CN108330091B - 一种丙酮丁醇梭菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，菌株号为LJ4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCCNO:M 2017754。本发明进一步地提供了丙酮丁醇梭菌LJ4在发酵生产丁醇中的应用。菌株LJ4可以很好地利用未脱毒的木质纤维素水解液，在全部都为木质纤维素水解液时，菌株LJ4发酵生成丁醇13.9g/L；在含有50％的木质纤维素水解液时，菌株LJ4发酵生成丁醇产量最高，为15.2g/L；推断是由于木质纤维素水解液中成分复杂，存在可以提高丁醇产量的物质，而抑制物浓度低于菌株耐受程度。

Description

一种丙酮丁醇梭菌及其应用
技术领域
本发明涉及产丁醇菌，具体涉及一种丙酮丁醇梭菌及其应用。
背景技术
丁醇是一种重要的C4平台化合物，已广泛应用于各种精细化学品的制造；并作为一种重要的具有极大潜力的新型生物燃料受到重视，联合国国际能源署将生物丁醇列为第二代生物燃料。作为燃料，丁醇具有能量密度大、可直接用于内燃机、运输方便等优点，在能源危机日益严峻的今天，丁醇作为燃料有着广阔的发展前景。2007年我国丁醇表观消费量已达到74万吨，预计2010年国内丁醇需求量将达到100万吨。由于国内产量不能够满足需要，我国已经是世界上最大的丁醇进口国。
目前，丁醇主要通过化学法合成，随着石油资源加速枯竭和价格飞涨，发酵法生产丁醇又受到了广泛的重视，已经成为生物能源的研究热点之一。丙酮丁醇梭菌可直接有效利用玉米等淀粉物质或糖蜜等原料，但这些原料的成本相对比较高，同时存在与人相争的问题。在粮食短缺与能源危机的双重威胁下，探索纤维质原料生产燃料丁醇成为生物质能源发展战略的重要组成，也是研究的热点之一。
近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕着菌种诱变选育、纤维原料糖液的制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等发面进行。纤维素原料价格低廉、来源广泛，且丁醇生产菌对纤维素水解液中的葡萄糖和木糖都有较高的利用效率，而乙醇的常用生产菌不能高效利用戊糖，因此，丁醇生产可大大提高纤维原料的利用效率，以纤维原料生产燃料丁醇具有优势。但纤维原料必须经过预处理、酶解形成简单的糖后才能被菌体利用，在纤维原料处理过程中会产生一定量的酸类、醛类、木质素衍生物等副产物，同时还引进大量的硫酸根、氯离子，这些物质通过破坏H+离子梯度、抑制发酵过程中酶的活性、破坏细胞膜的稳定性、改变渗透性等方式抑制丁醇发酵的正常进行。经对各种纤维素水解液中副产物成分调查分析发现，水解液中含有乙酸、甲酸、醛类物质(糠醛和5-羟甲基糠醛)、酚类物质(阿魏酸、香豆酸、香草醛)等抑制物，这些抑制物的除去成本较高、并对微生物生长有一定的抑制作用；Thaddeus Ezeji等(Biotechnology&Bioengineering.2007,97(6):1460-1469)研究发现有机酸、糠醛等抑制物不影响丁醇的发酵，而酚类抑制物对丁醇发酵有明显的抑制效应。孙彦平等(应用与环境生物学报[J].2010,16(6):845～850)研究发现，当阿魏酸、香豆酸浓度大于1g/L时发酵完全不能进行；0.5g/L的阿魏酸或香豆酸存在时的丁醇抑制率分别为22.1％、82.4％。
发明内容
发明目的：为了解决现有丙酮丁醇梭菌耐受酸类、醛类和酚类抑制物能力弱的问题，本发明提供了一种丙酮丁醇梭菌，本发明进一步地提供了丙酮丁醇梭菌在发酵生产丁醇中的应用。
技术方案：本发明所述一种丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌(Clostridium acetobutylicum)，菌株号为LJ4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年11月30日，保藏编号为CCTCC NO:M 2017754，保藏地址为中国.武汉.武汉大学，邮编430072。
该菌株是发明人于2017年6月25日对珍珠泉土壤进行筛选，用糠醛、酚类等抑制物添加到培养基中进行筛选，在平板上划线纯化5～7代，筛选出能够直接利用未脱毒木质纤维素水解液的菌株。
菌株LJ4生长及代谢特性：菌株LJ4可以在37℃下很好地生长，在pH4.5～6.5下生长良好，在pH5.5生长最为适宜。LJ4在24～48h处于对数生长期，会产生较多的乙酸和丁酸，使pH明显下降，从而生长受到影响，启动产醇机制，开始生成乙醇和丁醇。
菌株LJ4的16S rDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
本发明进一步地提供丙酮丁醇梭菌LJ4在发酵生产丁醇中的应用。
优选地，丙酮丁酮梭菌LJ4利用未脱毒的木质纤维素水解液作为碳源发酵生产丁醇。
其中，木质纤维素水解液的制备步骤如下：以质量分数2％的稀H2SO4对木质纤维素进行酸解，固液比18g:1L，130℃条件下水解1h，固液分离得到木质纤维素水解液。
