CN115181681B - 一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵技术领域，具体公开了一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用，所述微生物菌剂包括里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵母，且所述微生物菌剂中三种菌的活菌数比为1:1:1～1:4:1，此三种菌均可在厌氧、微好氧条件下生长、发酵和转化乙醇，在功能上协同增效又各有侧重，配合使用提高了生产乙醇的能力；并具体公开了利用所述微生物菌剂采用联合生物加工策略制备生物乙醇的方法，所述方法集成产酶、酶解和液体深层发酵三个过程于一个反应体系中，提高了生产效率，降低了成本；且过程中综合利用了秸秆、紫薯渣和豆粕粉中的营养物质，提高了微生物的增殖速度，降低了周期，进而提高乙醇产量及秸秆乙醇转化率。

Description

一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用。
背景技术
工业化生产生物乙醇绝大多数是以粮食作物为原料，从长远来看具有规模限制和不可持续性；采用秸秆等含木质纤维素的材料为主要原料的第二代生物乙醇是决定未来大规模替代石油的关键。我国每年约产出秸秆9亿吨，目前秸秆的主要处理方式是直接还田，直接还田易导致耕作困难和烧苗等问题，直接焚烧更是会造成环境的污染，用于发电热值利用率低；而以秸秆为原料制备生物乙醇既能解决农业废弃物的堆积又能降低生产成本。
秸秆中的木质素大约在10~20%，纤维素约30~40%，半纤维素约15~30%，5~15%的灰分（水稻秸秆中二氧化硅约为灰分的60~75%），10~15%的可溶性浸出物。通常木质素的微生物分解产物为芳香族化合物，纤维素的酶解产物是葡萄糖，半纤维的主要酶解产物为木糖，秸秆中的可利用糖类主要是降解后的葡萄糖和木糖。理论糖含量=纤维素含量/0.9+半纤维素含量/0.88，对于秸秆理论上的糖含量约为50~78%，木糖和葡萄糖的乙醇转化率理论上为51%，所以根据纤维素和半纤维素的含量，秸秆的乙醇理论转化值为25.5~39.8%。
秸秆酶解糖化前需要进行预处理，降低纤维素结晶度、增加了酶的接触位点、打破木质素和二氧化硅的保护。传统预处理方法中，物理方法能耗大、效果差，化学方法易造成二次污染。其中，联合生物加工策略（consolidated bioprocessing，CBP）集成产酶、酶解和乙醇转化过程，将三个过程结合到由微生物介导的一个反应体系中，因此与其他工艺过程相比较，底物和原料的消耗相对较低，能极大的提高生产效率、降低成本。但是CBP对所用的微生物有较高的要求，相比传统的发酵，微生物应具有更好的底物利用度和较好的产品构型。获取生物乙醇炼制CBP微生物菌株通常通过基因工程技术：一种是改造厌氧型产木质纤维素酶的菌生产乙醇，比如热纤梭菌；另一种是改造产乙醇的菌株分解纤维素，如酿酒酵母和运动发酵单胞菌。利用基因工程构建的微生物技术难度高、且容易退化，环境适应能力较差；采用自然界中已有的菌株报道较少，多数真菌通常被认定为好氧菌，虽然随着研究的不断深入，一些厌氧和兼性厌氧真菌不断的被发现和应用。例如魏亚琴等（CN106834140B一种厌氧真菌及用其发酵小麦秸秆生产乙醇的方法）采用厌氧真菌Piromyces sp .为功能菌株生产乙醇，但该菌为厌氧菌，菌株制备和发酵时需要提供严格的厌氧条件，增加了工业化的难度和成本；李国学等（CN101381680A一种利用秸秆水解物发酵生产乙醇的微生物菌剂及其应用 ）先用硫酸处理秸秆，然后利用康宁木霉（Trichoderma konigii Oudem）、水栖丝孢酵母（Trichosporon aquatile）和克鲁维酵母菌（Saccharomyces kluyveri）为功能菌株生产生物乙醇，虽采用了兼性厌氧菌发酵，但增加了酸水解处理秸秆木质素步骤，只实现了SSF（同步糖化发酵）未真正实现CBP联合生物加工策略。
发明内容
