CN112725386B - 一种同步糖化发酵生产l-乳酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种同步糖化发酵生产L‑乳酸的方法，是以木质纤维素为原料，在粪肠球菌DLY‑LFYC种子液、纤维素酶存在下，在酶解条件下进行同步糖化发酵。本发明利用新分离筛选的粪肠球菌DLY‑LFYC能够在较高温度下进行同步糖化发酵，发酵产L‑乳酸的浓度和光学纯度较高，特别是菌株可以利用纤维二糖，反馈抑制作用较小，提高了乳酸发酵效果。
Description
技术领域
本发明属于生物化工领域，具体涉及一株同步糖化发酵生产L-乳酸的方法。
背景技术
乳酸，是世界上公认的三大有机酸之一，具有旋光异构体，分为D-乳酸、L-乳酸和DL-乳酸，其中L-乳酸为左旋型乳酸，是人体唯一可以分解利用的乳酸类型。L-乳酸在食品、医药、农业、化妆品等众多领域有着广泛的应用，特别是高光学纯度的L-乳酸，因其可作为生物降解材料L-聚乳酸的前体，市场需求量巨大。据估计，食品级L-乳酸的需求量以每年5%-8%的速率增长，远远超出了目前的供给能力。
目前，大部分乳酸的生产是通过微生物发酵制备的。传统的生物发酵法制备L-乳酸是以粮食基淀粉为原材料，经糖化降解为葡萄糖，被菌种利用发酵制备L-乳酸。原材料的成本占到了L-乳酸发酵成本的70%，且以粮食为原材料发酵制备化学品，存在与人争粮的问题，缺乏发展潜力。因此，寻找廉价碳源高效发酵生产L-乳酸是生物法制备L-乳酸技术的研究热点之一。
利用廉价的木质纤维素作为原料发酵制备L-乳酸可以有效降低L-乳酸的生产成本。每年，地球上会产生大量的木质纤维素质废料如秸秆、纤维废渣、废纸等，因其含量丰富、廉价、可再生等优点成为发酵生产L-乳酸的研究方向。木质纤维素中含有大量的纤维素，可被酶解生成纤维二糖和葡萄糖，作为L-乳酸发酵的碳源。木质纤维素在作为碳源之前需要进行预处理和酶解糖化。纤维素原料的预处理成本较高，纤维素酶的成本占生物质转化成本的60%左右，因此在发酵过程中要不断提高纤维素酶的酶解效率，并减少纤维素酶的用量，从而降低发酵成本。一般纤维素酶制剂是酶的混合物，是能够水解纤维素生成纤维二糖和葡萄糖的一组酶的总称，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶以及β-葡萄糖苷酶等。纤维素酶糖化产物葡萄糖和纤维二糖的积累会抑制纤维素酶的活力，因此生物质转化过程通常采用同步糖化发酵，即将纤维素酶和发酵菌种同时加入反应器，降低糖化产物的抑制作用。但是，同步糖化发酵的缺点是，纤维素酶的最适酶解温度和菌种发酵温度不一致，纤维素酶制剂水解的最适温度在45-50℃，而大多数产L-乳酸的微生物的最适温度低于45℃，因此温度的差异造成水解和发酵不能同时达到最佳状态，降低了酶解效率，增加了纤维素酶的用量，提高了成本。因此，采用能够高温发酵产L-乳酸的菌株，有利于减少酶的用量，降低发酵成本。此外，大多数产L-乳酸的菌株不能利用纤维二糖，纤维二糖的累积会抑制纤维素酶的酶活，因此通常需要在纤维素酶制剂中复配β-葡萄糖苷酶，水解纤维二糖为葡萄糖，减少纤维二糖的累积，降低产物抑制作用，这同样会增加酶的用量，提高发酵成本。
发酵法生产乳酸常用的菌种为米根霉、乳酸菌、乳杆菌等。米根霉在氧气充足的条件下，直接利用淀粉质原料生产L-乳酸，但其理论转化率较低，生产速率下降较快。大部分乳酸菌发酵产物为L-乳酸和D-乳酸的混合物，对糖和乳酸的耐受性较差。乳杆菌发酵的产物L-乳酸中往往会含有较多的D型或DL型乳酸，造成乳酸的光学纯度较低，给后续分离带来困难。通过对发酵工艺的改进可以提高乳酸的产量，降低发酵成本。
李秀康等（产高光学纯度L-乳酸菌株HY-38发酵培养基优化,中国酿造, 2017, 36(02)）以粪肠球菌HY-38为出发菌株进行培养基的优化，L-乳酸的产量提高了24.3%。姜旭等（基因工程菌发酵生产L-乳酸研究进展,生物工程学报, 2013, 29(10)）综述了基因工程菌在L-乳酸发酵生产中的应用。虽然基因工程在微生物菌种改造方面取得了很多成功，但是目前很多微生物菌种在工业环境下的适应能力、胁迫抗性和代谢能力方面还远不能满足实际应用。
CN106834368A公开了一种利用木质纤维素发酵生产L-乳酸的方法，采用的菌株为凝结芽孢杆菌。该方法不能解除酶解产物纤维二糖的反馈抑制作用。
CN101736042A公开了一种利用农作物秸秆水解糖液发酵生产L-乳酸的方法，采用的菌种为米根霉。该工艺中发酵与酶解不能同步进行，发酵温度为32℃-34℃，温度较低，容易染菌，且无法解决酶解产物的反馈抑制问题。
