产量则达到了36.6mg/L。
(4)通过释放莽草酸途径中的碳通量提高绿原酸产量
选择过表达ARO4K229L和ARO3K222L的两种突变体，最大限度地增加进入SA途 径的碳通量，提高CGA产量。菌株YC02(YC01,△trp1：TEF1p-ARO4K229L)中 ARO4K229L的过表达，CGA产量达51.7mg/L，比YC01提高了40％。ARO3K222L在 YC03(YC02,△ho-1:TPI1p-ARO3K222L-TPI1t)菌株中过表达获得的CGA产量为 54.5mg/L。为提高CGA生物合成途径中进入分支点DHQ的碳通量，在YC02菌 株中引入EcoroB，获得菌株YC04(YC02,△ho-1::EcaroB-PGKp-TPIp- ARO3K222L)，然而，CGA产量并没有增加。为了研究关键前体p-HCA和QA对CGA 生产的影响并确定菌株YC03中的有限前体，将200mg/L p-HCA或200mg/L QA添加到培养基中。结果发现添加p-HCA大大提高了菌株YC03的CGA产量， 达到165.5mg/L，产量水平提高了204％(P<0.01)。添加QA的CGA滴度为 54.8mg/L，对CGA生产几乎没有影响(P＝0.982)。因此，p-HCA是菌株YC03 中CGA生物合成的关键受限前体。
(5)优化L-苯丙氨酸分支并平衡p-HCA和QA的通量提高CGA产量
分支酸变位酶突变体ARO7G141S可以有效地解除L-酪氨酸的反馈抑制，并增 加分支酸向L-酪氨酸和L-苯丙氨酸分支的代谢流量。通过Aro7G141S的过表达， 菌株YC05(YC02,△ho-1::ARO7G141S-PGKp-TPIp-ARO3K222L)产生了71.8mg/L的 CGA，比菌株YC03(YC02,△ho-1::TPI1p-ARO3K222L)高32％(P<0.01)。然后， 在YC05的p-HCA生物合成途径中系统地过表达了来自大肠杆菌的异源莽草酸激 酶(EcaroL)、内源性苯酚酸脱水酶(PHA2)、分支酸合酶(ARO2)和五功能 芳香蛋白(ARO1)，获得了菌株YC06(YC05，△ho-2::PDC1p-EcaroL)、YC07(YC06、III1::GPM1p-PHA2)、YC08(YC07、XII5::GPDp-ARO2)和YC09 (YC07、ARO1p::GPDp-ARO2-ENO2p)，各菌株CGA滴度分别达到了32.2 mg/L、45.0mg/L、23.5mg/L和3.6mg/L。可见，EcaroL、ARO2和ARO1的 过表达显着降低了CGA的产生。因此，单PHA2过表达的菌株YC0701(YC05, III1::GPM1p-PHA2)产生了93.1mg/L CGA，比出发菌株YC05的CGA产量提 高了30％(P<0.01)。而且在菌株YC0701(YC05,III1::GPM1p-PHA2)中仅检测 到0.6mg/L p-HCA，表明大部分p-HCA被有效转化为CGA。
(6)优化莽草酸途径前体供应提高CGA产量
莽草酸途径由两种代谢物前体磷酸烯醇式丙酮酸(PEP)和赤藓糖-4-磷酸 (E4P)的缩合启动。E4P被认为是限制酿酒酵母进入莽草酸生物合成途径的限 速器。因此，先后将YC12菌株中转酮醇酶(TKL1)、5-磷酸核糖酮醇异构酶 (RKI1)和葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(ZWF1)过表达，菌株YC13(YC12,XII5:: PGK1p-TKL1)、YC14(YC12,XII5::RKI1-ENO2p-PGK1p-TKL1)和YC15(YC14, △aro10-2::TPIp-ZWF1)分别产生65.2mg/L、62.7mg/L和37.3mg/L。 与对照菌株YC12(61.6mg/L)相比，TKL1(菌株YC13)的过表达导致CGA产 量(65.2mg/L)略有增加。表明，在基因TKL1、RKI1和ZWF1中，只有TKL的 过表达对CGA生产有益。为进一步增加E4P供给以增强莽草酸途径，丙酮酸激 酶(PYK11)可以将大部分PEP转化为丙酮酸。因此，YC0701通过CRISPR引导 PYK11D147N体内定向诱变(减弱)。所得菌株YC0702(YC0701,PYK11::PYK11D147N) 生产CGA的滴度显著增加，达到207.2mg/L，和参考菌株YC0701相比增加了 122.6％(P<0.01)。在进一步过表达TKL1之后，菌株YC0703(YC0702， XII5::PGK1p-TKL1)产生218.1mg/L CGA，与YC0702相比略有增加。
