CN111349658A - 一种木质纤维素酶解发酵生产乙醇的方法 - Google Patents
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- C12N9/2434—Glucanases acting on beta-1,4-glucosidic bonds
- C12N9/2437—Cellulases (3.2.1.4; 3.2.1.74; 3.2.1.91; 3.2.1.150)
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- C12P19/14—Preparation of compounds containing saccharide radicals produced by the action of a carbohydrase (EC 3.2.x), e.g. by alpha-amylase, e.g. by cellulase, hemicellulase
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Abstract
本发明涉及一种木质纤维素酶解发酵生产乙醇的方法，是将粉碎的木质纤维素原料与水混合，连续输送到锥形螺杆装置中，进行连续搓揉、浸渍、蒸煮、挤压和脱水，控制温度为120‑180℃，停留时间为3‑30min；然后进入到等径螺杆装置中进行二次蒸煮，控制温度为180‑220℃，停留时间为4‑40min；最后进行蒸汽爆破，得到预处理原料；第一段蒸煮挤出液用于纤维素酶发酵菌发酵产纤维素酶，并对发酵液进行浓缩；浓缩液对预处理原料进行酶解，酶解糖液用于发酵生产乙醇。本发明以两段双温中性蒸汽爆破处理中第一段蒸煮后的挤出液作为诱导物发酵生产纤维素酶，具有酶解效果好、乙醇得率高、经济环保等特点。
Description
技术领域
本发明属于生物质能源技术领域，具体涉及一种木质纤维素酶解发酵生产乙醇的方法。
背景技术
全球每年经光合作用产生的生物质约1700亿吨，其能量相当于全球能量年消耗总量的10倍，作为能源的利用量还不到总量的l%。2017年9月，国家发展改革委、国家能源局、财政部等十五部门联合印发了《关于扩大生物燃料乙醇生产和推广使用车用乙醇汽油的实施方案》。根据方案，到2020年，全国范围内将基本实现车用乙醇汽油全覆盖。到2025年，力争纤维素乙醇实现规模化生产，先进生物液体燃料技术、装备和产业整体达到国际领先水平，形成更加完善的市场化运行机制。我国每年农作物秸秆产量达到7亿吨，除部分作为造纸原料、炊事燃料、饲料肥料和秸秆还田之外，可作为能源用途的秸秆约3.5亿吨，折合1.8亿吨标准煤，可以转化为1亿吨燃料酒精。
目前，木质纤维素原料的主要利用途径为半纤维素或/和纤维素水解产生水解糖，水解糖经过发酵产生乙醇和丁醇等生物能源产品，或/和乳酸、柠檬酸和丁二酸等。木质纤维素原料制备燃料过程主要包括预处理、纤维素酶制备、酶解、发酵和乙醇分离等步骤。木质纤维素原料预处理最常采用的方法为稀酸预处理或蒸汽爆破预处理。纤维素酶成本一直是纤维素乙醇商业化的主要瓶颈之一，同时木质纤维素原料在预处理过程中产生的有机废水的处理也占用了生产成本。
CN104611963A公开了一种木质纤维素原料的预处理方法，包括：（1）将粉碎好的木质纤维素原料与浸渍液混合，连续输送到锥形螺杆装置中；（2）原料与浸渍液在锥形螺杆装置中进行连续搓揉、浸渍、蒸煮、挤压和脱水，控制温度为120-180℃，停留时间为3-30min；（3）原料连续进入到等径螺杆装置中进行二次蒸煮，控制温度为180-220℃，停留时间为4-40min；（4）原料在螺杆推力作用下移动到出料口进行蒸汽爆破；（5）蒸汽爆破后的原料进入到旋风分离器进行分离。该发明采用分段控温蒸煮和蒸汽爆破组合的工艺，在蒸爆处理前脱除部分酶解和发酵的抑制物，在水解木糖时也可以减少抑制物的产酸，并提高蒸爆预处理和酶解的可及度；同时实现预处理的连续进料，浸渍、挤压、脱水、蒸煮、蒸爆和分离的一体化过程。但该过程存在以下问题：第一段蒸煮后挤压脱水产生的废水中含有少量糖，以及丰富的有机含氮化合物，直接进入废水处理单元造成资源浪费，同时废水处理还需额外的成本。