其中，所述木质纤维素水解液为玉米芯水解液。
优选地，所述木质纤维素水解液中糠醛浓度为0～4g/L。
优选地，所述木质纤维素水解液中5-羟甲基糠醛浓度为0～5g/L。
所述木质纤维素水解液中阿魏酸浓度为0～1.9g/L。
优选地，所述木质纤维素水解液中对香豆酸浓度为0～1g/L。
优选地，所述木质纤维素水解液中香兰素浓度为0～4g/L。
所述发酵条件如下：30～55℃、pH4.5～6.5条件下厌氧发酵72～192h。
有益效果：(1)菌株LJ4对糠醛、5-羟甲基糠醛、阿魏酸、对香豆酸、香兰素耐受性良好，可以耐受4g/L的糠醛，5g/L的5-羟甲基糠醛，1.9g/L的阿魏酸，1g/L的对香豆酸和4g/L的香兰豆。(2)菌株LJ4可以很好地利用未脱毒的木质纤维素水解液，在全部都为木质纤维素水解液时，菌株LJ4发酵生成丁醇13.9g/L；在含有50％的木质纤维素水解液时，菌株LJ4发酵生成丁醇产量最高，为15.2g/L；推断是由于木质纤维素水解液中成分复杂，存在可以提高丁醇产量的物质，而抑制物浓度低于菌株耐受程度。
附图说明
图1为1g/L、2g/、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L糠醛浓度下菌株LJ4生长OD；
图2为1g/L、2g/、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L糠醛浓度下丁醇产量；
图3为1g/L、2g/、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L5-羟甲基糠醛浓度下菌株LJ4生长OD；
图4为1g/L、2g/、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L5-羟甲基糠醛浓度下丁醇产量；
图5为1g/L、1.5g/、1.8g/L、1.9g/L、2g/L、3g/L阿魏酸浓度下菌株LJ4生长OD；
图6为1g/L、1.5g/、1.8g/L、1.9g/L、2g/L、3g/L阿魏酸浓度下丁醇产量；
图7为1g/L、1.5g/、1.8g/L、2g/L、3g/L对香豆酸浓度下菌株LJ4生长OD；
图8为1g/L、1.5g/、1.8g/L、2g/L、3g/L对香豆酸浓度下丁醇产量；
图9为1g/L、2g/、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L香兰素浓度下菌株LJ4生长OD；
图10为1g/L、2g/、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L香兰素浓度下丁醇产量；
图11为添加不同体积未脱毒的玉米芯水解液菌株LJ4的丁醇产量；
图12为添加不同体积未脱毒的玉米芯水解液菌株ATCC824的丁醇产量。
具体实施方式
实施例1在含糠醛，5-羟甲基糠醛，阿魏酸，对香豆酸，香兰素各0.5g/L的筛选平板中对Clostridium acetobutylicum LJ4菌株进行分离筛选
称取1g珍珠泉土壤中采取的土样，用生理盐水稀释，吸取200μL至含有糠醛，5-羟甲基糠醛，阿魏酸，对香豆酸，香兰素各0.5g/L的平板上，于37℃厌氧培养192h。生长出的菌落划线纯化5代，从而筛选出能够对木质纤维素水解液抑制物耐受性强的菌株Clostridiumacetobutylicum LJ4。
上述筛选平板的培养基配方为NaCl 1g/L，K2HPO4 0.75g/L，KH2PO4 0.75g/L，酵母粉3g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeCl2·4H2O 1.5g/L，KCl 0.3g/L，糠醛，5-羟甲基糠醛，阿魏酸，对香豆酸，香兰素各0.5g/L，调节pH至4.5～6.5，固体培养基加入琼脂粉15～20g/L，通氮气10～20min，121℃灭菌15min。
实施例2Clostridium acetobutylicum LJ4鉴定及其生长特性
对LJ4进行16S rDNA鉴定：
利用引物27F：5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’和1492R：5’-TACCTTGTTACGACTT-3’扩增菌株LJ4的16S rDNA，通过T/A克隆的方式连接至克隆载体pMD19T，构建重组克隆载体pMD19T-16S，将其转化到克隆宿主菌Escherich coli DH5α获得重组微生物Escherichcoli DH5α(pMD19T-16S)，将所获得的重组微生物外源片段进行测序，NCBI数据库比对该16S rDNA序列，在分子水平上将菌株LJ4鉴定至Clostridium acetobutylicum菌属，其16SrDNA的核苷酸序列如序列表中SEQ ID NO：1所示。
LJ4生长及代谢特性：
菌株LJ4可以在37℃下很好地生长，在pH4.5～6.5下生长良好，在pH5.5生长最为适宜。LJ4在24～48h处于对数生长期，会产生较多的乙酸和丁酸，使pH明显下降，从而生长受到影响，启动产醇机制，开始生成乙醇和丁醇。
