CN116223733B

CN116223733B - 一种c5/c6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法

Info

Publication number: CN116223733B
Application number: CN202310006575.3A
Authority: CN
Inventors: 鲍晓明; 徐丽丽; 李晨豪; 赵建志; 韦方卿; 袁嫒
Original assignee: Qilu University of Technology
Current assignee: Qilu University of Technology
Priority date: 2023-01-04
Filing date: 2023-01-04
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2043-01-04
Also published as: CN116223733A

Abstract

本发明涉及一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法，属于生物工程领域。C5/C6共利用酿酒酵母的木糖代谢与鲁棒性之间往往存在此消彼长的拮抗现象，本发明采用协同指数（Synergy Index，SI）定量表征C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度，该指数是乙醇得率比值（RYe/xT，ratio of ethanol yield from xylose to theoretical value）与存活率（Survival rate under stress，SRS）的乘积（即SI=RYe/xT×SRS）。本发明提供的方法可以用于C5/C6共利用酿酒酵母菌株筛选，准确评估C5/C6共利用酿酒酵母菌株的木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度，反映酿酒酵母转化木质纤维素生成乙醇的能力，为提升二代燃料乙醇专用酿酒酵母产业化性能提供了评价方法。

Description

一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法

技术领域

本发明涉及一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法，属于生物工程领域。

背景技术

随着世界经济的不断发展，各国对能源的需求日益增加，传统的化石能源因储量有限，污染环境等缺点，已无法满足当前的社会需求，亟需开发环境友好型可再生资源。利用地球上最丰富的可再生有机资源——木质纤维素生产二代燃料乙醇具有特殊的战略意义，因其主要以农业废弃物和其他非粮作物为原料，避免了“与人争粮、与粮争地” 的问题，契合当前我国“双碳”目标背景下的现实需求。

木质纤维素主要由纤维素、半纤维素以及木质素组成，其中，纤维素是由D-葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键连接而成的线性聚合物，经完全水解生成D-葡萄糖单体，部分水解为纤维二糖、纤维三糖及低聚糖等；半纤维素是指纤维素以外的碳水化合物（少量果胶和淀粉除外），由两种或多种单糖残基组成，具有分支化且无定形特点，其完全水解可生成五碳糖（如木糖、阿拉伯糖等）和六碳糖（如半乳糖、葡萄糖、甘露糖等）以及4-O-甲基葡萄糖醛酸等多种糖单体；木质素是一种芳香族化合物，其苯基丙烷单元通过醚键和碳碳键以非线性的方式连接在一起，木质素与半纤维素共价结合，这种复杂的结构增加了植物细胞壁的强度，导致木质纤维素原料很难被酶或微生物直接利用，因而需要对其进行必要的预处理和酶解，以释放可以被微生物直接利用的糖类组分。然而，预处理过程在破坏纤维素结构的同时，不可避免地产生一系列抑制物，如弱酸类（如甲酸、乙酸及乙酰丙酸等）、呋喃类衍生物（如糠醛、5-羟甲基糠醛（HMF）等）和酚类抑制物（如4-羟基苯甲醛、丁香醛、愈创木酚及香草醛等），这些抑制物能够抑制代谢酶的活性和破坏细胞膜结构稳定性，严重抑制细胞生长并降低糖代谢能力，特别是木糖代谢能力。因此，依据木质纤维素水解液组分特点，发酵微生物在性能上必须具备两个特点，即具有高效的五碳糖/六碳糖（C5/C6）共利用能力和对抑制物具有较高的鲁棒性。