CN105647813A公开了一株绿色木霉F4及其应用，该菌株在以预处理木质纤维素作为碳源和诱导物生产纤维素酶的过程中，能够耐受预处理木质纤维素引入的多种抑制物，分泌的纤维素酶成分全，活性高，对预处理木质纤维素底物的酶解适应性强。该发明培养基中加入的有机氮源酵母膏和诱导碳源微晶纤维素都比较昂贵，增加了产酶成本。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种木质纤维素酶解发酵生产乙醇的方法。本发明以两段双温中性蒸汽爆破处理中第一段蒸煮后的挤出液作为诱导物发酵生产纤维素酶，产酶液经浓缩用于木质纤维素酶解，酶解糖液再用于发酵乙醇，具有酶解效果好、乙醇得率高、经济环保等特点。
本发明提供的木质纤维素酶解发酵生产乙醇的方法，包括以下步骤：
（1）将粉碎的木质纤维素原料与水混合，连续输送到锥形螺杆装置中，进行连续搓揉、浸渍、蒸煮、挤压和脱水，控制温度为120-180℃，停留时间为3-30min；然后原料连续进入到等径螺杆装置中进行二次蒸煮，控制温度为180-220℃，停留时间为4-40min；最后原料在螺杆推力作用下移动到出料口进行蒸汽爆破，蒸汽爆破后的原料进入到旋风分离器进行分离，得到预处理原料；
（2）步骤（1）挤出液用于纤维素酶发酵菌发酵产纤维素酶，并对发酵液进行浓缩；
（3）利用步骤（2）发酵浓缩液对步骤（1）预处理原料进行酶解，酶解糖液用于发酵生产乙醇。
本发明中，步骤（1）所述的木质纤维素原料是指含纤维素、半纤维素和木质素的生物质原料，如秸秆、木屑和能源作物等，优选玉米秸秆。将木质纤维素原料机械粉碎到粒径为0.1-30mm，优选粒径为0.12-1.0mm。
本发明中，步骤（1）所述水的温度为60-99℃，水与原料的液固质量比为10:1-2:1，优选为5:1-3:1。
本发明中，步骤（1）第二次蒸煮按照水与木质纤维素原料的液固质量比为1:20-1:2，优选1:4-1:2，木质纤维素原料在等径螺杆装置中停留时间为4-40min，优选为10-20min。
本发明中，步骤（1）蒸汽爆破的自动泄压阀门的一端连接等径螺杆装置出料口，另一端连接旋风分离器。自动泄压阀门的开启时间间隔为5-50s，每次开启时间为2-20s。所述的旋风分离器采用现有任何可实现气固分离用旋风分离器。
本发明中，步骤（1）使用的锥形螺杆、等径螺杆、蒸汽爆破、旋风分离器的连接方式及结构采用CN104611963A所述装置。
本发明中，步骤（2）挤出液中添加以下营养物质作为纤维素酶发酵的培养基，麦麸10-60g/L，磷酸二氢钾 0.1-10g/L，硫酸铵1-10g/L，氯化钙 0.01-3g/L，硫酸镁 0.01-3g/L，ZnSO4·7H2O 0.01-50mg/L，MnSO4·4H2O 0.01-20mg/mL，CoCl2 0.01-50mg/L，调节pH4.0-7.0。
本发明中，步骤（2）所述纤维素酶发酵菌采用可以产纤维素酶的菌株，优选专利CN105647813A所提供的绿色木霉（Trichoderma viride）F4、CN101899398A所提供的黑曲霉（Aspergillus niger）T2等，更进一步，优选两株菌的产酶发酵液复配得到的纤维素酶液，复配比例2:1-8:1。
本发明中，步骤（2）纤维素酶发酵菌的接种体积比为10%-20%，发酵温度为23-35℃，pH 3.0-6.0，搅拌速率为100-800r/min，发酵时间为48-144h。
本发明中，步骤（2）对纤维素酶发酵液进行浓缩，将固液分离后液相采用2-50kD超滤膜进行浓缩，浓缩10-200倍。
本发明中，步骤（3）浓缩液与预处理原料的配比为0.02-0.2g/g纤维素，酶解体系的干物质浓度为5wt%-30wt%，pH值为4.8-5.2，温度为48-52℃，搅拌速率为100-500r/min，酶解时间72h。
本发明中，步骤（3）所述酶解糖液加入发酵罐中，接入乙醇发酵菌进行发酵。乙醇发酵菌为能够把葡萄糖或/和木糖发酵成乙醇的菌株，优选CN102041235A所述酿酒酵母菌（Saccharomycescerevisiae）FE-B，该菌株的保藏号为CGMCCNo.2735。
