CN106957876B - 一种利用木质纤维素原料发酵制备丁醇的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用木质纤维素原料发酵制备丁醇的方法，包括（1）将木质纤维素原料进行预处理；（2）采用绿色木霉（Trichoderma viride）F4对预处理后原料进行酶解，得到纤维素和半纤维素水解混合糖液，所述绿色木霉已于2008年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2736；（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理；（4）以脱毒后糖液为碳源，补加营养元素制备发酵培养基；（5）将丁醇发酵菌接种至发酵培养基中，发酵制备丁醇。本发明可以同时酶解纤维素和半纤维素，并利用水解产物作为发酵底物制备丁醇，具有酶解效果好、发酵产率高等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及一种利用木质纤维素原料发酵制备丁醇的方法。
背景技术
丁醇是一种重要的有机化工原料，在化工、医药和石油等工业部门有广泛的用途。而且由于比乙醇多两个亚甲基，丁醇具有更高的疏水性，较低的挥发性，可与汽油以任意比例混合，并具有与汽油相当的热值。作为一种有潜力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越来越受到世界各国的关注。
随着石油资源的日益枯竭，降低矿物能源的使用比重，加强可再生能源开发已成为人类今后能源利用的重要趋势。而且采用以石油为原料的丙烯羰基合成法生产丁醇由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。
由于我国人口众多，用传统的原料（玉米和甘蔗）发酵生产丁醇势必会造成与人争粮的问题，造成粮食短缺，因此开展以可再生的生物质材料为原料生物转化生产生物丁醇是符合国情的研究方向。木质纤维素类农业副产物，蕴含大量的纤维素和半纤维素，例如玉米秸秆干物质中纤维素占34-42%，半纤维素占22-28%（岳国君，纤维素乙醇工程概论[M].北京：化学工业出版社，2014）。纤维素的水解产物为葡萄糖，而半纤维素的水解产物主要为木糖，还有少量甘露糖、半乳糖和阿拉伯糖，木质纤维素原料水解产生的混合糖中，半纤维素糖（主要为木糖）占30%-40%，因此半纤维素糖的发酵显得至关重要。
菌株和原料问题一直是困扰丁醇发酵的瓶颈。近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕菌种诱变选育，寻找合适的纤维原料及其糖液制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等方面进行。目前工业上用于丁醇生产的菌株主要是丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌，具有相似的代谢路径，其发酵产物主要分为3 类：1)溶剂（丙酮、乙醇和丁醇）；2)有机酸（乙酸、乳酸和丁酸）；3)气体（包括二氧化碳、氢气等）。他们有的能够利用葡萄糖、蔗糖和淀粉，有的可以利用木糖、半乳糖和甘露糖，因此可以利用该菌对木质纤维素水解的混合糖进行丁醇丙酮发酵。但是，传统丙酮丁醇发酵普遍存在以下问题：（1）传统的丙酮丁醇发酵菌株需在严格厌氧条件下培养发酵，稍有操作不慎，很容易进入空气，造成菌体不能正常生长，因此在发酵过程中通常需要通入惰性气体如N2来保证无氧环境，能耗较高；（2）丁醇产率低，仅20%左右（质量分数），使得丁醇发酵过程原料成本偏高，制约了丁醇发酵产业的发展；（3）发酵产物除了丁醇外还有40%的丙酮和乙醇等副产物，消耗了有限的碳代谢流，降低了产物中丁醇所占的比例，增加了回收丁醇的难度，提高了能耗。
CN201110047422.0提供了一种利用丙酮丁醇羧菌厌氧发酵产丁醇的方法，以葡萄糖为底物，初始葡萄糖浓度为60g/L，在通入N2保持发酵罐严格厌氧环境的情况下，对丙酮丁醇羧菌产酸期和产醇期的pH进行调控，总溶剂和丁醇的产量分别为19.20-19.65g/L和11.43-12.30g/L，丁醇选择性为58.2%-63.1%，溶剂产率为32.0%-32.8%，丁醇产率为19.1%-20.5%。
CN201210089406.2公开了一株产丁醇的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）Y-3，该菌是通过对出发菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052采用甲基磺酸乙酯（EMS）诱变获得的突变株，可以木糖渣为原料制备生物丁醇，在以木糖渣酶解液为碳源时，总溶剂产量为16g/L，丁醇产量为8.2g/L，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题。
CN201210163123.8通过基因工程手段抑制丙酮丁醇梭菌中葡萄糖转运蛋白基因（glcG）的表达，增加木糖转运蛋白、木糖异构酶和木糖糖激酶的表达或活力，提高了丙酮丁醇梭菌对木糖的利用率，以丙酮丁醇梭菌ATCC 824为出发菌株，获得一株基因工程菌株824GlcG-TBA，使得对木糖的利用率从48.7%增加到93.6%。初始菌株ATCC824的溶剂产量为12.99g/L，其中丁醇7.85g/L，溶剂和丁醇产率分别为22.5%和13.6%。工程菌株824GlcG-TBA的溶剂产量为16.06g/L，其中丁醇9.11g/L，溶剂和丁醇产率分别为28.2%和16.0%。