酿酒酵母由于具有较高的发酵葡萄糖产乙醇能力，同时具有较好的抗逆性，基因操作技术成熟，被认为是转化木质纤维素水解液生产燃料乙醇的最具潜力的工业菌株之一，然而由于天然酿酒酵母本身缺乏与木糖代谢有关的酶，所以只能利用葡萄糖，而不能或仅少量非特异性利用木质纤维素原料中含量丰富的木糖，并且，木质纤维素原料在预处理及酶解过程中产生的多种抑制物严重降低了酿酒酵母的发酵性能和乙醇得率，因此，因此，提高酵母的葡萄糖木糖高效同步共利用能力和鲁棒性是利用酿酒酵母高效转化燃料乙醇的基本要求。近几十年来，研究人员通过木糖代谢途径引入、强化磷酸戊糖途径（PPP途径）等内源性下游途径、弱化旁支途径及能源消耗节点等策略，来提高酿酒酵母的糖醇转化率。通过许多理性改造包括改变酶的定向进化基因、转录因子的遗传调控、嘌呤生物合成途径的调控、在抑制物条件下适应性进化等手段，来提高酿酒酵母的对抑制物耐受性。

越来越多的研究随着木糖利用能力的增强，菌株对抑制物的耐受性降低；提高菌株对抑制物的耐受性的同时，其木糖代谢能力也随之下降。如Demeke等报道对木糖利用能力较差、鲁棒性较强的酿酒酵母进行代谢工程改造，菌株的木糖比消耗速率由0.13 g/gDW/h提升至1.1 g/g DW/h，改造后菌株的木糖代谢能力显著提高，但对HMF和乙酸的耐受性明显降低，改造前后菌株的木糖代谢与鲁棒性之间呈现此消彼长现象[Demeke MM,Dumortier F, Li Y, Broeckx T, Foulquié-Moreno MR, Thevelein JM. Combininginhibitor tolerance and D-xylose fermentation in industrial Saccharomyces cerevisiae for efficient lignocellulose-based bioethanol production.Biotechnology for biofuels, 2013, 6(1): 120-120.]。本课题组前期通过理性代谢工程及适应性进化工程构建了一株C5/C6高效共利用重组酿酒酵母菌株LF1，其糖醇转化率可达0.472 g/g，为理论值的 92.5%[ Li H, Shen Y, Wu M, Hou J, Jiao C, Li Z, LiuX, Bao X. Engineering a wild-type diploid Saccharomyces cerevisiae strain forsecond-generation bioethanol production. Bioresour Bioprocess. 2016, 3(1):51.]，但在含较高抑制物浓度的玉米秸秆水解液中鲁棒性较差。为了进一步提高其鲁棒性，又对LF1菌株进行ARTP诱变，采用含有60%预处理液的筛选培养基筛选，然后在含有50%预处理液的培养基和纯木糖培养基（YPX）中交替驯化，筛选得到突变菌株LF1-6M，该菌株对单一或混合抑制物的耐受性有所提高，但木糖代谢能力有所降低；为了进一步恢复菌株的木糖代谢能力，对LF1-6M进行ARTP 迭代诱变，利用木糖唯一碳源的培养基进行厌氧条件筛选，最终得到突变株 6M-15，其对单一抑制物和混合抑制物耐受性均得到明显提高，在YPX中的木糖比消耗速率与 LF1 相近，其葡萄糖和木糖共发酵产乙醇的性能和木糖利用率恢复到与LF1相当，此外在pH为3.5的高抑制物浓度的木质纤维素水解液中，能有效地转化葡萄糖和木糖，说明6M-15保留了良好的木糖利用能力，表现出更好的鲁棒性，其木糖代谢能力和鲁棒性之间的拮抗现象得到缓解[Wei Fangqing, Li Menglei, Wang Ming, LiHongxing, Li Zailu, Qin Wensheng, Wei Tian di, Zhao Jianzhi, Bao Xiaoming. AC6/C5 co-fermenting Saccharomyces cerevisiae strain with the alleviation ofantagonism between xylose utilization and robustness. Global Change BiologyBioenergy, 2020, 13(1): 83-97.]。因此，在提高酿酒酵母菌株鲁棒性的同时往往损失木糖代谢能力，提高菌株木糖代谢能力的同时往往降低了鲁棒性，C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间存在此消彼涨的拮抗现象，目前对这一“拮抗现象”的研究非常有限，经检索，定量表征该拮抗性现象平衡程度的专利和相关文献尚未见报道，本发明提供一种定量表征C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的方法，该方法可用于评估酿酒酵母转化木质纤维素生成乙醇的能力，为解决二代燃料乙醇生产中过程中存在的技术瓶颈提供了理论方法。