(7)通过再生NADPH和调整CGA合成基因的拷贝数优化绿原酸生物合成
CGA生物合成需要大量NADPH作为P450酶(AtC4H和AtC3’H)催化反应的 辅助因子。过表达POS5可以增强辅因子NADPH供应，因此，通过在表现最佳的 菌株YC0703中过表达POS5，以促进细胞内NADPH的产生，从而优化CGA生物 合成。所得菌株YC0704(YC0703,△ho-2::GPDp-POS5)的CGA产量达到了220.2mg/L，比出发菌株YC0703略有增加。在增强CGA生物合成的NADPH再生 后，通过整合CGA生物合成途径基因AtC3H和CsHQT2提高CGA产量。所得菌株 YC0705(YC0704,X2::ENO2p-HQT2-TPI1p-C3H)的CGA产量达到了234.8 mg/L，比YC0704的CGA产量有一定提高。
(8)工程菌株YC0705分批补料发酵生产绿原酸
工程菌株YC0705在1-L生物反应器中进行了分批补料发酵。消耗初始葡萄 糖(25g/L)后，将碳限制策略应用于葡萄糖补充。通过调节加料速度将葡萄 糖浓度控制在0.5-7g/L。如图1所示，培养59小时后细胞密度稳步增加， OD660达到最大值54.6，而CGA产量继续增加，70.5小时后，最终达到806.8 mg/L，是微生物细胞工厂迄今以来最高的CGA滴度。
4、菌株培养方法
大肠杆菌菌株在LB培养基中培养，该培养基含有10g/L胰蛋白胨、5 g/L酵母提取物和10g/L NaCl，并在37℃下添加100μg/mL氨苄青霉 素。
酵母菌株常规YPD培养基含有10g/L酵母提取物、20g/L蛋白胨和20 g/L葡萄糖中，必要时补充200μg/ml G418和100μg/ml潮霉素。
生产p-HCA和CGA的摇瓶发酵基本培养基(15g/L(NH4)2SO4，8g/L KH2PO4，3g/LMgSO4，和25g/L葡萄糖、10mL/L微量元素溶液和12 mL/L维生素溶液)。将工程酵母菌株的单菌落挑入5mL基本培养基中，并在 30℃、220rpm下培养24小时。然后将预培养物(～1mL)接种到含有50mL 基本培养基的250mL烧瓶中，使其初始OD660为0.05，并在30℃、220 rpm下孵育72小时。必要时，在基本培养基中补充150mg/L尿嘧啶、250 mg/L亮氨酸、75mg/L色氨酸和125mg/L组氨酸。
5、本发明还提供所述工程菌YC0705在发酵生产绿原酸中的应用
1)摇瓶发酵：
酿酒酵母代谢工程菌株YC0705接种于无机盐培养基中，于30℃、220rpm 培养24h，获得种子液；以初始菌体浓度OD660≈0.05接种于含有50mL种子培 养基的250mL三角瓶中，在30℃，220rpm摇瓶发酵，分别间隔12h、24h、 48h、72h、96h取样获得绿原酸的发酵液。无机盐液体培养基组成：25g/L葡萄 糖、15g/L(NH4)2SO4，8g/L KH2PO4，3g/L MgSO4，10mL/L微量元素溶 液，12mL/L微生物母液。
2)生物反应器发酵：