实施例3丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum LJ4在不同浓度糠醛下生长OD和丁醇产量
菌株LJ4可以在含有糠醛的培养基进行生长，在此以1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L的糠醛浓度下，菌体LJ4生长状况及发酵特性为例进行阐述。
从平板上挑取菌株LJ4单菌落接种到5mL液体培养基中，37℃，120r·min-1培养48h，然后以接种量5％(v/v)接种到发酵培养基中，37℃，120r·min-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5，发酵192h后，菌株生长OD和丁醇产量见图1和图2。
在1g/L、2g/L、3g/L、4g/L糠醛浓度下，菌株LJ4虽延滞期延长，但生长状况良好，未添加抑制物的对照丁醇产量为12g/L，在1g/L、2g/L、3g/L糠醛浓度下丁醇产量稍有下降，分别为11.0g/L、10.8g/L、10.9g/L，在4g/L的糠醛浓度下对丁醇产量影响较大为6.0g/L，在5g/L、8g/L糠醛浓度下，菌株生长被抑制。相比较同类菌株，菌株LJ4对糠醛的耐受性良好，丁醇产量高。
1g/L糠醛浓度下，丁醇转化抑制率8.3％；2g/L糠醛浓度下，丁醇转化抑制率10％；3g/L糠醛浓度下，丁醇转化抑制率9.2％；4g/L糠醛浓度下，丁醇转化抑制率40％；5g/L、8g/L糠醛浓度下，丁醇转化抑制率100％。
其中，液体培养基配方如下：葡萄糖60g/L，NaCl 1g/L，K2HPO4 0.75g/L，KH2PO40.75g/L，酵母粉5g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeCl2·4H2O 1.5g/L，KCl 0.3g/L，调节pH至5.5，糠醛浓度1～8g/L，通氮气10～20min，121℃灭菌15min。
其中，发酵培养基配方如下：葡萄糖60g/L，NaCl 1g/L，K2HPO4 0.75g/L，KH2PO40.75g/L，酵母粉5g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeCl2·4H2O 1.5g/L，KCl 0.3g/L，调节pH至5.5，糠醛浓度1～8g/L，通氮气10～20min，121℃灭菌15min。
实施例4丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum LJ4在不同浓度5-羟甲基糠醛浓度下生长OD和丁醇产量
方法同实施例3，不同的是抑制物为5-羟甲基糠醛(HMF)，发酵培养基中5-羟甲基糠醛的浓度分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L，菌株生长OD和丁醇产量见图3和图4。
在1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L 5-羟甲基糠醛浓度下，菌株LJ4延滞期延长但生长状况良好，未添加抑制物的对照丁醇产量为12g/L，在1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L5-羟甲基糠醛浓度下丁醇产量稍有下降，分别为10.5g/L、10.6g/L、10.3g/L、9.7g/L、9g/L，8g/L 5-羟甲基糠醛浓度下，菌株生长被抑制。相比较其他菌株，菌株LJ4对5-羟甲基糠醛的耐受性良好，丁醇产量高。
1g/L5-羟甲基糠醛浓度下，丁醇转化抑制率12.5％；2g/L5-羟甲基糠醛浓度下，丁醇转化抑制率11.7％；3g/L5-羟甲基糠醛浓度下，丁醇转化抑制率14.2％；4g/L5-羟甲基糠醛浓度下，丁醇转化抑制率19.2％；5g/L5-羟甲基糠醛浓度下，丁醇转化抑制率25％；8g/L5-羟甲基糠醛浓度下，丁醇转化抑制率100％。
实施例5丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum LJ4在不同浓度阿魏酸浓度下生长OD和丁醇产量
方法同实施例3，不同的是抑制物为阿魏酸，发酵培养基中阿魏酸的浓度分别为1g/L、1.5g/L、1.8g/L、1.9g/L、2g/L、3g/L，菌株生长OD和丁醇产量见图5和图6。
在1g/L、1.5g/L、1.8g/L、1.9g/L阿魏酸浓度下，菌株LJ4虽延滞期延长，但生长状况良好，未添加抑制物的对照丁醇产量为12g/L，在1g/L、1.5g/L、1.8g/L阿魏酸浓度下丁醇产量稍有下降，分别为10.6g/L、10.4g/L、10.1g/L，在1.9g/L的阿魏酸浓度下对丁醇产量影响较大，为5.1g/L，在2g/L、3g/L阿魏酸浓度下，菌株LJ4生长被抑制。相比较其他菌株，菌株LJ4对阿魏酸的耐受性良好，丁醇产量高。
1g/L阿魏酸浓度下，丁醇转化抑制率11.7％；1.5g/L阿魏酸浓度下，丁醇转化抑制率13.3％；1.8g/L阿魏酸浓度下，丁醇转化抑制率15.8％；1.9g/L阿魏酸浓度下，丁醇转化抑制率57.5％；2g/L、3g/L阿魏酸浓度下，丁醇转化抑制率100％。