发明内容

针对目前二代燃料乙醇生产专用酿酒酵母菌株的木糖代谢与鲁棒性之间呈现此消彼长的拮抗现象，本发明提供一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法。该方法可用于C5/C6共利用酿酒酵母菌株筛选，可准确评估C5/C6共利用酿酒酵母菌株的木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度，反映酿酒酵母转化木质纤维素生成乙醇的能力。

本发明的技术方案如下：

一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法，采用协同指数（Synergy Index，SI）定量表征C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度，该指数是乙醇得率比值（RYe/xT，ratio of ethanol yield from xylose totheoretical value）与存活率（Survival rate under stress，SRS）的乘积（即SI=RYe/xT× SRS）。

所述RYe/xT是指在C5/C6共利用酿酒酵母以木糖为唯一碳源培养条件下进行限氧摇瓶发酵，利用木糖的实际乙醇得率与理论乙醇得率的比值，即，该数值反映C5/C6共利用酿酒酵母的木糖代谢产乙醇能力，数值越高，表明利用木糖产乙醇的能力越强。

所述的理论乙醇得率为0.51 g g^-1 total xylose。

所述SRS是指C5/C6共利用酿酒酵母在含有抑制物的胁迫条件下的最大比生长速率（μ _max）与在标准葡萄糖培养基中μ _max的比值（即），该数值反映C5/C6共利用酿酒酵母的鲁棒性，数值越高，表明菌株对木质纤维素预处理液中的抑制物耐受性越高。

所述抑制物，包括弱酸类抑制物、呋喃醛类抑制物、酚类化合物、阿魏酸、对香豆酸。

进一步地，具体包括以下步骤：

（1）限氧摇瓶发酵：将C5/C6共利用酿酒酵母菌株分别接种至以木糖为唯一碳源的培养基、以葡萄糖为唯一碳源的标准培养基和含有抑制物的培养基中，分别进行限氧摇瓶发酵；

（2）取样并测定相关指标：从步骤（1）的三种发酵液中取样，分别测定以木糖为唯一碳源的培养基发酵的木糖和抑制物的含量，测定以葡萄糖为唯一碳源的标准培养基和含有抑制物的培养基中的OD₆₀₀；

（3）计算：根据步骤（2）所得木糖和抑制物的含量，计算木糖的实际乙醇得率，然后除以理论乙醇得率0.51 g g^-1 total xylose，计算得到RYe/xT；根据步骤（2）所测OD₆₀₀，采用对数生长期的ln(OD₆₀₀)对应时间的线性回归斜率，分别计算C5/C6共利用酿酒酵母在标准培养基和含有抑制物的培养基中的μ _max，根据公式计算得到SRS；将RYe/xT与SRS相乘，计算得到SI值。

进一步地，所述以木糖为唯一碳源的培养基是指在酵母基础（MM）培养基、合成（SC）培养基（包括各种氨基酸缺陷型培养基）、YP培养基中添加木糖。

进一步地，所述以葡萄糖为唯一碳源的标准培养基是指在酵母基础（MM）培养基、合成（SC）培养基（包括各种氨基酸缺陷型培养基）、YP培养基中添加葡萄糖。

进一步地，所述含有抑制物的培养基是指在酵母基础（MM）培养基、合成（SC）培养基（包括各种氨基酸缺陷型培养基）、YP培养基中添加葡萄糖和一种或多种木质纤维素预处理液中的典型抑制物，包括甲酸、乙酸及乙酰丙酸等弱酸类抑制物、糠醛和HMF等呋喃醛类抑制物、香草醛等酚类化合物、以及阿魏酸、对香豆酸等。