但是，丙酮丁醇发酵菌株存在糖代谢的阻遏效应，即在葡萄糖存在时会优先利用葡萄糖，木糖等其他糖类几乎不消耗。同时丙酮丁醇梭菌本身利用木糖代谢的效率也较低，利用木糖发酵的速率远低于葡萄糖发酵速率。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种利用木质纤维素原料发酵制备丁醇的方法。本发明可以同时酶解纤维素和半纤维素，并利用水解产物作为发酵底物制备丁醇，具有酶解效果好、发酵产率高等特点。
本发明利用木质纤维素原料发酵制备丁醇的方法，包括如下内容：
（1）将木质纤维素原料进行预处理；
（2）采用绿色木霉（Trichoderma viride）F4对预处理后原料进行酶解，得到纤维素和半纤维素水解混合糖液；所述绿色木霉已于2008年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2736；
（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理；
（4）以脱毒后糖液为碳源，补加营养元素制备发酵培养基；
（5）将丁醇发酵菌接种至发酵培养基中，发酵制备丁醇。
本发明步骤（1）所述的木质纤维素原料含有纤维素、半纤维素和木质素，可以采用秸秆、木屑、能源植物等，优选采用玉米秸秆。所述预处理方式可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学技术，包括机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理和溶剂预处理，或采用上述方法的组合预处理等，优选采用蒸汽爆破预处理。具体过程如下：将切碎的玉米秸秆进入到蒸汽爆破装置的滞留器，在160-210℃下维持5-10分钟，瞬间泄压释放，即得到蒸汽爆破预处理的玉米秸秆。预处理后的原料用水配制成固液比为2%-10%（w/v）的料液，调节pH 为4.5-5.5进行酶解。
本发明步骤（2）中所述绿色木霉（Trichoderma viride）F4为专利CN201410731202.3所述绿色木霉F4，已于2008年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2736，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。该菌株在以预处理木质纤维素作为碳源和诱导物生产纤维素酶的过程中，能够耐受预处理木质纤维素引入的多种抑制物，仍然可以高效产酶，分泌的纤维素酶成分全，酶活性高，对预处理木质纤维素底物的酶解适应性强。
本发明步骤（2）中按照CN201410731202.3制得绿色木霉（Trichoderma viride）F4的产酶发酵液，加入量为5-15mL/g纤维素。酶解条件为：酶解pH值为4.5-5.5，温度为45-55℃，搅拌速率为50-300 r/min，酶解时间为24-72 h。
本发明步骤（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理，直接加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH 至9-12，于40-60℃，50-300r/min搅拌1h，采用常规方法进行固液分离，液体即为脱毒后的糖液。
本发明步骤（4）以脱毒后的糖液为碳源，配制用于丁醇发酵菌株发酵用的培养基，其中还原糖浓度为25-50g/L，补加营养元素配成发酵培养基。
本发明步骤（5）所述的丁醇发酵菌为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）或者丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)。优选采用拜氏梭菌XH0906，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9124，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所。
本发明步骤（5）所述发酵条件为厌氧发酵或兼氧发酵，接种量为（体积分数，v/v）1%-10%，发酵温度为28-42℃，发酵时间为24-72小时，即得到含有丁醇的发酵液。采用拜氏梭菌XH0906作为发酵菌株，无需通入空气和氮气。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
（1）采用绿色木霉（Trichoderma viride）F4的产酶发酵液对预处理后木质纤维素原料进行酶解，可以耐受多种抑制物，纤维素酶成分全，可以同时高效酶解纤维素和半纤维素，具有酶解适应性强、酶解效果好、还原糖得率高等特点。
（2）利用拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）XH0906为发酵菌株，发酵培养基中无需加入保险粉脱氧，发酵过程中不需要通入N2保持无氧环境，丁醇的选择性达到100%，几乎无丙酮和乙醇副产物产生，葡萄糖和木糖混合作为碳源时无选择性，丁醇产量为7-10g/L，丁醇产率为20%-40%。
