CN112458035A - 一种高转化率木糖醇的菌种及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本公开涉及一种高转化率木糖醇的菌种的制备方法，(1)在木糖发酵车间，对发酵液进行检测，筛选木糖醇含量高的发酵液，所述发酵液使用酿酒酵母进行发酵；(2)从木糖醇含量最高的发酵液的发酵罐中取样，接种到木糖培养基中，选择菌落在木糖培养基平板上扩大培养，紫外线照射进行诱变；(3)将诱变后的菌株分别扩大培养并检验发酵物，选择木糖醇含量最高、副产物最少的菌种。该菌种经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.20693。
Description
技术领域
本公开涉及生物技术领域，尤其涉及一种高转化率木糖醇的菌种及其制备方法。
背景技术
农业废弃物如秸秆、皮壳、芯等粗纤维(多缩戊糖)含量丰富，但这些农业废弃物的处理方式多为废弃或焚烧，造成极大的资源浪费及环境污染。而木糖醇可由粗纤维(多缩戊糖)水解制得木糖，木糖催化加氢制得木糖醇。农业废弃物作为原料制备木糖醇,将农副产品变废为宝、保护环境、节约资源、是一条环保经济的有效途径。
木糖醇，由木糖还原生成，作为一种功能性甜味剂，糖尿病人的辅助治疗剂，具有减肥、调节肠道，改善肝功等功能，在食品工业应用广泛。
生产木糖醇的方法主要有化学加氢法和生物转化法。化学加氢法关键工序为原料→水解→中和→浓缩→脱色→离子交换→浓缩→加氢→浓缩→结晶→分离→包装，该方法生产工艺长，操作难度大，加氢工序工艺过程对设备要求极高，副产物成分复杂、提纯难、成本高，且催化加氢过程所需的镍催化剂对环境污染严重，木糖醇的收率较低。
生物转化法则是利用微生物体内的木糖还原酶，将木糖转化成木糖醇。该过程不需高温高压，反应条件温和，且工艺较简单可行，操作性可控性强。且后者不需要木糖的纯化，易于分离木糖醇，降低成本，减少污染，将逐渐成为替代化学加氢法生产的有效途径。
在我国，通过生物转化法生产木糖醇有着广泛的原料供应及应用前景，且能保护环境，使得废物资源化、无害化。可生产木糖醇的微生物总体可分三类：细菌、丝状真菌以及酵母菌，酵母的产率明显高于其他。热带假丝酵母(Candida tropicalis)具有可天然利用木糖的能力，但是由于其可致病性等不安全因素存在，以及其他可天然利用木糖生产木糖醇的微生物在代谢过程具有局限性、以及安全性并未得到认证。酿酒酵母通常不利用木糖为碳源生长，因而可以最大限度的转化而不消耗原料中的木糖。然而，酿酒酵母需要能够耐受高浓度的木糖母液中抑制物和糖产生的压力。
生物转化法也存在一些缺点，例如发酵过程中需要添加镍、葡萄糖酸钠等添加剂，扩大培养过程中培养基成本较高，导致生产成本增加。
针对以上缺点，申请人从酿酒酵母中筛选出一株不需要额外任何催化剂，而且培养基成本较低，生产操作方便，转化率高的菌株。
发明内容
本公开旨在将酿酒酵母通过分离、诱变、定向驯化而得到一株高转化率、较高底物浓度的菌株。
本公开的一个目的在于，提供一种高转化率木糖醇的菌种，
(1)在木糖发酵车间，对发酵液进行检测筛选木糖醇含量高的发酵液，所述发酵液使用酿酒酵母(Saccharomyces Cerevisiae)进行发酵；
(2)从装有木糖醇含量最高的发酵液的发酵罐中取样接种到木糖培养基中，发酵后选取菌液接种在木糖培养基平板上扩大培养，紫外线照射进行诱变；
(3)将诱变后的菌株分别扩大培养并检验发酵物，选择木糖醇含量最高、副产物最少的菌种，菌种编号为：TY-2。
在一个优选的实施方案中，所述紫外线的照射强度为90-200μW/CM2，时间为3-5分钟。
在一个优选的实施方案中，所述发酵液配方为木糖5-15质量％、葡萄糖0.5-1.5质量％、玉米浆粉0.4-1.0质量％、七水硫酸镁0.02-0.2质量％、pH 4-6。
在一个优选的实施方案中，所述木糖培养基配方：木糖5-15质量％，七水硫酸镁0.02质量％，酵母膏0.05-0.1质量％，(NH4)H2PO4 0.05-0.1质量％，KH2PO4 0.02质量％，pH5.8,灭菌。
优选地所述木糖培养基配方：木糖5质量％七水硫酸镁002质量％，酵母膏0.05质量％，(NH4)H2PO4 0.05质量％，KH2PO4 0.02质量％，pH5.8,灭菌。