针对现有技术的缺陷，本发明的目的在于，提供一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂、制备方法及其应用，所述微生物菌剂可以通过联合生物加工策略（CBP）集成产酶、酶解和发酵过程于一个体系中，实现对秸秆木质纤维素等的高效降解，提高了生物乙醇的生产效率，降低了生产成本。
为了实现上述技术效果，本发明采用如下技术方案：
一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂，包括里氏木霉（Trichodermareesei）、裂褶菌（Schizophyllum commune）、汉逊德巴利酵母（Debaryomyces hanseni），且三种菌的活菌数比为1:1:1～1:4:1。
本发明的另一目的在于，提供上述微生物菌剂的制备方法，具体包括如下步骤：
（1）菌株活化：从-80℃保藏的甘油管中分别取裂褶菌、里氏木霉或汉逊德巴利酵母于PDA平板，25~30℃培养2~7天；
（2）种子液制备：取活化后的里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母分别接种于含PDB培养基的三角瓶或发酵罐中培养；
（3）取步骤（2）制得的里氏木霉和裂褶菌菌丝球，分别置于匀浆机中制备里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液；
（4）按比例分别取里氏木霉菌丝体悬液、裂褶菌菌丝体悬液和汉逊德巴利酵母的种子液混合得所述微生物菌剂。
优选地，步骤（2）中制得的汉逊德巴利酵母种子液中的活菌数大于3×107cfu/ml。
优选地，步骤（3）中匀浆机的转速为10000r/min，处理时间为5~10s。
优选地，步骤（3）中里氏木霉和裂褶菌菌丝体悬液中的活菌数大于1×107cfu/ml。
本发明的第三目的在于，提供上微生物菌剂制备生物乙醇的应用，具体为：将上述微生物菌剂接入含CBP培养基的三角瓶中，置于恒温摇床中进行培养；具体包括三个阶段：
（1）好氧阶段：设置恒温摇床180~220r/min，初始温度28~30℃，发酵时间24~48h；
（2）微好氧阶段：摇瓶上部加四层报纸封口，设置恒温摇床转速为50~70r/min，温度为25~28℃，发酵时间2~4d；
（3）厌氧阶段：设置恒温摇床转速0r/min，32~34℃，培养至乙醇含量不再增加，停止发酵。
具体地，所述微生物菌剂的接种量为0.5%~1.5%。
优选地，所述CBP培养基包括秸秆粉50~70g/L、紫薯渣粉5~15g/L、豆粕粉2~5g/L、碳酸钠4~6g/L和水，将各成分加水混匀并定容后，于120℃灭菌30min，降温后用磷酸调pH至6.0~6.5。
优选地，所述秸秆粉、紫薯渣、豆粕粉的粒度均为60~100目。
其中，所述紫薯渣为紫薯提取过色素和淀粉后剩余的产物，约含淀粉17~23%，半纤维素5~15%，纤维素25~40%，剩余为水分和其他如蛋白质、氨基酸及矿物质等，其含有的淀粉可被微生物分解为葡萄糖，为微生物的快速增殖提供速效碳源，另外其他营养物质可与秸秆互补，提高微生物的增殖速度，减少发酵周期。
上述发酵过程中，好氧阶段为菌体增殖和产酶阶段；主要是里氏木霉分泌淀粉酶和蛋白酶将豆粕粉和紫薯渣里的淀粉和纤维素等水解，里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵母分泌纤维素酶分解纤维素和半纤维素等，分解产物促进三种菌的生长，此阶段选用温度为里氏木霉产酶最佳温度。
微好氧阶段为产酶和生物乙醇合成阶段；随着溶氧下降，菌体繁殖变慢，转为代谢途径开始产生乙醇，此时淀粉耗尽，里氏木霉为主分泌大量的纤维素酶；裂褶菌主要分泌漆酶等分解木质素；汉逊德巴利酵母利用分解的己糖和戊糖迅速合成乙醇，减少产物对酶的抑制作用；此阶段的温度为裂褶菌生长产酶最佳温度。
厌氧阶段为随着发酵液中乙醇浓度的的增加，里氏木霉和裂褶菌的代谢受到乙醇抑制，乙醇耐受性更高的汉逊德巴利酵母继续利用剩余纤维素酶解产物发酵生物乙醇，提高乙醇含量，此阶段的温度为汉逊德巴利酵母发酵乙醇最佳温度。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