本发明中，步骤（3）发酵体系中酵母菌接种量为0.1wt‰-1wt‰，发酵温度为28-36℃，pH值为4.8-7.2，搅拌速率为100-500r/min，发酵时间72h。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
（1）利用两段双温中性蒸汽爆破过程中第一段蒸煮挤出液作为纤维素酶发酵培养基的组成成分，可以作为诱导物促进产酶发酵菌的生长并诱导分泌纤维素酶及木聚糖酶，提高产酶性能。此外，还可以省略挤出液作为废水处理的费用，减少纤维素酶发酵过程中的水耗。
（2）第一段蒸煮挤出液中含有一定量有机含氮化合物，可以替代成本高昂的有机氮培养基组分，降低了纤维素酶的发酵成本。
（3）利用两段双温中性蒸汽爆破预处理木质纤维素原料，可以减少糠醛等抑制物的产生，不会影响纤维素酶解发酵过程，也不会影响木质纤维素酶解和乙醇发酵，在降低纤维素酶制备成本的同时绿色环保。
附图说明
图1是本发明制备方法的一种流程示意图。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明制备方法和效果。实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
以下实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为本领域常规方法。下述实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均从常规生化试剂商店购买得到。
本发明中，采用的木质纤维素原料为玉米秸秆，玉米秸秆中纤维素含量为38wt%，半纤维素含量为21wt%，木质素含量为17wt%。取干燥的玉米秸秆原料机械粉碎到粒径为0.1-30mm，备用。
本发明测定 FPA和β-葡萄糖苷酶酶活，酶活测定底物分别采用滤纸和水杨素。酶活测定使用 DNS 法：以在 50℃，pH5.0 条件下，1min 催化底物水解产生相当于1μmol 葡萄糖的还原糖定义为一个国际酶活力单位。
葡萄糖、木糖和乙醇均采用Agilent 1200液相色谱仪（HPLC）进行检测分析。色谱柱为Bio-Rad的Aminex HPX-87H（300 mm×7.8 mm），检测器为示差折光检测器，流动相为0.005 mol/L的H2SO4水溶液，流速为0.7 mL/min。
葡寡糖、木寡糖、纤维素和半纤维素含量分析采用NREL提供的方法（A. Sluiter,B. Hames, R. Ruiz, et al., “Determination of Structural Carbohydrates andLignin in Biomass,” NREL/ TP-510-42618, National Renewable Energy Laboratory,Golden, 2008.Sluiter A, Hames B, Ruiz B, et al., “Determination of sugars,byproducts and degradation products in liquid fraction process samples,” NREL/TP-510-4263, National Renewable Energy Laboratory, Golden, 2006.）。
实施例1
采用本发明图1所示的工艺流程制备纤维素乙醇。
（1）把自来水加热到90℃，将粉碎的玉米秸秆与自来水按质量比1:3混合，连续输送到锥形螺杆装置中进行第一段蒸煮，控制温度为170℃，进行连续搓揉、浸渍、蒸煮、挤压和脱水，停留时间20 min。第一段蒸煮的反应物料通过挤压脱水实现固液分离，固体部分水分含量38%，进入到等径螺杆装置进行第二段蒸煮，水与原料的液固质量比为1:3，控制温度210℃，停留时间20min。第二段蒸煮完成后原料在螺杆推力作用下移动到出料口进行蒸汽爆破，每隔30s进行一次泄压蒸爆，阀门开启时间10s。反应物料从泄压口爆破喷射进入到旋风分离器中。物料进入旋风分离器后，含水的固态物料即预处理玉米秸秆自然下落进入到旋风分离器下部的料仓中。
预处理玉米秸秆的干物浓度（不含水的固体总质量占PCS或体系总质量的百分比）为32.6wt%，干物中纤维素含量38.7wt%，半纤维含量 7.8wt%，木寡糖含量为5.5wt%，木糖含量为7.2wt%。