在一个优选的实施方案中，所述木糖培养基平板配方：木糖5-15质量％，七水硫酸镁0.02质量％，酵母膏0.05-0.1质量％，(NH4)H2PO40.05-0.1质量％，KH2PO4 0.02质量％，pH5.8,2质量％的琼脂，灭菌。
优选地，所述木糖培养基平板配方：木糖5质量％，七水硫酸镁0.02质量％，酵母膏0.05质量％，(NH4)H2PO4 0.05质量％，KH2PO4 0.02质量％，pH5.8,2质量％的琼脂，灭菌。
在一个优选的实施方案中，所述灭菌为高压蒸汽灭菌，灭菌温度为120℃，灭菌时间为20分钟。所述高压蒸汽灭菌使用自动压力蒸汽灭菌器灭菌。
本公开还提供了一种高转化率木糖醇的菌种，根据上述的制备方法得到，所述菌种为酿酒酵母，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.20693。
本公开还提供了一种木糖醇的发酵方法，包括：以木糖作为发酵底物，将如上所述的菌种接种在发酵液中生产木糖醇。
在一个优选的实施方案中，所述发酵液配方为木糖5-15质量％、葡萄糖0.5-1.5质量％、玉米浆粉0.4-1.0质量％、七水硫酸镁0.02-0.2质量％、pH 4-6。
在一个优选的实施方案中，发酵条件为30℃，180rpm，通无菌风。
本公开发酵生产所用菌种为酿酒酵母，经过分离、诱变、定向驯化而得到一株将木糖转化为木糖醇的菌株。
本公开利用微生物中的还原酶，以粗放的木糖为底物来发酵生产木糖醇，可有效降低木糖醇生产成本，省去了木糖纯化步骤并简化了木糖醇分离步骤，简化了生产过程、安全、节能。
有益效果
本公开提供了一种高转化率木糖醇的菌种及其制备方法，在不需要额外添加辅助催化剂的情况下，使用的培养基成本较低、生产操作方便、转化率高、发酵周期缩短至60-84h以内。本公开提供的方法简单易行，成本低，能耗低、转化率相对较高，可用于工业化大规模发酵生产木糖醇。
本公开避免了传统方法中的镍催化剂的使用，保护了环境，降低了生产成本。
具体实施方式
下面结合实施方式对本公开作进一步的详细说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于解释相关内容，而非对本公开的限定。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本公开中的实施方式及实施方式中的特征可以相互组合。下面将结合实施方式来详细说明本公开。
实施例
实施例1菌株的筛选
在木糖车间发酵工段，色谱检测发现一发酵罐中发酵液发酵结束后木糖醇含量超出平常检测3倍以上，立即取样进行分离培养，木糖培养基配方：木糖10质量％，七水硫酸镁0.02质量％，酵母膏0.05质量％，(NH4)H2PO4 0.05质量％，KH2PO4 0.02质量％，pH 5.8,如制作平板培养基，再加2质量％的琼脂(自动压力蒸汽灭菌器灭菌120℃20分钟)。
将发酵罐取样，按5质量％的比例接种到木糖培养基里，30℃，180rpm震荡培养箱培养12h，取培养液在木糖培养基平板上划线，30℃生化培养箱培养3-4天，选择优质菌落接到斜面上扩大培养。再次选择斜面上优质菌落，木糖培养基扩大培养5ml试管、50ml三角瓶，分别培养12h、24h，分装到3个培养皿上，每个培养皿上平摊5ml，均匀分布，编号分别为1、2、3。
然后进行紫外线照射，分别照射时间3分钟、4分钟、5分钟，取出。将诱变后的菌液分别均匀涂布于编号为1、2、3木糖培养基平板上，30℃避光培养2～3d后挑选生长快、菌落大的单菌落点30株，分别编号为1a、1b、1c、1d、1e、1f、1g、1h、1i、1j、1k、1l、1m、1n、2a、2b、2c、2d、2e、2f、2g、2h、2i、3a、3b、3c、3d、3e、3f、3g，分别对30株菌落扩大培养，并进行发酵实验，在木糖发酵液(木糖10质量％，玉米浆粉0.7质量％，七水硫酸镁0.02质量％，pH5.8)中，30℃，180rpm发酵48h。发酵完成后使用高效液相色谱检测木糖醇含量，选择木糖醇含量高,副产物少的菌株，发现为2d、2g、3a。再次扩大培养这三瓶菌液，重新发酵，再次检测木糖醇含量，最终确定2d效果最好，将2d制作斜面保存在2～4℃冰箱，以及-80℃冰箱内，菌株编号：TY-2。该菌种经鉴定为酿酒酵母，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.20693。