实施例6丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum LJ4在不同浓度对香豆酸浓度下生长OD和丁醇产量
方法同实施例3，不同的是抑制物为对香豆酸，发酵培养基中对香豆酸的浓度分别为1g/L、1.5g/L、1.8g/L、2g/L、3g/L，菌株生长OD和丁醇产量见图7和图8。
在1g/L对香豆酸浓度下，菌株LJ4虽延滞期延长，但生长状况良好，未添加抑制物的对照丁醇产量为12g/L，丁醇产量稍有下降，为9.7g/L，在1.5g/L、1.8g/L、2g/L、3g/L对香豆酸浓度下，菌株生长被抑制。相比较其他菌株，菌株LJ4对对香豆酸的耐受性良好，丁醇产量高。
1g/L对香豆酸浓度下，丁醇转化抑制率19.2％；1.5g/L、1.8g/L、2g/L、3g/L对香豆酸浓度下，丁醇转化抑制率19.2％。
实施例7丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum LJ4在不同浓度香兰素浓度下生长OD和丁醇产量
方法同实施例3，不同的是抑制物为香兰素，发酵培养基中香兰素的浓度分别为1g/L、2g/L、3g/L、4g/L、5g/L、8g/L，菌株生长OD和丁醇产量见图9和图10。
在1g/L、2g/L、3g/L、4g/L香兰素浓度下，菌株虽延滞期延长，但生长状况良好，未添加抑制物的对照丁醇产量为12g/L，在1g/L、2g/L、3g/L、4g/L香兰素浓度下丁醇产量稍有下降，为10.5g/L、10.6g/L、10.3g/L、9.1g/L，在5g/L、8g/L香兰素浓度下，菌株生长被抑制。相比较其他菌株，菌株LJ4对香兰素的耐受性良好，丁醇产量高。
1g/L香兰素浓度下，丁醇转化抑制率12.5％；2g/L香兰素浓度下，丁醇转化抑制率11.7％；3g/L香兰素浓度下，丁醇转化抑制率14.2％；4g/L香兰素浓度下，丁醇转化抑制率24.2％；5g/L、8g/L香兰素浓度下，丁醇转化抑制率100％。
实施例8丙酮丁醇梭菌C.acetobutylicum LJ4利用未脱毒玉米芯水解液发酵丁醇的产量
从平板上挑取菌株LJ4单菌落接种到5mL液体培养基中，37℃，120r·min-1培养48h，然后以接种量5％(v/v)接种到发酵培养基中，37℃，120r·min-1震荡培养，每隔24h调节pH至5.5，发酵192h后丁醇产量见图11。
和未添加抑制物的空白对照相比，菌株LJ4利用不同体积未脱毒的木质纤维素水解液发酵丁醇产量提高。当添加100％的木质纤维素水解液时，菌株LJ4发酵生成丁醇13.9g/L；当添加50％的木质纤维素水解液时，菌株LJ4发酵生成丁醇产量最高，为15.2g/L。推断是由于木质纤维素水解液中成分复杂，存在可以提高丁醇产量的物质，而抑制物浓度低于菌株耐受程度。
发酵培养基配方如下：葡萄糖60g/L，NaCl 1g/L，K2HPO4 0.75g/L，KH2PO4 0.75g/L，酵母粉5g/L，CaCl2·2H2O 0.015g/L，FeCl2·4H2O 1.5g/L，KCl 0.3g/L，调节pH至5.5，通氮气10～20min，121℃灭菌15min。并设置四组实验：第一组为对照组，发酵培养基中不添加抑制物；第二组发酵培养基中添加100％玉米芯水解液，即用玉米芯水解液替换水加入培养基中，最后补加葡萄糖使之与对照组的葡糖糖浓度相同；第三组发酵培养基中添加50％玉米芯水解液；第四组发酵培养基中添加25％玉米芯水解液。
其中，玉米芯水解液中主要成分如下：葡萄糖10g/L、木糖、阿拉伯糖、糠醛1.96g/L、5-羟甲基糠醛2.35g/L、总酚3.08g/L。其中，木质纤维素水解液中成分复杂无法将酚酸类一一测出，采用福林酚测总酚的方法测出，总酚如：阿魏酸、香兰素、对香豆酸等浓度为3.08g/L。
对比例1C.acetobutylicum ATCC824利用未脱毒玉米芯水解液发酵丁醇的产量
方法同实施例8，不同的是丙酮丁醇梭菌为C.acetobutylicum ATCC824，丁醇产量见图12。
序列表
<110> 南京工业大学
<120> 一种丙酮丁醇梭菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1367
<212> DNA
<213> Clostridium acetobutylicum
<400> 1
ggggaacttc ggttcccagc ggcggtcggg tgagtaacac gtgggtaacc tacctcatag 60
tggggaatag cctttcgaaa ggaagattaa taccgcataa tactcgagaa tcgcatgatt 120
cttgagccaa aggattaatt cgctatgaga tggacccgcg gcgcattagc ttgttggtga 180
ggtaacggct caccaaggct tcgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacattg 240