（2）第一段蒸煮挤出液中加入以下营养物质：麦麸30g/L，磷酸二氢钾10g/L，硫酸铵2g/L，氯化钙0.3g/L，硫酸镁0.3g/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·4H2O 5mg/mL，CoCl2 10mg/L，调节pH5.0。121℃灭菌30分钟，制得发酵培养基。
制备产酶发酵菌的种子培养液：按以下配方制备种子培养基：麦麸10g，PCS 5g，微晶纤维素5g，CaCO3 1.5g，酵母膏4g，KH2PO4 0.05g，CaCl2 0.08g，MgSO4 0.08g，ZnSO4·7H2O1.2mg，MnSO4·4H2O 0.5mg，CoCl2 0.4mg，加水至200ml。将上述培养基置于500mL三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后按1%接种量接入绿色木霉F4，200r/min，30℃恒温振荡培养24h，制得绿色木霉F4种子液。
绿色木霉F4产酶发酵：按10%（v/v）接种量将上述制备的种子液接种到制备好的发酵培养基中，在30℃，pH5.0，转速200rpm，发酵144小时。重复 4 批次的上述发酵过程，结果表明，滤纸酶活平均达到 12.8 IU/ml，β-葡萄糖苷酶活平均为 2.1 IU/ml。
对上述纤维素酶发酵液进行浓缩，固液分离后液相采用5kD超滤膜进行浓缩，将1200mL滤纸酶活为 12.8IU/mL的发酵液浓缩30倍得到 40mL浓缩的酶液，浓缩液的滤纸酶活为360IU/mL。
（3）按照表1 的配方分别加入步骤（1）获得的预处理玉米秸秆、0.05M柠檬酸缓冲液（pH5.0）和蒸馏水，采用步骤（2）的浓缩酶液进行酶解，酶解的干物质浓度为20%，200r/min，pH5.0，50℃振荡酶解72h，控制酶解体系的总质量为50g，酶加入量为0.04、0.06、0.08、0.10、0.12g/g纤维素。根据最终葡萄糖浓度（单位：%），计算葡萄糖得率。葡萄糖得率 ( % )=糖液中葡萄糖含量 (g)×0.9×100/ 底物中纤维素量 (g)。
表1 实施例1酶解体系及酶解结果
将上述酶解糖液接入乙醇发酵菌进行发酵。乙醇发酵菌采用CN102041235A中所述酿酒酵母菌FE-B，该菌株的保藏号为CGMCCNo.2735。发酵体系中酵母菌接种量（种子培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，在生化培养箱中30℃静置培养）0.5wt‰，发酵温度为36℃，pH值为6.0，搅拌速率为300r/min，发酵72h，结果见表2。
表2 实施例1乙醇发酵结果
实施例2
（1）把自来水加热到60℃，将粉碎的玉米秸秆与自来水按质量比1:2混合，连续输送到锥形螺杆装置中进行第一段蒸煮，控制温度为120℃，进行连续搓揉、浸渍、蒸煮、挤压和脱水，停留时间30min。第一段蒸煮的反应物料通过挤压脱水实现固液分离，固体部分水分含量37.5%，进入到等径螺杆装置进行第二段蒸煮，水与原料的液固质量比为1:2，控制温度180℃，停留时间30min。第二段蒸煮完成后原料在螺杆推力作用下移动到出料口进行蒸汽爆破，每隔10s进行一次泄压蒸爆，阀门开启时间5s。反应物料从泄压口爆破喷射进入到旋风分离器中。物料进入旋风分离器后，含水的固态物料即预处理玉米秸秆自然下落进入到旋风分离器下部的料仓中。
预处理玉米秸秆的干物浓度（不含水的固体总质量占PCS或体系总质量的百分比）为31.8wt%，干物中纤维素含量37.6wt%，半纤维含量 8.2wt%，木寡糖含量为 6.3wt%，木糖含量为 6.7wt%。
（2）第一段蒸煮挤出液中加入以下营养物质：麦麸30g/L，磷酸二氢钾 10g/L，硫酸铵2g/L，氯化钙 0.3g/L，硫酸镁 0.3g/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·4H2O 5mg/mL，CoCl2 10mg/L，调节pH5.0。121℃灭菌30分钟，制得发酵培养基。