实施例2发酵实验
菌种试管培养：从2-4℃冰箱中取出优选酵母斜面，挑取单菌落一株接种于装有5ml种子培养基(5％麦芽汁培养基，120℃灭菌15分钟)的试管里，于30℃生化培养箱里培养24h(每隔4-8h摇动试管2-3分钟)。
种子瓶培养：按10％接种量，将试管种子液转接至装有45ml种子培养基(5％麦芽汁培养基，120℃灭菌20分钟)的150ml三角烧瓶里培养12h(培养条件为30℃，180rpm)。
1000ml种子瓶培养：按10％接种量，将试管种子液转接至装有450ml种子培养基(组分为木糖3质量％、葡萄糖1质量％、玉米浆粉0.7质量％，七水硫酸镁0.02质量％，将pH值调至5.8,消泡剂0.005质量％，120℃灭菌20分钟)的1000ml三角烧瓶里培养12h(培养条件为30℃，180rpm)。
摇瓶发酵实验：按10％接种量，将三角瓶种子液转接至发酵培养基中，在5000ml三角瓶中配制发酵液4500ml，使发酵液中最终组分为木糖12质量％、葡萄糖1质量％、玉米浆粉0.7质量％，七水硫酸镁0.02％，将pH值调至5.8，消泡剂0.005质量％。此培养基无需高压灭菌，配制完成后可直接用于发酵。发酵条件为30℃，180rpm，通无菌风。每4h取样一次，测定酵母细胞数，酵母数达到15*107个/ml以上即可(一般12小时)。
木糖醇含量的测定：将发酵液过滤去细胞沉淀，取上清做高效液相色谱测定木糖醇含量。色谱条件为：色谱仪为岛津U3000(购自日本岛津公司)，色谱柱为铅离子交换色谱柱(购自昭和电工科学仪器上海有限公司)，色谱柱温为75℃，检测器为示差折光检测器(购自日本岛津公司)，流动相是水，流速0.6ml/min，每次进样量为20μl。
对发酵24h、48h、60h、72h、84h、96h进高效液相检测。结果如下表1所示。
表1酿酒酵母发酵过程中木糖醇的发酵性能。
如表1所示，在60-96h时，本公开的酿酒酵母的木糖转化率％达到了70.25-97.72；在发酵84h时木糖转化率％达到了97.25％，木糖醇收率达到了96.10％，木糖醇与消耗木糖比值达到了木糖醇0.99g/木糖g。表1的结果表明本公开的酿酒酵母的木糖转化率相对较高。
对比例1
热带假丝酵母菌(C.tropicalis)保藏编号为CICC1316，购自中国工业微生物菌种保藏中心。
在50L发酵罐中，初始发酵培养液定容至27L，培养液中不添加葡萄糖酸钠。培养液配方为：玉米浆5g/L、酵母粉4g/L、磷酸二氢钾8g/L、MgSO47H2O0.2g/L、尿素5g/L、木糖100g/L，以水配制。
将热带假丝酵母种液按照10％的接种量(约3L)，接入灭过菌的初始培养液中进行发酵。初始木糖含量按100g/L配制，种前先用NaOH调节初始pH值为4.5，在发酵过程中，发酵温度维持在34℃，发酵液pH值不自控。初始的无菌空气通风比为1:0.6，初始搅拌转速为400rpm，初始罐压为0.04Mpa，初始溶氧设置为100％，随着发酵的进行，溶氧开始下降，菌体浓度开始不断增加，当菌浓OD(600nm)达到20之前，控制溶氧在27％左右，当菌浓OD(600nm)达到20时，降低搅拌至150rpm，使得溶氧降低至3％左右。经分析检测，木糖到木糖醇的质量转化率可以达到82.1％。
对比例1是目前较有代表性的已公开的用于发酵木糖产木糖醇的菌种及方法。对比例1中，在无外加助剂的情况下，木糖发酵生成木糖醇的转化率在80％左右。经济价值偏低，浪费了较多原料木糖。已公开的发明中，部分发明通过添加葡萄糖酸钠、镍等来提高菌种发酵能力，但是此类方法，无形中增加了生产成本，后续净化处理时还要考虑残留在发酵液中添加物的去除。
在不需要向培养基中加入添加镍、葡萄糖酸钠等额外添加剂的情况下，本公开的酿酒酵母具有更高的木糖转化率，并且使用的培养基成本较低、生产操作方便、转化率高。
目前甚少有公开的用于发酵木糖产木糖醇的酿酒酵母。酿酒酵母在食品或食品添加剂行业有着悠久的工业化利用历史，安全性等各方面有保障。虽然热带假丝酵母(Candida tropicalis)具有可天然利用木糖的能力，但是由于其可致病性等不安全因素存在，其发酵安全性并未得到认可。