（3）本发明发酵生产丁醇的过程操作简单，原料单耗低，产品更容易提纯，对利用木质纤维素原料生产丁醇的大规模工业应用具有重要意义。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明方法和效果做进一步详细说明。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。本发明中，wt%为质量分数。
本发明实施例使用的木质纤维素原料为玉米干秸秆，其中纤维素38.2wt%，半纤维素22.1wt%，木质素20.2wt%，灰分3.9wt%，用粉碎机粉碎至颗粒大小为1-5mm。
实施例1 绿色木霉F4产酶发酵液的制备
配制发酵培养基：麦麸10g，酸处理过的玉米芯5g，微晶纤维素5g，CaCO3 1.5g，酵母膏4g，KH2PO4 0.05g，CaCl2 0.08g，MgSO4 0.08g，ZnSO4·7H2O 1.2mg，MnSO4·4H2O 0.5mg，CoCl2 0.4mg，加水至200ml。
制备种子液：将上述培养基置于500ml三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后按10%（v/v）接种量接种绿色木霉F4，28-33℃恒温培养24小时。
液态发酵：将上述培养基在121℃灭菌30分钟，冷却后按10%（v/v）接种量将制备的种子液接种到培养基中，30℃，转速200rpm，在发酵24h后加入1.5g槐树粉，培养72小时。发酵液的滤纸酶活达到12.4IU/ml，β-葡萄糖苷酶活平均为1.7IU/ml。
实施例2拜氏梭菌XH0906种子液的制备
种子培养基成分：蛋白胨10g/L、牛肉膏6g/L、木糖30g/L、氯化钠0.5g/L、硫酸铵0.9g/L、硫酸铁0.1g/L、硫酸镁0.3g/L、氯化钙0.1g/L，pH 7.0，在121℃下灭菌15min。
以拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）XH0906为发酵菌株，将保藏的拜氏梭菌从斜面上刮下1-2环接入摇瓶种子培养基中，不需要通入N2，30℃静置培养36 h，制备得到发酵种子液。
实施例3 以玉米秸秆为原料发酵制备丁醇
（1）将玉米秸秆进行预处理：取粉碎的玉米秸秆利用2.0wt%的稀硫酸浸渍，固液比为1g:2mL，进入到蒸汽爆破装置的滞留器中，在温度170℃，压力0.7MPa下维持5分钟，瞬间泄压爆破，得到稀酸蒸汽爆破预处理的玉米秸秆，主要由木糖、纤维素和木质素组成，干物质浓度为32%，木糖含量为21.2%（相对于干物质），纤维素含量为38.6%。
（2）对预处理后玉米秸秆进行酶解：把经过稀酸蒸汽爆破预处理的玉米秸秆物料利用NaOH调节pH 到5.0。加入自来水调节干物质浓度为5%，加入绿色木霉F4产酶发酵液，加入量为8mL/g纤维素，于50℃、150r/min酶解24 h，酶解的pH 值为5.0，酶解液利用液相色谱检测，木糖浓度为10.1g/L，葡萄糖浓度为20g/L，纤维素的葡萄糖酶解得率为93.3 %。
（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理：直接加入氢氧化钙固体调节酶解液的pH 至10.5，于50℃，120r/min搅拌保温1h，固液分离后，液体即为脱毒后的糖液。
（4）以脱毒后糖液为碳源，补加以下营养元素配成发酵培养基：酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01g/L，对氨基苯甲酸0.001 g/L，维生素B10.001g/L，生物素0.0001g/L，调节pH至6-7。
（5）将拜氏梭菌XH0906种子液按照5%的接种量接种至发酵培养基中，发酵制备生物丁醇：发酵条件为兼氧发酵，培养基无需加入保险粉脱氧，发酵温度为37℃，发酵过程不用通入N2保持无氧环境，自然pH，发酵48小时，即得到含有丁醇的发酵液，发酵液中的丁醇浓度为7.3g/L，残余葡萄糖浓度0.04g/L，残余木糖浓度0.02g/L，葡萄糖和木糖到丁醇的产率为24.3%。
实施例4
（1）将玉米秸秆进行预处理：取粉碎的玉米秸秆利用2.0wt%的稀硫酸浸渍，固液比为1g:2mL，进入到蒸汽爆破装置的滞留器中，在温度170℃，压力0.7MPa下维持5分钟，瞬间泄压爆破，得到稀酸蒸汽爆破预处理的玉米秸秆，主要由木糖、纤维素和木质素组成，干物质浓度为32%，木糖含量为21.2%（相对于干物质），纤维素含量为38.6%。
（2）对预处理后玉米秸秆进行酶解：把经过稀酸蒸汽爆破预处理的玉米秸秆物料利用NaOH调节pH 到4.5。加入自来水调节干物质浓度为8%，加入绿色木霉F4产酶发酵液，加入量为12mL/g纤维素，于50℃、150r/min酶解24h，酶解的pH 值为5.0，酶解液利用液相色谱检测，木糖浓度为16.1g/L，葡萄糖浓度为33.2g/L，纤维素的葡萄糖酶解得率为96.8%。
（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理：直接加入氢氧化钙固体调节酶解液的pH 至11，于50℃，120r/min搅拌保温1h，固液分离后，液体即为脱毒后的糖液。
（4）以脱毒后糖液为碳源，补加以下营养元素配成发酵培养基：酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01g/L，对氨基苯甲酸0.001 g/L，维生素B10.001g/L，生物素0.0001g/L，调节pH至6-7。