制备产酶发酵菌的种子培养液：按以下配方制备种子培养基：麦麸10g，PCS 5g，微晶纤维素5g，CaCO3 1.5g，酵母膏4g，KH2PO4 0.05g，CaCl2 0.08g，MgSO4 0.08g，ZnSO4·7H2O1.2mg，MnSO4·4H2O 0.5mg，CoCl2 0.4mg，加水至200ml。将上述培养基置于500mL三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后按1%接种量接入绿色木霉F4，200r/min，30℃恒温振荡培养24h，制得绿色木霉F4种子液。
绿色木霉F4产酶发酵：按10%（v/v）接种量将上述制备的种子液接种到制备好的发酵培养基中，在30℃，pH5.0，转速200rpm，发酵144小时。重复 4 批次的上述发酵过程，结果表明，滤纸酶活平均达到 12.5 IU/ml，β-葡萄糖苷酶活平均为 1.8IU/ml。
对上述纤维素酶发酵液进行浓缩，固液分离后液相采用5kD超滤膜进行浓缩，将1200mL滤纸酶活为12.5 IU/mL的发酵液浓缩30倍得到 40mL浓缩的酶液，浓缩液的滤纸酶活为355IU/mL。
（3）按照表3的配方分别加入步骤（1）获得的预处理玉米秸秆、0.05M柠檬酸缓冲液（pH5.0）和蒸馏水，采用步骤（2）的浓缩酶液进行酶解，酶解的干物质浓度为10%，200r/min，pH5.0，50℃振荡酶解72h，控制酶解体系的总质量为50g，酶加入量为0.04、0.06、0.08、0.10、0.12g/g纤维素。根据最终葡萄糖浓度（单位:%），计算葡萄糖得率。葡萄糖得率 ( % )=糖液中还原糖总量 (g)×0.9×100/ 底物中纤维素量 (g)。
表 3 实施例 2 酶解评价结果
将上述酶解糖液接入乙醇发酵菌进行发酵。乙醇发酵菌采用CN102041235A中所述酿酒酵母菌FE-B，该菌株的保藏号为CGMCCNo.2735。发酵体系中酵母菌接种量（种子培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，在生化培养箱中30℃静置培养）1.0wt‰，发酵温度为36℃，pH值为7.0，搅拌速率为300r/min，发酵72h，结果见表4。
表4 实施例2乙醇发酵结果
实施例3
采用本发明图1所示的工艺流程制备纤维素乙醇。
（1）把自来水加热到99℃，将粉碎的玉米秸秆与自来水按质量比1:10混合，连续输送到锥形螺杆装置中进行第一段蒸煮，控制温度为180℃，进行连续搓揉、浸渍、蒸煮、挤压和脱水，停留时间10min。第一段蒸煮的反应物料通过挤压脱水实现固液分离，固体部分水分含量36.5%，进入到等径螺杆装置进行第二段蒸煮，水与原料的液固质量比为1:10，控制温度220℃，停留时间10min。第二段蒸煮完成后原料在螺杆推力作用下移动到出料口进行蒸汽爆破，每隔50s进行一次泄压蒸爆，阀门开启时间20s。反应物料从泄压口爆破喷射进入到旋风分离器中。物料进入旋风分离器后，含水的固态物料即预处理玉米秸秆自然下落进入到旋风分离器下部的料仓中。
预处理玉米秸秆的干物浓度（不含水的固体总质量占PCS或体系总质量的百分比）为30.9wt%，干物中纤维素含量37.8wt%，半纤维含量 8.0wt%，木寡糖含量为6.5wt%，木糖含量为 6.1wt%。
（2）第一段蒸煮挤出液中加入以下营养物质：麦麸30g/L，磷酸二氢钾 10g/L，硫酸铵2g/L，氯化钙 0.3g/L，硫酸镁 0.3g/L，ZnSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·4H2O 5mg/mL，CoCl2 10mg/L，调节pH5.0。121℃灭菌30分钟，制得发酵培养基。
制备产酶发酵菌的种子培养液：按以下配方制备种子培养基：麦麸10g，PCS 5g，微晶纤维素5g，CaCO3 1.5g，酵母膏4g，KH2PO4 0.05g，CaCl2 0.08g，MgSO4 0.08g，ZnSO4·7H2O1.2mg，MnSO4·4H2O 0.5mg，CoCl2 0.4mg，加水至200ml。将上述培养基置于500mL三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后按1%接种量接入绿色木霉F4，200r/min，30℃恒温振荡培养24h，制得绿色木霉F4种子液。