本发明选用里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵母作为秸秆生物乙醇转化功能菌株，里氏木霉主要提供纤维素酶、淀粉酶和蛋白酶；裂褶菌主要提供木质素相关酶及降解木质素；汉逊德巴利酵母主要是利用戊糖和己糖发酵乙醇，另外还能产纤维素酶降解纤维素；这三种菌均可在厌氧、微好氧条件下生长及发酵乙醇，具有产酶、乙醇发酵协同效应；
本发明所述CBP培养基中添加了紫薯渣，可为微生物的增殖提供速效碳源，且可与秸秆互补，提高微生物的增殖速度，减少发酵周期，提高乙醇产量；培养基中添加的碳酸钠可在高温灭菌时，降解部分木质素和二氧化硅等，提高后续酶解的效率，显著提高生物乙醇的产量、缩短生产周期；
本发明实现了联合生物加工策略（CBP），充分发挥了三种菌的在产酶和转化生物乙醇上的互补、协同和增效功能，成功的将产酶、酶解和发酵过程三个过程融合到一个反应体系中，缩短了工艺路径，降低了产品成本；具有一定的市场应用价值。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，本发明用以下具体实施例进行说明，但绝非仅限于此。以下所述为本发明较好的实施例，仅仅用于描述本发明，不能理解为对本发明的限制，应当指出的是在本发明的精神和原则之内所做的任何修改、等同替换和改进，均应包含在本发明的保护范围之内。
除特殊说明，下列操作均为无菌操作。
本申请所述PDA培养基和PDB培养基可采购成品或参考微生物教科书用土豆等原料制备。
本发明用到的里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母、康氏木霉、黄孢原毛平革菌、酿酒酵母均为现有菌株，可自行分离，也可通过购买获得；
具体地，下述实施例中用到的里氏木霉购自美国菌种保藏中心的里氏木霉ATCC56765；汉逊德巴利酵母为购自中国农业微生物菌种保藏管理中心的汉逊德巴利酵母ACCC 20010；康氏木霉为购自中国工业微生物菌种保藏管理中心的康氏木霉CICC13012；黄孢原毛平革菌为购自美国菌种保藏中心的黄孢原毛平革菌ATCC 24725；酿酒酵母为购自美国菌种保藏中心的酿酒酵母ATCC9763；裂褶菌为购自上海保藏生物技术中心的裂褶菌SHBCC D11505。
实施例1
1、微生物菌剂的制备
（1）菌株活化：从-80℃保藏的甘油管中分别取裂褶菌、里氏木霉、汉逊德巴利酵母于PDA平板培养基中，30℃培养3天；
（2）种子液制备：利用打孔器从生长有裂褶菌和里氏木霉的PDA平板上取菌丝块、从生长有汉逊德巴利酵母的PDA平板上取单菌落，分别接种于含PDB培养基的250ml三角瓶中，装液量为100ml，三角瓶中放置5个5mm的玻璃珠；25℃、150r/min恒温摇床培养5d；酵母菌用血球计数板计数，活菌数为4.0×107cfu/ml；
（3）分别从生长有里氏木霉和裂褶菌的三角瓶中取里氏木霉和裂褶菌的菌球，于匀浆机中，设置匀浆机的转速为10000r/min，处理时间为5s，制成里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液，用血球计数板计数分别为2.5×107cfu/ml和3.2×107cfu /ml；
（4）分别取里氏木霉菌丝体悬液、裂褶菌菌丝体悬液和汉逊德巴利酵母种子液混合，使得混合液中各菌种的活菌数比为1:1:1，得所述微生物菌剂。
2、CBP培养基的制备
分别取粒径大小为100目的小麦秸秆粉、紫薯渣粉和豆粕粉，碳酸钠加水混匀，定容至小麦秸秆粉50g/L、紫薯渣粉10g/L、豆粕粉4g/L、碳酸钠4g/L，500ml三角瓶装液量200ml，置于120℃条件下灭菌30min，降温后用磷酸调至pH为6.5。
3、生物乙醇的制备
将上述步骤1制备的微生物菌剂接入步骤2制得的CBP培养基中，接种量为0.5%；置于恒温摇床中培养，具体分以下三个培养阶段：
（1）好氧阶段：设置恒温摇床转速为200r/min，温度为28℃，发酵时间24h；此阶段为菌体增殖和产酶阶段，主要是里氏木霉分泌淀粉酶和蛋白酶将豆粕粉和紫薯渣里的淀粉水解，里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵母分泌纤维素酶分解纤维素和半纤维素等；分解产物促进三种菌的生长，用碘液验证无淀粉存在；