gaactgagac acggtccaga ctcctacggg aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg 300
ggaaaccctg atgcagcaac gccgcgtgag tgatgaaggt cttcggatcg taaaactctg 360
tcttatggga cgataatgac ggtaccatag gaggaagcca cggctaacta cgtgccagca 420
gccgcggtaa tacgtaggtg gcaagcgttg tccggattta ctgggcgtaa aggatgtgta 480
ggcggatatt taagtgagat gtgaaatccc cgggcttaac ttgggggctg catttcaaac 540
tggatgtctg gagtgcagga gaggaaggca gaattcctag tgtagcggtg aaatgcgtag 600
agattaggaa gaataccagt ggcgaaggcg gccttctgga ctgtaactga cgctgaggca 660
tgaaagcgtg gggagcaaac aggattagat accctggtag tccacgccgt aaacgatgaa 720
tactaggtgt aggaggtatc gactccttct gtgccgcagt taacacaata agtattccgc 780
ctgggaagta cggtcgcaag attaaaactc aaaggaattg acggggaccc gcacaagcag 840
cggagcatgt ggtttaattc gaagcaacgc gaagaacctt acctagactt gacatctcct 900
gaattagtcc gtaatggatg aagtcccttc ggggacagga tgacaggtgg tgcatggttg 960
tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttatcat 1020
tagttgctaa catttagttg agcactctag tgagactgcc cgggttaacc gggaggaagg 1080
tggggatgac gtcaaatcat catgcccctt atgtctaggg ctacacacgt gctacaatgg 1140
tggggacaaa aagatgcaat accgcaaggt ggagcaaaac tcaaaacccc atcccagttc 1200
ggattgtagg ctgaaactcg cctacatgaa gccggagttg ctagtaatcg cgaatcagaa 1260
tgtcgcggtg aatacgttcc cgggtcttgt acacaccgcc cgtcacacca tgagagtcgg 1320
caacacccga agcccgtgag gtaacctttt ggaaccagcg tcgaagg 1367

Claims (10)

1.一种丙酮丁醇梭菌，其分类命名为丙酮丁醇梭菌（Clostridium acetobutylicum），菌株号为LJ4，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2017年11月30日，保藏编号为CCTCC NO:M 2017754。
2.权利要求1所述丙酮丁醇梭菌在发酵生产丁醇中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述丙酮丁醇梭菌利用未脱毒的木质纤维素水解液作为碳源发酵生产丁醇。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素水解液为玉米芯水解液。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素水解液中糠醛浓度为0～4g/L。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素水解液中5-羟甲基糠醛浓度为0～5 g/L。
7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素水解液中阿魏酸浓度为0～1.9 g/L。
8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素水解液中对香豆酸浓度为0～1 g/L。
9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述木质纤维素水解液中香兰素浓度为0～4 g/L。
10.根据权利要求2-9任意一项所述的应用，其特征在于，所述发酵条件如下：30～55℃、pH4.5～6.5条件下厌氧发酵72～192 h。
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