因此，在现有的L-乳酸发酵技术中存在菌株发酵温度低，同步糖化发酵效率不高，酶解产物的反馈抑制作用造成酶用量的增多等问题，造成生产成本的升高。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种同步糖化发酵生产L-乳酸的方法。本发明以木质纤维素为原料，利用新分离筛选的粪肠球菌DLY-LFYC能够在较高温度下进行同步糖化发酵，发酵产L-乳酸的浓度和光学纯度较高，特别是菌株可以利用纤维二糖，反馈抑制作用较小，提高了乳酸发酵效果。
本发明提供的同步糖化发酵生产L-乳酸的方法，包括以下步骤：
（1）将木质纤维素原料进行预处理，固液分离得到残渣Ⅰ和液体Ⅱ；
（2）制备粪肠球菌DLY-LFYC种子液，所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）DLY-LFYC的保藏编号为CGMCC No. 15821；
（3）将粪肠球菌DLY-LFYC种子液、残渣Ⅰ、纤维素酶以及不加糖的MRS培养基加入发酵罐，在酶解条件下进行同步糖化发酵，同时流加步骤（1）液体Ⅱ，直至发酵结束。
本发明中，步骤（1）所述的木质纤维素原料包括一切含纤维素的原料，如秸秆、木屑和农林废弃物等中至少一种，优选玉米秸秆。
本发明中，步骤（1）所述的预处理是将木质纤维素原料机械粉碎到粒径为0.1-50mm，优选为2-10mm，然后加入质量浓度为1%-5%碱液，所述碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2、氨水等中的至少一种；控制固液质量比为1:5-1:10，随后在105-125℃处理5-30min，经固液分离得到残渣Ⅰ和液体Ⅱ。
本发明中，步骤（2）所述的粪肠球菌（Enterococcus faecalis）DLY-LFYC，已经于2018年5月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo. 15821。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明中，步骤（2）粪肠球菌发酵种子液的制备采用MRS培养基。具体制备方法为：将甘油保藏菌接种至试管进行培养，在45-50℃静置培养12-24h，得到一级种子液；随后接入摇瓶进行扩大培养，接种量为5%-20%，在45-50℃静置培养8-12h，得到二级种子液。
本发明中，步骤（3）粪肠球菌DLY-LFYC种子液的加入量为发酵液体积的5%-20%。
本发明中，步骤（3）残渣Ⅰ的加入量根据发酵培养基中纤维素的浓度确定，最终使发酵培养液中纤维素的浓度为70g/L-170g/L。残渣Ⅰ可以一次性加入，也可以分批次流加。
本发明中，步骤（3）所述的纤维素酶为本领域常规使用的纤维素酶，主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶等，纤维素酶的加入量为2-10FPIU/g纤维素。
本发明中，步骤（3）所述的酶解条件为温度为45-50℃，pH为4.5-6.5，搅拌转速为200-400rpm，发酵时间为72-168h。
本发明中，步骤（3）通过pH控制步骤（1）液体Ⅱ的流加，使pH为4.5-6.5。随着发酵的进行，液体Ⅱ不满足要求，可以流加碱液控制发酵，所述的碱液可以是NaOH溶液、KOH溶液、Ca(OH)2溶液、氨水等中的至少一种。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明以木质纤维素为原料，利用新分离筛选的粪肠球菌DLY-LFYC能够在较高温度下进行同步糖化发酵，发酵产L-乳酸的浓度和光学纯度较高，特别是菌株可以同时以葡萄糖、纤维二糖为底物，在同步糖化发酵过程中，酶解底物的反馈抑制作用较小，不需要额外添加β-葡萄糖苷酶，提高了乳酸发酵效果。
（2）本发明菌株可以在较高温度下进行同步糖化发酵，与纤维素酶的最适温度基本重合，在此条件下，纤维素酶的活性较高，有利于减少酶的用量，降低发酵成本。
（3）本发明采用木质纤维素作为底物发酵生产L-乳酸，原料成本低廉，降低了生物法生产L-乳酸的成本。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明作进一步的详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