（2）微好氧阶段：摇瓶上部加四层报纸封口，设置恒温摇床转速为70r/min，温度为25℃，转入微好氧发酵阶段，发酵时间3d，测定乙醇含量超过0.5g/L时，转入厌氧发酵阶段；
（3）厌氧阶段：设置恒温摇床转速0r/min，摇瓶内溶氧耗尽后自动转入厌氧发酵阶段，32℃；每隔12小时检测乙醇含量，乙醇含量不再增加，停止发酵。
实施例2
1、微生物菌剂的制备
（1）菌株活化：从-80℃保藏的甘油管中分别取裂褶菌、里氏木霉、汉逊德巴利酵母于PDA平板培养基中，30℃培养3天；
（2）种子液制备：利用打孔器从生长有裂褶菌和里氏木霉的PDA平板上取菌丝块、从生长有汉逊德巴利酵母的PDA平板上取单菌落，分别接种于含PDB培养基的250ml三角瓶中，装液量为100ml，三角瓶中放置5个5mm的玻璃珠；25℃、150r/min恒温摇床培养5d；酵母菌用血球计数板计数，活菌数为3.5×107cfu/ml；
（3）分别从生长有里氏木霉和裂褶菌的三角瓶中取里氏木霉和裂褶菌的菌球，于匀浆机中，设置匀浆机的转速为10000r/min，处理时间为5s，分别制成里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液，用血球计数板计数分别为5.8×107cfu/ml和7.0×107cfu/ml；
（4）分别取里氏木霉菌丝体悬液、裂褶菌菌丝体悬液和汉逊德巴利酵母种子液混合，使得混合液中各菌种的活菌数比为1:2:1，得所述微生物菌剂。
2、CBP培养基的制备
分别取粒径大小为80目的水稻秸秆粉、紫薯渣粉和豆粕粉，碳酸钠加水混匀，定容至水稻秸秆粉60g/L、紫薯渣粉10g/L、豆粕粉5g/L、碳酸钠5g/L，置于120℃条件下灭菌30min，降温后用磷酸调至pH为6.0。
3、生物乙醇的制备
将上述步骤1制备的微生物菌剂接入步骤2制得的CBP培养基中，接种量为1.5%；置于恒温摇床中培养，具体分以下三个培养阶段：
（1）好氧阶段：设置恒温摇床转速为220r/min，温度为30℃，发酵时间30h；此阶段为菌体增殖和产酶阶段，主要是里氏木霉分泌淀粉酶和蛋白酶将豆粕粉和紫薯渣里的淀粉水解，里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵母分泌纤维素酶分解纤维素和半纤维素等；分解产物促进三种菌的生长，用碘液验证无淀粉存在；
（2）微好氧阶段：摇瓶上部加四层报纸封口，设置恒温摇床转速为60r/min，温度为27℃，转入微好氧发酵阶段，发酵时间4d，测定乙醇含量超过0.5g/L时，转入厌氧发酵阶段；
（3）厌氧阶段：设置恒温摇床转速0r/min，摇瓶内溶氧耗尽后自动转入厌氧发酵阶段，33℃；每隔12小时检测乙醇含量，乙醇含量不再增加，停止发酵。
实施例3
1、微生物菌剂的制备
（1）菌株活化：从-80℃保藏的甘油管中分别取裂褶菌、里氏木霉、汉逊德巴利酵母于PDA平板培养基中，25℃培养5天；
（2）种子液制备：利用打孔器从生长有裂褶菌和里氏木霉的PDA平板上取5~10mm的菌块、从生长有汉逊德巴利酵母的PDA平板上取三个单菌落，分别接种于含PDB培养基的250ml三角瓶中，装液量为100ml，三角瓶中放置5个5mm的玻璃珠；25℃、150r/min恒温摇床培养5d；酵母菌用血球计数板计数，活菌数为6.5×107cfu/ml；
（3）分别从生长有里氏木霉和裂褶菌的三角瓶中取里氏木霉和裂褶菌的菌球，于匀浆机中，设置匀浆机的转速为10000r/min，处理时间为10s，分别制成里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液，用血球计数板计数分别为3.2×107cfu/ml和5.0×107cfu/ml；
（4）分别取里氏木霉菌丝体悬液、裂褶菌菌丝体悬液和汉逊德巴利酵母种子液混合，使得混合液中各菌种的活菌数比为1:3:1，得所述微生物菌剂。
2、CBP培养基的制备