YC0705的单菌落接种到5mL基本培养基中，并在30℃、220rpm下孵 育24小时。然后将2mL的种子培养物(4％)转移到两个250mL的烧瓶 中，每个烧瓶都含有50mL新鲜的基本培养基，并再生长22小时。将所得培 养物(100mL)转移到含有0.5L初始OD660为0.9的基本培养基的1-L 生物反应器(MiniBox 1L*4Parallel Bioreactor System,T&J Bio-engineering(Shanghai)Co.LTD,Shanghai,China)中.生物反应器中的发 酵在30℃、300-800rpm、1L/min的空气流速下进行，以保持DO高于 40％，并通过自动添加氢氧化铵将pH保持在5.5。当乙醇浓度降至3g/L以 下时，进料处于活性状态。进料溶液含有500g/L葡萄糖、9.0g/L KH2PO4， 2.5g/L MgSO4，3.5g/L K2SO4，0.28g/L Na2SO4、10mL/L微量元素溶液和12mL/L维生素溶液。氢氧化铵不仅用于维持设定的pH值，还用于提供氮 源。定期取样以确定OD660和CGA浓度。
3)HPLC分析方法：
为定量p-HCA、CA和CGA，将培养物样品(600μl)与等体积的无水乙醇 (100％v/v)混合，彻底涡旋，并以13500×g离心5分钟。在配备反相C18 柱(250×4.6mm，5μm；安捷伦，美国)和UV检测器的Agilent 1260 HPLC仪器上分析上清液，该仪器在30℃下操作，流速为1ml/min。流动相 是甲醇(A)在含有0.2％乙酸(B)的水中的溶液。梯度程序如下：0.00-15.00min，10-50％A in B；15.00-16.00分钟，B中50-10％A；16.00- 25.00分钟，B中含有10％A。注射体积为10μL。在308nm(15.6分钟) 处检测到p-HCA，在324nm(分别为12.7分钟和10.7分钟)处检测到CA 和CGA。CGA的质量值通过Thermo Ultimate 3000HPLC系统与配备有电喷 雾电离装置(LC-MS)的质谱仪(Thermo,ITQ-XL,USA)测量。通过将保留时 间和精确质谱与标准品进行比较来确认CGA。通过使用分光光度计测量660nm 处的光密度来监测细胞浓度。通过在12000rpm下离心2分钟获得酵母细 胞。用生物传感器分析仪SBA-40D用于葡萄糖和乙醇浓度分析。
表1本发明所使用和构建的酿酒酵母菌株
表2：本发明所使用和构建的质粒
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表3本发明所使用到的的基因序列
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表4.本发明使用到的引物、DNA片段及表达盒
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表5本发明使用到的整合位点
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Claims (2)
1.酿酒酵母产绿原酸工程菌株的构建方法，包括如下步骤：
1)选取菌株和质粒：大肠杆菌DH5α用于所有质粒的构建和繁殖；以酿酒酵母CEN .PK2-1C作为出发菌株；
2) DNA操作：所有天然启动子、基因和终止子均通过使用酿酒酵母CEN .PK2-1C基因组DNA或可用质粒作为模板进行PCR扩增；对于密码子优化的异源基因，使用合成片段或可用质粒进行PCR扩增；来自拟南芥的At4CL1通过使用拟南芥cDNA作为模板进行扩增；密码子优化的三个基因AtPAL2、AtC4H和AtATR2均来自拟南芥，从质粒pCfB2584和pCfB2767获得；两个表达盒包括来自酿酒酵母的CYB5和密码子优化的来自拟南芥的At4CL2分别从pCfB2767和pCfB2584直接扩增；密码子优化的HaTAL和AtC3 'H及其P450还原酶基因AtATR1均来自拟南芥，从质粒pTAL和pLC-c3提供；EcYdiB和EcaroL扩增来自大肠杆菌基因组DNA，并分别从相应的克隆载体pHQT2、pQDH2和pQa3扩增了密码子优化的三个基因CsHQT2、PtQDH2和NcQa3；然后，将这些候选基因、启动子或终止子克隆到辅助质粒pH1、pH2、pH3、pH4、pH5、pH6或pUC19使用限制性连接或Gibson组装获得基因表达盒质粒；
3)菌株构建：