进一步地，所述SI值越接近于1，说明C5/C6共利用酿酒酵母菌株在木糖代谢与鲁棒性之间的拮抗程度越低，即拮抗现象平衡程度越高。

进一步地，拮抗现象缓解（即SI值提高）有三种情况：一种情况是RYe/xT和SRS均提高，SI值表现为提高；另一种情况是RYe/xT 提高，SRS微弱降低，SI值表现为提高；还有一种情况是RYe/xT微弱降低，SRS提高，SI值也表现为提高。

本发明产生的具体效果如下：

（1）能够表征C5/C6共利用酿酒酵母的木糖代谢能力。

（2）能够表征C5/C6共利用酿酒酵母对木质纤维素水解液中典型抑制物的耐受性。

（3）能够表征不同C5/C6共利用酿酒酵母菌株的木糖代谢能力与鲁棒性之间的拮抗程度。

（4）能够反映C5/C6共利用酿酒酵母菌株的酿酒酵母转化木质纤维素生成乙醇的能力。

（5）能够用于缓解木糖代谢与鲁棒性之间拮抗现象的C5/C6共利用酿酒酵母菌株筛选。

附图说明

图1为实施例1中C5/C6共利用酿酒酵母工业菌株LF1、LF1-6M和6M-15在YPX、YPD和含有3 g/L乙酸的YPD中的发酵性能测试（，OD₆₀₀; ◆，木糖; ●，乙醇）。(a)为在YPX培养基中的生长曲线图；(b)为在YPX培养基木糖消耗及乙醇产生情况图；(c)为在YPD中的生长曲线图；(d) 为在含有3 g/L乙酸的YPD中的生长曲线图。

图2为实施例2中C5/C6共利用酿酒酵母实验室菌株BSPX045和mal33Δ在YPX、YPD和含有3 g/L乙酸的YPD中的发酵性能测试（，OD₆₀₀; ◆，木糖; ●，乙醇）。(a)为在YPX培养基中的生长曲线图；(b)为在YPX培养基木糖消耗及乙醇产生情况图；(c)为在YPD中的生长曲线图；(d) 为在含有3 g/L乙酸的YPD中的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合具体附图和实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，应该说明的是，下述说明仅仅是为了解释本发明，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。

下述实施例中涉及的培养基和实验材料概述：

1. 酿酒酵母培养基

YP培养基：20 g/L蛋白胨，10 g/L酵母粉，灭菌条件：115 ℃，30 min。

SC-Ura营养缺陷培养基：Yeast Nitrogen Base 6.7 g，不含尿嘧啶的氨基酸混合物0.77 g，加蒸馏水至1000 mL，调整pH 6.0~7.0，115 ℃，30 min。

YPX或SC-Ura-X培养基：在灭菌的YP或SC-Ura培养基中加入无菌40%木糖母液至终浓度2%或4%。

标准培养基（YPD或SC-Ura）培养基：在灭菌的YP或SC-Ura培养基中加入无菌 40%葡萄糖母液至终浓度2%。

含3 g/L乙酸的YPD或SC-Ura培养基：YPD或SC-Ura培养基中加入无菌的乙酸至终浓度3 g/L。

2. 实验材料

实施例中所用C6/C5共利用酿酒酵母工业菌株为实验室前期构建的木糖代谢能力较强的菌株LF1（菌种保藏号：CGMCC No.11331）、鲁棒性较强的菌株LF1-6M、木糖代谢能力和鲁棒性介于LF1和LF1-6M之间的菌株6M-15（保藏号菌种CGMCC No.20436，CN 112375694B）；实施例中所用C6/C5共利用酿酒酵母实验室菌株BSPX045和mal33Δ为实验室保存的具有C5/C6共利用能力的单倍体酿酒酵母（CN 113980993 B），mal33Δ是以BSPX045为出发菌株敲除了MAL33基因（该基因是MAL基因的激活因子，调节麦芽糖通透酶基因MAL31和麦芽糖酶基因MAL32的表达）。