本发明实施例采用HPLC测定L-乳酸和D-乳酸浓度，采用色谱柱Chirex 3126(D)-penicillamine (250mm×4.6mm)，流动相：V(异丙醇):V(2mM硫酸铜溶液)=5:95，紫外检测器。色谱条件为：流速0.7mL/min，柱温40℃，紫外检测波长254nm，进样量5μL。L-乳酸的光学纯度计算公式为：L-乳酸光学纯度=（L-乳酸浓度-D-乳酸浓度）/（L-乳酸浓度+D-乳酸浓度）×100%。
本发明中，MRS培养基的配方为：蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸氢二铵2g/L，葡萄糖20g/L，吐温80 1mL/L，乙酸钠5g/L，磷酸氢二钾2g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L。
实施例1
（1）取玉米秸秆1kg，粉碎成5mm左右的颗粒，加入质量浓度为1%的NaOH溶液5kg，在105℃条件下处理10min，通过压滤进行固液分离，得到玉米秸秆残渣Ⅰ和液体Ⅱ。
（2）粪肠球菌发酵种子液制备：在试管中加入15mL MRS培养基，将甘油保藏管中的粪肠球菌接种至试管培养基中，在45℃静置培养20h，得到一级种子液；在250mL摇瓶中加入135mL MRS培养基，接入15mL一级种子液，在45℃静置培养8h，得到二级种子液。
（3）在2.5L发酵罐中加入1.5L 不加糖MRS培养基，加入玉米秸秆残渣Ⅰ，使发酵液中纤维素浓度为70g/L，按5FPIU/g纤维素的浓度加入纤维素酶（Celluclast 1.5L，购自Sigma公司），同时加入二级种子液150mL，在温度为45℃，搅拌速度200rpm，不通气，控制pH为4.5进行同步糖化发酵。发酵过程中流加液体Ⅱ，控制发酵pH为4.5，如果液体Ⅱ不足采用NaOH溶液代替，发酵培养96h。
发酵结束后，取发酵体系中的清液，测定L-乳酸浓度，计算乳酸得率和光学纯度。共进行3次重复实验，L-乳酸浓度达到69.3g/L，光学纯度为99.9%，L-乳酸得率为0.99g/g纤维素。
实施例2
（1）取玉米秸秆2kg，粉碎成4mm左右的颗粒，加入质量浓度为2%的NaOH溶液10kg，在105℃条件下处理10min，通过压滤进行固液分离，得到玉米秸秆残渣Ⅰ和液体Ⅱ。
（2）粪肠球菌发酵种子液制备：在试管中加入35mL MRS培养基，将甘油保藏管中的粪肠球菌接种至试管培养基中，在50℃静置培养20h，得到一级种子液；在500mL摇瓶中加入315mL MRS培养基，接入35mL一级种子液，在50℃静置培养8h，得到二级种子液。
（3）在5L发酵罐中加入3.5L 不加糖MRS培养基，加入玉米秸秆残渣Ⅰ，使发酵液中纤维素浓度为170g/L，按10FPIU/g纤维素的浓度加入纤维素酶（Celluclast 1.5L，购自Sigma公司），同时加入二级种子液350mL，在温度为50℃，搅拌速度200rpm，不通气，控制pH为6.5进行同步糖化发酵。发酵过程中流加液体Ⅱ，控制发酵pH为6.5，如果液体Ⅱ不足采用NaOH溶液代替，发酵培养144h。
发酵结束后，取发酵体系中的清液，测定L-乳酸浓度，计算乳酸得率和光学纯度。共进行3次重复实验，L-乳酸浓度达到151.5g/L，光学纯度为99.8%，L-乳酸得率为0.89g/g纤维素。
实施例3
（1）取玉米秸秆1.5kg，粉碎成2mm左右的颗粒，加入质量浓度为2%的NaOH溶液10kg，在105℃条件下处理10min，通过压滤进行固液分离，得到玉米秸秆残渣Ⅰ和液体Ⅱ。
（2）粪肠球菌发酵种子液制备：在试管中加入35mL MRS培养基，将甘油保藏管中的粪肠球菌接种至试管培养基中，在50℃静置培养20h，得到一级种子液；在500mL摇瓶中加入315mL MRS培养基，接入35mL一级种子液，在50℃静置培养8h，得到二级种子液。
（3）在5L发酵罐中加入3.5L 不加糖MRS培养基，加入玉米秸秆残渣Ⅰ，使培养基中纤维素浓度为120g/L，按2FPIU/g纤维素的浓度加入纤维素酶（Celluclast 1.5L，购自Sigma公司），同时加入二级种子液350mL，在温度为50℃，搅拌速度200rpm，不通气，控制pH为5.0进行同步糖化发酵。发酵过程中流加液体Ⅱ，控制发酵pH为5.0，如果液体Ⅱ不足采用NaOH溶液代替，发酵培养144h。
发酵结束后，取发酵体系中的清液，测定L-乳酸浓度，计算乳酸得率和光学纯度。共进行3次重复实验，L-乳酸浓度达到105.3g/L，光学纯度为99.8%，L-乳酸得率为0.88g/g纤维素。
实施例4