3.1）采用CRISPR/Cas9系统，使用Cas9和gRNA表达质粒在酿酒酵母菌株中进行基因缺失和DNA片段位点特异性整合；为了促进基因操作，从p42H-spCas9扩增了Cas9表达盒，并将其整合到酿酒酵母CEN .PK2-1C中的IX-1基因组位点，由此产生的菌株YT00：CEN.PK2-1C，IX1::TEFp-SpCas9-ADH2t被用作DNA整合和生物合成途径工程的宿主；然后使用LiAc/ssDNA/PEG酵母转化法将等摩尔量的纯化线性化片段与相应的gRNA质粒共转化到酿酒酵母菌株，并在补充有200μg/L G418的YPD平板上选择转化子；使用Green Taq Mix通过菌落PCR验证克隆；随后，这些具有正确模块整合的克隆在YPD液体培养基中培养过夜，然后在不含抗生素的平板上划线以环出gRNA载体；
3.2)基于苯丙氨酸途径利用葡萄糖从头合成对香豆酸途径的构建：在YT00菌株基础上通过引入苯丙氨酸裂解酶AtPAL2、肉桂酸羟化酶AtC4H构建了酿酒酵母中从苯丙氨酸到香豆酸CIA的路径，标记菌株YT01；后继分别引入P450还原酶AtATR2，并过表达酵母天然细胞色素CYB5，构建CIA到对香豆酸p-HCA的生物合成途径，获得菌株YT02；
3.3)葡萄糖从头合成绿原酸途径的构建：在YT02菌株基础上通过整合奎宁酸脱氢酶EcYdiB、羟基肉桂酰辅酶A奎宁酸转移酶CsHQT2、对香豆酸3 '-羟化酶AtC3 'H连同细胞色素P450还原酶AtATR2和4-香豆酸-CoA连接酶1At4CL1，获得菌株YC01；
3.4)通过释放莽草酸途径中的碳通量提高绿原酸产量：在YC01菌株基础上选择过表达ARO4K229L突变体，最大限度地增加进入SA途径的碳通量，提高CGA产量；得到菌株YC02，YC01 ,△trp1::TEF1p-ARO4K229L-CYC1t，CGA产量达51 .7mg/L，比YC01提高了40％；
3.5)优化L-苯丙氨酸分支并平衡p-HCA和QA的通量提高CGA产量：通过在YC02菌株基础上过表达Aro7G141S，构建菌株YC05，即YC02 ,△ho-1::ARO7G141S-PGKp-TPIp-ARO3K222L；然后，在YC05的p-HCA生物合成途径中系统地过表达了来自大肠杆菌的异源莽草酸激酶EcaroL、内源性苯酚酸脱水酶PHA2，获得了菌株YC06即YC05，△ho-2::PDC1p-EcaroL、YC07即YC06、III1::GPM1p-PHA2；然后构建单PHA2过表达的菌株YC0701，即YC05 ,III1::GPM1p-PHA2；
3.6)优化莽草酸途径前体供应提高CGA产量：在YC0701菌株基础上，通过CRISPR引导PYK11D147N体内定向诱变，所得菌株YC0702，即YC0701 ,PYK11::PYK11D147N；进一步过表达TKL1之后，得到菌株YC0703，即YC0702，XII5::PGK1p-TKL1；
3.7)通过再生NADPH和调整CGA合成基因的拷贝数优化绿原酸生物合成：通过在菌株YC0703中过表达PO S5，以促进细胞内NADPH的产生，从而优化CGA生物合成，得到菌株YC0704，即YC0703 ,△ho-2::GPDp-POS5；通过整合CGA生物合成途径基因AtC3H和CsHQT2提高CGA产量，得到菌株YC0705，即YC0704 ,X2::ENO2p-HQT2-TPI1p-C3H，菌株YC0705即为产绿原酸酿酒酵母工程菌株。
2.如权利要求1所述的方法构建的工程菌YC0705在发酵生产绿原酸中的应用，包括下述步骤：
将工程菌株YC0705接种于无机盐培养基中，于30℃、220rpm培养24h，获得种子液；以初始菌体浓度OD660＝0 .05接种于含有50mL种子培养基的250mL三角瓶中，在30℃，220rpm摇瓶发酵，分别间隔12h、24h、48h、72h、96h取样获得绿原酸的发酵液；无机盐液体培养基组成：25g/L葡萄糖、15g/L(NH4)2SO4，8g/L KH2PO4，3g/L MgSO4，10mL/L微量元素溶液，12mL/L微生物母液。
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