下述实施例中所使用的材料、试剂等如无特殊说明均从商业途径得到。

实施例1：利用SI指数量化表征C5/C6共利用酿酒酵母工业菌株LF1、LF1-6M和6M-15木糖代谢与乙酸耐受性之间的拮抗程度

（1）LF1、LF1-6M和6M-15在YPX中的发酵性能测试

挑取菌株LF1、LF1-6M和6M-15的单菌落接种到5 mL YPX液体培养基，30°C，200rpm培养24 h，再转接至10 mL YPX液体培养基二次活化12 h。将活化菌种分别接种至40 mLYPX液体培养基中，在30°C，200 rpm进行限氧摇瓶发酵，取样测定OD₆₀₀，绘制生长曲线, 并利用高效液相色谱法分析发酵液中的木糖和乙醇含量。结果显示，LF1和6M-15在YPX 中生长情况基本相当，20 h 进入稳定期，20 h内分别产生了17.241 g/L和14.893 g/L乙醇，实际乙醇得率分别为0.443和0.389 g/g total xylose；与LF1和6M-15相比，LF1-6M的延滞期略长，32 h进入稳定期，20 h仅消耗了22.469 g/L木糖，乙醇产量为7.094 g/L，实际乙醇得率为0.182 g/g total xylose（图1a和b，表1）。

（2）LF1、LF1-6M和6M-15在YPD中的生长情况测定

挑取菌株LF1、LF1-6M和6M-15的单菌落接种到5 mL YPD液体培养基，30°C，200rpm培养24 h，再转接至10 mL YPD液体培养基二次活化12 h。将活化菌种分别接种至40 mLYPD液体培养基中，30°C，200 rpm进行限氧摇瓶发酵，取样测定OD₆₀₀，绘制生长曲线，采用对数生长期的 ln(OD₆₀₀)对应时间的线性回归斜率计算μ _max，结果显示，LF1-6M生长最快，延滞期最短，在13 h的OD₆₀₀能达到25左右，μ _max为0.464/h，其次是LF1和6M-15，两者的生长情况相当，在13 h的OD₆₀₀在20左右，μ _max分别为0.429/h和0.424/h（图1c，表1）。

（3）LF1、LF1-6M和6M-15在3 g/L乙酸中的生长情况测定

挑取菌株LF1、LF1-6M和6M-15的单菌落接种到5 mL YPD液体培养基，30°C，200rpm培养24 h，再转接至10 mL YPD液体培养基二次活化12 h。将活化菌种分别接种至40 mL含有3 g/L乙酸的YPD液体培养基中，30°C，200 rpm进行限氧摇瓶发酵，取样测定OD₆₀₀，绘制生长曲线，采用对数生长期的 ln(OD₆₀₀)对应时间的线性回归斜率计算μ _max。结果显示，LF1-6M在乙酸中的生长情况最好，延滞期最短，μ _max为0.334；其次是6M-15，其延滞期比LF1-6M和LF1略长，但进入稳定期后的OD₆₀₀值比LF1略高LF1，μ _max为0.363；LF1进入稳定期后的OD₆₀₀值最低，μ _max为0.296（图1d，表1）。

表1 实施例1中LF1、LF1-6M和6M-15的RYe/xT、SRS及SI值计算。

（4）LF1、LF1-6M和6M-15的RYe/xT、SRS及SI值计算

RYe/xT值计算：将菌株LF1、LF1-6M和6M-15的实际乙醇得率分别除以理论乙醇得率，计算获得这三个菌株的RYe/xT值分别为0.867、0.356和0.761（表1），说明木糖代谢能力最高的是LF1，最低的是LF1-6M，6M-15介于LF1和6M-15之间。