本公开对酿酒酵母进行了驯化，使其能够耐受木糖母液中高浓度的抑制物和糖产生的压力。本公开的酿酒酵母转化率高，在将木糖转化为木糖醇的过程中不需要高温高压、反应条件温和，工艺简单可行，操作性可控性强。无需添加额外的添加剂，进而不需要再将产物中的添加剂进行分离，因而易于分离木糖醇，降低了生产成本，也减少了对环境的污染。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例/方式”、“一些实施例/方式”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例/方式或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本申请的至少一个实施例/方式或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例/方式或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例/方式或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例/方式或示例以及不同实施例/方式或示例的特征进行结合和组合。
此外，术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括至少一个该特征。在本申请的描述中，“多个”的含义是至少两个，例如两个，三个等，除非另有明确具体的限定。
本领域的技术人员应当理解，上述实施方式仅仅是为了清楚地说明本公开，而并非是对本公开的范围进行限定。对于所属领域的技术人员而言，在上述公开的基础上还可以做出其它变化或变型，并且这些变化或变型仍处于本公开的范围内。
Claims (10)
1.一种高转化率木糖醇的菌种的制备方法，其特征在于，
(1)在木糖发酵车间，对发酵液进行检测，筛选木糖醇含量高的发酵液，所述发酵液使用酿酒酵母进行发酵；
(2)从装有木糖醇含量最高的发酵液的发酵罐中取样，接种到木糖培养基中，选择菌落在木糖培养基平板上扩大培养，紫外线照射进行诱变；
(3)将诱变后的菌株分别扩大培养并检验发酵物，选择木糖醇含量最高、副产物最少的菌种，菌种编号为：TY-2。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述紫外线的照射强度为90-200μW/CM2，时间为3-5分钟。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述发酵液配方为木糖5-15质量％、葡萄糖0.5-1.5质量％、玉米浆粉0.4-1.0质量％、七水硫酸镁0.02-0.2质量％、pH 4-6。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述木糖培养基配方：木糖5-15质量％，七水硫酸镁0.02-0.04质量％，酵母膏0.05-0.1质量％，(NH4)H2PO4 0.05-0.1质量％，KH2PO4 0.01-0.3质量％，pH5.8,灭菌。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述木糖培养基平板配方：木糖5-15质量％，七水硫酸镁0.02质量％，酵母膏0.05-0.1质量％，(NH4)H2PO4 0.05质量％，KH2PO40.02质量％，pH5.8,2质量％的琼脂，灭菌。
6.一种高转化率木糖醇的菌种，其特征在于，根据权利要求1-5任一项所述的制备方法得到，所述菌种为酿酒酵母，经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，编号为CGMCCNo.20693。
7.根据权利要求6所述的菌种在制备木糖醇中的用途。
8.一种木糖醇的制备方法，其特征在于，包括：以木糖为发酵底物，将权利要求6所述的菌种接种在发酵液中制备木糖醇。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述发酵液配方为木糖5-15质量％、葡萄糖0.5-1.5质量％、玉米浆粉0.4-1.0质量％、七水硫酸镁0.02-0.2质量％、pH 4-6。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，发酵条件为30℃，180rpm，通无菌风。
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