绿色木霉F4产酶发酵：按10%（v/v）接种量将上述制备的种子液接种到制备好的发酵培养基中，在30℃，pH5.0，转速200rpm，发酵144小时。重复 4 批次的上述发酵过程，结果表明，滤纸酶活平均达到 12.7 IU/ml，β-葡萄糖苷酶活平均为 1.8IU/ml。
对上述纤维素酶发酵液进行浓缩，固液分离后液相采用5kD超滤膜进行浓缩，将1200mL滤纸酶活为12.7IU/mL的发酵液浓缩30倍得到 40mL浓缩的酶液，浓缩液的滤纸酶活为358IU/mL。
（3）按照表1 的配方分别加入步骤（1）获得的预处理玉米秸秆、0.05M柠檬酸缓冲液（pH5.0）和蒸馏水，采用步骤（2）的浓缩酶液进行酶解，酶解的干物质浓度为20%，200r/min，pH5.0，50℃振荡酶解72h，控制酶解体系的总质量为50g，酶加入量为0.04、0.06、0.08、0.10、0.12g/g纤维素。根据最终葡萄糖浓度（单位：%），计算葡萄糖得率。葡萄糖得率 ( % )=糖液中还原糖总量 (g)×0.9×100/ 底物中纤维素量 (g)。
表 5 实施例3酶解评价结果
表 6 实施例3乙醇发酵结果
实施例4
同实施例1，不同之处在于采用专利CN101899398A所提供的黑曲霉（Aspergillus niger）T2。
制备产酶发酵菌的种子培养液：按以下配方制备种子培养基：500ml三角瓶中装玉米芯4.95g，酵母粉3.5g，KH2PO4 0.4g, MgSO4 0.06g，CaCl2 0.06g，微量元素：FeSO4 1mg，MnSO4 0.32mg，ZnSO4 0.2mg，加水至200ml，pH5.0。将上述培养基置于500mL三角瓶中，121℃灭菌30分钟，冷却后按1%接种量接种黑曲霉T2，200r/min，30℃恒温振荡培养24h，制得黑曲霉T2种子液。
黑曲霉T2产酶发酵：按10%（v/v）接种量将上述制备的种子液接种到制备好的发酵培养基中，在30℃，pH5.0，转速200rpm，发酵72小时。重复 4 批次的上述发酵过程，结果表明，滤纸酶活平均达到 5.6IU/ml，β-葡萄糖苷酶活平均为 2.46IU/ml。
按实施例 1 相同的方法进行酶解和发酵评价，结果如表 7和表8所示。
表7 实施例4酶解评价结果
表8 实施例4发酵乙醇评价结果
实施例5
同实施例1，不同之处在于浓缩粗酶液采用实施例1中绿色木霉F4和实施例4中黑曲霉T2的酶液以4:1的比例复配。按实施例 1 相同的方法进行评价酶解和发酵评价，结果如表9和表10所示。
表9 实施例5酶解评价结果
表10 实施例5乙醇发酵评价结果
实施例6
同实施例1，不同在于在步骤（3）PCS酶水解过程中加入α-环糊精、β-环糊精、γ-环糊精等中的任意一种。按实施例 1 相同的方法进行评价酶解和发酵评价，结果如表 11和表12所示。
表11 实施例6酶解评价结果
表12 实施例6乙醇发酵结果
比较例1
同实施例1，不同在于将两段蒸煮挤出液合并后进行纤维素酶发酵。按实施例 1 相同的方法进行评价酶解和发酵评价，结果如表 13所示。
表13 酶解及乙醇发酵评价结果
比较例2
同实施例1，不同在于预处理过程浸渍液采用稀硫酸溶液，浓度为0.1wt%。按实施例 1相同的方法进行评价酶解和发酵评价，结果如表 14所示。
表14 酶解及乙醇发酵评价结果
比较例3
同实施例1，不同在于纤维素酶发酵培养基的配方为：麦麸 50g/L，预处理玉米秸秆50g/L，微晶纤维素 25g/L，酵母膏 20g/L，KH2PO4 0.25g/L，CaCl2 0.4g/L，MgSO4 0.4g/L，ZnSO4·7H2O 6mg/L，MnSO4·4H2O2.5mg/L，CoCl2 2mg/L。按实施例 1 相同的方法进行评价酶解和发酵评价，结果如表 15所示。
表15 酶解及乙醇发酵评价结果
由表15可知，采用本发明方法第一段蒸煮挤出液作为纤维素酶制备的诱导物，可以与微晶纤维素、酵母膏达到等同的效果，显著降低了纤维素酶的制备成本。
Claims (13)
1.一种木质纤维素酶解发酵生产乙醇的方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）将粉碎的木质纤维素原料与水混合，连续输送到锥形螺杆装置中，进行连续搓揉、浸渍、蒸煮、挤压和脱水，控制温度为120-180℃，停留时间为3-30min；然后原料连续进入到等径螺杆装置中进行二次蒸煮，控制温度为180-220℃，停留时间为4-40min；最后原料在螺杆推力作用下移动到出料口进行蒸汽爆破，蒸汽爆破后的原料进入到旋风分离器进行分离，得到预处理原料；