分别取粒径大小为60目的水稻秸秆粉、紫薯渣粉和豆粕粉，碳酸钠加水混匀，定容至水稻秸秆粉60g/L、紫薯渣粉10g/L、豆粕粉2g/L、碳酸钠5g/L，置于120℃条件下灭菌30min，降温后用磷酸调至pH为6.5。
3、生物乙醇的制备
将上述步骤1制备的微生物菌剂接入步骤2制得的CBP培养基中，接种量为1%；置于恒温摇床中培养，具体分以下三个培养阶段：
（1）好氧阶段：设置恒温摇床转速为180r/min，初始温度29℃，发酵时间36h；此阶段为菌体增殖和产酶阶段，主要是里氏木霉分泌淀粉酶和蛋白酶将豆粕粉和紫薯渣里的淀粉水解，里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵母分泌纤维素酶分解纤维素和半纤维素等；分解产物促进三种菌的生长，用碘液验证无淀粉存在；
（2）微好氧阶段：摇瓶上部加四层报纸封口，设置恒温摇床转速为50r/min，温度为25℃，转入微好氧发酵阶段，发酵时间2d，测定乙醇含量超过0.5g/L时，转入厌氧发酵阶段；
（3）厌氧阶段：设置恒温摇床转速0r/min，摇瓶内溶氧耗尽后自动转入厌氧发酵阶段，32℃；每隔12小时检测乙醇含量，乙醇含量不再增加，停止发酵。
实施例4
1、微生物菌剂的制备
（1）菌株活化：从-80℃保藏的甘油管中分别取裂褶菌、里氏木霉、汉逊德巴利酵母于PDA平板培养基中，30℃培养3天；
（2）种子液制备：利用打孔器从生长有裂褶菌和里氏木霉的PDA平板上取菌丝块、从生长有汉逊德巴利酵母的PDA平板上取单菌落，分别接种于含PDB培养基的250ml三角瓶中，装液量为100ml，三角瓶中放置5个5mm的玻璃珠；25℃、150r/min恒温摇床培养5d；酵母菌用血球计数板计数，活菌数为9.0×107cfu/ml；
（3）分别从生长有里氏木霉和裂褶菌的三角瓶中取里氏木霉和裂褶菌的菌球，于匀浆机中，设置匀浆机的转速为10000r/min，处理时间为5s，制得里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液，用血球计数板计数分别为7.0×107cfu/ml和8.2×107cfu/ml；
（4）分别取里氏木霉菌丝体悬液、裂褶菌菌丝体悬液和汉逊德巴利酵母种子液混合，使得混合液中各菌种的活菌数比为1:4:1，得所述微生物菌剂。
2、CBP培养基的制备
分别取粒径大小为80目的小麦秸秆粉、紫薯渣粉和豆粕粉，碳酸钠加水混匀，定容至小麦秸秆粉70g/L、紫薯渣粉10g/L、豆粕粉5g/L、碳酸钠6g/L，置于120℃条件下灭菌30min，降温后用磷酸调至pH为6.0。
3、生物乙醇的制备
将上述步骤1制备的微生物菌剂接入步骤2制得的CBP培养基中，接种量为1.5%；置于恒温摇床中培养，具体分以下三个培养阶段：
（1）好氧阶段：设置恒温摇床转速为220r/min，温度为29℃，发酵时间24h；此阶段为菌体增殖和产酶阶段，主要是里氏木霉分泌淀粉酶和蛋白酶将豆粕粉和紫薯渣里的淀粉水解，里氏木霉、裂褶菌和汉逊德巴利酵母分泌纤维素酶分解纤维素和半纤维素等；分解产物促进三种菌的生长，用碘液验证无淀粉存在；
（2）微好氧阶段：摇瓶上部加四层报纸封口，设置恒温摇床转速为60r/min，温度为28℃，转入微好氧发酵阶段，发酵时间2d，测定乙醇含量超过0.5g/L时，转入厌氧发酵阶段；
（3）厌氧阶段：设置恒温摇床转速0r/min，摇瓶内溶氧耗尽后自动转入厌氧发酵阶段，34℃；每隔12小时检测乙醇含量，乙醇含量不再增加，停止发酵。
对比例1
同实施例3，区别在于，微生物菌剂为里氏木霉。
对比例2
同实施例3，区别在于，微生物菌剂为裂褶菌。
对比例3
同实施例3，区别在于，微生物菌剂为汉逊德巴利酵母。
对比例4
同实施例3，区别在于，微生物菌剂中用康氏木霉代替里氏木霉。
对比例5
同实施例3，区别在于，微生物菌剂中用黄孢原毛平革菌代替裂褶菌。
对比例6
同实施例3，区别在于，微生物菌剂中用酿酒酵母代替汉逊德巴利酵母。
试验例1 乙醇含量的测定
乙醇含量测定采用以下方法进行：
将上述实施例1~4及对比例1~6制备的发酵后的菌液离心10000r/min×10min后，取上清用0.2μm的滤膜过滤得滤液备用，参考GB 5009.225—2016食品安全国家标准 酒中乙醇浓度的测定中的气相色谱法对滤液中的乙醇含量进行检测、记录发酵周期并计算秸秆乙醇转化率；