同实施例2，不同在于：作为底物的玉米秸秆残渣Ⅰ分5个批次流加至发酵体系中，使体系中纤维素的总浓度为170g/L，纤维素酶与底物混匀后加入。发酵共进行3次重复实验，经检测和计算，L-乳酸的浓度达到164.9g/L，光学纯度为99.7%，L-乳酸得率为0.97g/g纤维素。
实施例5
同实施例1，不同在于：木质纤维素原料采用木屑。发酵共进行3次重复实验，经检测和计算，L-乳酸的浓度达到67.9g/L，光学纯度为99.7%，L-乳酸得率为0.97g/g纤维素。
实施例6
同实施例1，不同在于：纤维素酶采用诺维信的Ctec2酶。发酵共进行3次重复实验，经检测和计算，L-乳酸的浓度达到66.5g/L，光学纯度为99.5%，L-乳酸得率为0.95g/g纤维素。
实施例7
同实施例1，不同在于：预处理碱采用氨水。发酵共进行3次重复实验，经检测和计算，L-乳酸的浓度达到65.1g/L，光学纯度为99.4%，L-乳酸得率为0.93g/g纤维素。
比较例1
同实施例1，不同在于：采用粪肠球菌CICC20423（购买于中国微生物菌种保藏管理中心）进行发酵实验。发酵共进行3次重复实验，经检测和计算，L-乳酸的浓度达到38.5g/L，光学纯度为99.1%，L-乳酸得率为0.55g/g纤维素。
比较例2
同实施例1，不同在于：同步糖化发酵温度为40℃。发酵共进行3次重复实验，经检测和计算，L-乳酸的浓度达到55.3g/L，光学纯度为99.5%，L-乳酸得率为0.79g/g纤维素。
Claims (9)
1.一种同步糖化发酵生产L-乳酸的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将木质纤维素原料进行预处理，固液分离得到残渣Ⅰ和液体Ⅱ；所述的木质纤维素为秸秆、木屑和农林废弃物中至少一种；所述的预处理是加入质量浓度为1%-5%碱液，控制木质纤维素原料与碱液的固液质量比为1:5-1:10；（2）制备粪肠球菌DLY-LFYC种子液，保藏编号为CGMCC No.15821；（3）将粪肠球菌种子液、残渣Ⅰ、纤维素酶以及不加糖的MRS培养基加入发酵罐，在酶解条件下进行同步糖化发酵，酶解温度为45-50℃，同时流加步骤（1）液体Ⅱ，直至发酵结束；粪肠球菌DLY-LFYC种子液的加入量为发酵液体积的5%-20%；残渣Ⅰ一次性加入或者分批次流加，加入量根据发酵培养基中纤维素的浓度确定，最终使发酵培养液中纤维素的浓度为70g/L-170g/L；所述的纤维素酶主要包括内切葡聚糖酶、外切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶，纤维素酶的加入量为2-10FPIU/g纤维素。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的木质纤维素为玉米秸秆。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的预处理是将木质纤维素原料机械粉碎到粒径为0.1-50mm，然后加入碱液，在105-125℃处理5-30min。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述碱为NaOH、KOH、Ca(OH)2、氨水中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）粪肠球菌发酵种子液的制备方法为：采用MRS培养基，将甘油保藏菌接种至试管进行培养，在45-50℃静置培养12-24h，得到一级种子液；随后接入摇瓶进行扩大培养，接种量为5%-20%，在45-50℃静置培养8-12h，得到二级种子液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）残渣Ⅰ分批次流加。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述的酶解条件为pH4.5-6.5，搅拌转速为200-400rpm，发酵时间为72-168h。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）通过pH控制步骤（1）液体Ⅱ的流加，使pH为4.5-6.5。
9.根据权利要求1或8所述的方法，其特征在于：随着发酵的进行，液体Ⅱ不满足要求，流加碱液控制发酵，所述的碱液是NaOH溶液、KOH溶液、Ca(OH)2溶液、氨水中的至少一种。
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