（2）步骤（1）挤出液用于纤维素酶发酵菌发酵产纤维素酶，并对发酵液进行浓缩；
（3）利用步骤（2）发酵浓缩液对步骤（1）预处理原料进行酶解，酶解糖液用于发酵生产乙醇。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述的木质纤维素原料是指含纤维素、半纤维素和木质素的生物质原料，优选玉米秸秆；将木质纤维素原料机械粉碎到粒径为0.1-30mm，优选粒径为0.12-1.0mm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）所述水的温度为60-99℃，水与原料的液固质量比为10:1-2:1，优选为5:1-3:1。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）第二次蒸煮按照水与木质纤维素原料的液固质量比为1:20-1:2，优选1:4-1:2，木质纤维素原料在等径螺杆装置中停留时间为为10-20min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（1）蒸汽爆破的自动泄压阀门的一端连接等径螺杆装置出料口，另一端连接旋风分离器，自动泄压阀门的开启时间间隔为5-50s，每次开启时间为2-20s。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）挤出液中添加以下营养物质作为纤维素酶发酵的培养基，麦麸10-60g/L，磷酸二氢钾 0.1-10g/L，硫酸铵1-10g/L，氯化钙0.01-3g/L，硫酸镁 0.01-3g/L，ZnSO4·7H2O 0.01-50mg/L，MnSO4·4H2O 0.01-20mg/mL，CoCl2 0.01-50mg/L，调节pH 4.0-7.0。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述纤维素酶发酵菌采用专利CN105647813A所提供的绿色木霉F4、CN101899398A所提供的黑曲霉T2中的至少一种。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：步骤（2）所述纤维素酶发酵菌采用绿色木霉F4和黑曲霉T2的产酶发酵液复配得到的纤维素酶液，复配比例2:1-8:1。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）纤维素酶发酵菌的接种体积比为10%-20%，发酵温度为23-35℃，pH 3.0-6.0，搅拌速率为100-800r/min，发酵时间为48-144h。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（2）对纤维素酶发酵液进行浓缩，将固液分离后液相采用2-50kD超滤膜进行浓缩，浓缩10-200倍。
11.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）浓缩液与预处理原料的配比为0.02-0.2g/g纤维素，酶解体系的干物质浓度为5wt%-30wt%，pH值为4.8-5.2，温度为48-52℃，搅拌速率为100-500r/min，酶解时间72h。
12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）所述酶解糖液加入发酵罐中，接入乙醇发酵菌进行发酵，乙醇发酵菌为能够把葡萄糖或/和木糖发酵成乙醇的菌株。
13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（3）发酵体系中酵母菌接种量为0.1wt‰-1wt‰，发酵温度为28-36℃，pH值为4.8-7.2，搅拌速率为100-500r/min，发酵时间72h。
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