色谱条件：气相色谱仪（AOC-20I，GC-2010,E），配 FID检测器（日本，岛津公司），气相色谱条件 KB-WAX色谱柱（30m×0.32mm×0.25μm）；程序升温：初始温度60℃，保持1min，以10℃/min升到200℃，保持1min；气化室温度：190℃；检测器温度：240℃；气体流量：载气（N2）1 mL/min、氢气30 mL/min、空气300 mL/min、补偿气（N2）30 mL/min；进样量为1μL。
秸秆乙醇转化率公式为：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
其中，乙醇含量为发酵结束测定值，单位为g/L；秸秆粉添加量为CBP培养基中秸秆粉的含量，单位为g/L。
测定结果如表1所示：
表1 不同微生物菌剂对乙醇转化的影响
Figure 57873DEST_PATH_IMAGE002
上表中三种菌株单独使用时的用量与三种菌株混合使用时的总量相等；由上表中数据可知，对比例1~6制得的发酵产物中乙醇含量均低于8.5g/L，秸秆乙醇转化率均低于14%，而采用本申请所述微生物菌剂，且三种菌株活菌数比在1:1:1~1:4:1范围内，其发酵产物中的乙醇含量均能达到10g/L以上，秸秆乙醇转化率达16.8%~18.5%，且在此范围内各微生物菌剂之间的乙醇产量无显著性差异，说明采用本申请所述的三种菌株按照所述比例配合使用具有协同增效作用。
试验例2 测定紫薯渣的添加量对乙醇转化的影响
根据实施例3所述的方法，调整实施例3步骤2中CBP培养基中紫薯渣的添加量，测定紫薯渣添加量对乙醇产量、秸秆乙醇转化率及发酵周期的影响；测定结果如表2所示；
表2紫薯渣添加量对乙醇转化的影响
Figure DEST_PATH_IMAGE003
由表2中结果可知，紫薯渣在15g/L时，乙醇产量达到最高11.2g/L，但考虑到成本和发酵周期等因素，选择紫薯渣10g/L作为最佳的添加比例；紫薯渣作为一种营养补充剂，用于好氧阶段提供菌体繁殖，添加量过多会导致菌体生长过度，好氧发酵时产生其他副产物，另外过多紫薯渣在微好氧和厌氧发酵时会成为转化乙醇的底物，相应提高成本。
以上所述实施例仅表达了本申请的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本申请保护范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请技术方案构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。

Claims (8)

1.一种用于制备生物乙醇的微生物菌剂，其特征在于，包括里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母，且三种菌的活菌数比为1:1:1～1:4:1。
2.权利要求1所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
（1）菌株活化：从-80℃保藏的甘油管中分别取里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母接种于PDA平板中培养；
（2）种子液制备：取活化后的里氏木霉、裂褶菌、汉逊德巴利酵母分别接种于含PDB培养基的三角瓶或发酵罐中培养；
（3）取步骤（2）制得的里氏木霉和裂褶菌菌丝球，分别置于匀浆机中制备里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液；
（4）按比例分别取里氏木霉菌丝体悬液、裂褶菌菌丝体悬液和汉逊德巴利酵母的种子液混合得所述微生物菌剂。
3.根据权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）中制得的汉逊德巴利酵母种子液中的活菌数大于3×107cfu/ml。