（5）将拜氏梭菌XH0906种子液按照5%的接种量接种至发酵培养基中，发酵制备生物丁醇：发酵条件为兼氧发酵，培养基无需加入保险粉脱氧，发酵温度为37℃，发酵过程不用通入N2保持无氧环境，自然pH，发酵48小时，即得到含有丁醇的发酵液，发酵液中的丁醇浓度为8.5g/L，残余木糖4.9g/L，残余葡萄糖7.8g/L，葡萄糖和木糖到丁醇的产率为23.2%。
实施例5
处理流程和操作条件同实施例4，不同之处在于：采用拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii) NCIMB 8052，购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心。发酵72小时，即得到含有丁醇的发酵液，发酵液中的总溶剂浓度9.1g/L，其中丁醇浓度为5.5g/L，丙酮浓度为2.7g/L和乙醇浓度0.9g/L，残余葡萄糖浓度9.1g/L，残余木糖13.1g/L，葡萄糖和木糖到丁醇产率为20.3%。
比较例1
处理流程和操作条件同实施例4，不同之处在于：酶解采用诺维信的Ctec2纤维素酶，加入量为10IU/g纤维素。酶解液中的木糖浓度为16.6g/L，葡萄糖浓度为33.8g/L，纤维素的葡萄糖酶解得率为98.5%。 酶解液经过丁醇发酵后，发酵液中的丁醇浓度为8.9g/L，葡萄糖和木糖到丁醇的产率为22.9%，残余木糖4.3g/L，残余葡萄糖7.3 /L。由此可见，采用本发明提供的产酶菌株进行酶解，酶解效果接近商品酶；而且对上述酶解液发酵后，丁醇产率更高。
Claims (11)
1.一种利用木质纤维素原料发酵制备丁醇的方法，其特征在于包括如下步骤：
（1）将木质纤维素原料进行预处理；
（2）采用绿色木霉（Trichoderma viride）F4对预处理后原料进行酶解，得到纤维素和半纤维素水解混合糖液；所述绿色木霉已于2008年11月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.2736；
（3）利用氢氧化钙对水解混合糖液进行脱毒处理；
（4）以脱毒后糖液为碳源，补加营养元素制备发酵培养基；
（5）将丁醇发酵菌接种至发酵培养基中，发酵制备丁醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的秸秆或木屑；预处理采用机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理或溶剂预处理，或采用上述方法的组合预处理。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的木质纤维素原料采用玉米秸秆，预处理采用蒸汽爆破预处理。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：采用蒸汽爆破预处理的具体过程如下：将切碎的玉米秸秆进入到蒸汽爆破装置的滞留器，在160-210℃下维持5-10分钟，瞬间泄压释放，即得到蒸汽爆破预处理的玉米秸秆。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）预处理后原料配制成固液比（w/v）为2%-10%的料液，调节pH为4.5-5.5进行酶解。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）酶解条件为：pH值为4.5-5.5，温度为45-55℃，搅拌速率为50-300 r/min，酶解时间为24-72h。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）采用直接加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至9-12，于40-60℃，50-300r/min搅拌1h，固液分离后，液体即为脱毒后的糖液。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（4）以脱毒后的糖液为碳源，配制用于丁醇发酵菌株发酵用的培养基，其中还原糖浓度为25-50g/L，补加营养元素配成发酵培养基。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）所述丁醇发酵菌为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）或者丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum)。
10.根据权利要求1或9所述的方法，其特征在于：步骤（5）所述的丁醇发酵菌采用拜氏梭菌XH0906，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年05月04日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9124。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（5）所述发酵条件为厌氧发酵或兼氧发酵，接种量为1%-10%（v/v），发酵温度为28-42℃，发酵时间为24-72小时。
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