4.根据权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中匀浆机的转速为10000r/min，处理时间为5~10s。
5.根据权利要求2所述的微生物菌剂的制备方法，其特征在于，步骤（3）中里氏木霉菌丝体悬液和裂褶菌菌丝体悬液中的活菌数均大于1×107cfu/ml。
6.权利要求1所述微生物菌剂的应用，其特征在于，利用所述微生物菌剂采用联合生物加工策略制备生物乙醇，具体为将所述微生物菌剂接入含CBP培养基的三角瓶中，置于恒温摇床中进行发酵；
所述CBP培养基包括秸秆粉50~70g/L、紫薯渣粉5~15g/L、豆粕粉2~5g/L、碳酸钠4~6g/L和水，灭菌后，用磷酸调节pH至6.0~6.5；
所述发酵过程具体包括三个阶段：a.好氧阶段：设置恒温摇床转速为180~220r/min，温度为28~30℃，发酵时间24~48h；
b.微好氧阶段：摇瓶上部加四层报纸封口，设置恒温摇床转速50~70r/min，温度为25~28℃，发酵时间2~4d；
c.厌氧阶段：设置恒温摇床转速0r/min，温度为32~34℃，培养至乙醇含量不再增加，停止发酵。
7.根据权利要求6所述的微生物菌剂的应用，其特征在于，所述秸秆粉、紫薯渣粉和豆粕粉的粒径为过60~100目筛。
8.根据权利要求6所述的微生物菌剂的应用，其特征在于，所述微生物菌剂的接种量为0.5%~1.5%。
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Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929543A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 国家电网公司 一种利用多菌种混合发酵秸秆生产燃料乙醇的方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009043012A1 (en) * 2007-09-27 2009-04-02 Mascoma Corporation Progressive fermentation of lignocellulosis biomass
JP2011521669A (ja) * 2008-06-02 2011-07-28 クレシー，ウッド ド バイオ燃料、バイオディーゼルおよび他の有用化学物質用の脂肪酸を生成する方法
CN101381680B (zh) * 2008-10-15 2010-06-30 中国农业大学 一种利用秸秆水解物发酵生产乙醇的微生物菌剂及其应用
CN103060418A (zh) * 2012-12-06 2013-04-24 南昌大学 一种构建混合菌体系发酵稻草秸秆生产乙醇的方法
CN106834140B (zh) * 2017-03-16 2019-05-03 甘肃省科学院生物研究所 一种厌氧真菌及用其发酵小麦秸秆生产乙醇的方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106929543A (zh) * 2015-12-31 2017-07-07 国家电网公司 一种利用多菌种混合发酵秸秆生产燃料乙醇的方法

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Denomination of invention: A microbial agent, preparation method, and application for preparing bioethanol

Effective date of registration: 20231026

Granted publication date: 20230131

Pledgee: Tai'an Daiyue Rural Commercial Bank Co.,Ltd.

Pledgor: SHANDONG PENGBO BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd.

Registration number: Y2023980062858