SRS值计算：将 LF1、LF1-6M和6M-15在3 g/L乙酸中的μ _max除以YPD中的μ _max，计算获得这三个菌株的SRS值分别为0.69、0.72和0.856（表1），说明对乙酸的耐受性最高的是6M-15，最低的是LF1，LF1-6M介于LF1和6M-15之间。

SI值计算：将LF1、LF1-6M和6M-15的RYe/xT值分别乘以相应的SRS值，计算获得这三个菌株的SI值分别为0.598、0.256和0.651，与LF1相比，6M-15的RYe/xT虽略有下降，但其SRS显著高于LF1，因此SI值高于LF1；而虽然LF1-6M的SRS略高于LF1，但由于其RYe/xT显著降低，其SI值也没有高于LF1（表1），说明木糖代谢产乙醇和对乙酸耐受性之间的拮抗平衡程度最高的是6M-15，其次是LF1，LF1-6M的木糖代谢产乙醇和对乙酸耐受性之间的拮抗最明显，这与其在木质纤维素预处理液中的发酵表型一致，说明SI指数可量化表征木糖代谢与乙酸耐受性之间的拮抗程度。

实施例2：成功利用SI指数挖掘验证能缓解C5/C6共利用酿酒酵母的木糖代谢与乙酸性之间拮抗现象的功能基因MAL33

（1）BSPX045和mal33Δ在YPX中的发酵性能测试

挑取菌株BSPX045和mal33Δ的单菌落接种到5 mL SC-Ura-X液体培养基，30°C，200 rpm培养24 h，再转接至10 mL SC-Ura-X液体培养基二次活化12 h。将活化菌种分别接种至40 mL SC-Ura-X液体培养基中，在30°C，200 rpm进行限氧摇瓶发酵，取样测定OD₆₀₀，绘制生长曲线, 并利用高效液相色谱法分析发酵液中的木糖和乙醇含量。结果显示，BSPX045和mal33Δ在SC-Ura-X中生长情况基本相当，30 h利用完所有木糖，分别产生了8.011 g/L和8.051 g/L乙醇，实际乙醇得率分别为0.395和0.405 g/g total xylose（图2a和b，表2）。

表2 实施例2中BSPX045和mal33Δ的计算RYe/xT、SRS及SI值计算

（2）BSPX045和mal33Δ在YPD中的生长情况测定

挑取菌株BSPX045和mal33Δ的单菌落接种到5 mL SC-Ura液体培养基，30°C，200rpm培养24 h，再转接至10 mL SC-Ura液体培养基二次活化12 h。将活化菌种分别接种至40mL SC-Ura液体培养基中，30°C，200 rpm进行限氧摇瓶发酵，取样测定OD₆₀₀，绘制生长曲线，采用对数生长期的 ln(OD₆₀₀)对应时间的线性回归斜率计算μ _max，结果显示，BSPX045和mal33Δ的生长情况相当，在18 h达到稳定期，μ _max分别为0.25/h和0.254/h（图2c，表2）。

（3）BSPX045和mal33Δ在3 g/L乙酸中的生长情况测定

挑取菌株BSPX045和mal33Δ的单菌落接种到5 mL SC-Ura液体培养基，30°C，200rpm培养24 h，再转接至10 mL SC-Ura液体培养基二次活化12 h。将活化菌种分别接种至40mL含有3 g/L乙酸的SC-Ura液体培养基中，30°C，200 rpm进行限氧摇瓶发酵，取样测定OD₆₀₀，绘制生长曲线，采用对数生长期的 ln(OD₆₀₀)对应时间的线性回归斜率计算μ _max，结果显示，mal33Δ在乙酸中的生长情况明显好于BSPX045，延滞期较短，μ _max为0.199；而BSPX045的μ _max仅为0.044（图2d，表2）。

（4）BSPX045和mal33Δ的RYe/xT、SRS及SI值计算

RYe/xT值计算：将菌株BSPX045和mal33Δ的实际乙醇得率分别除以理论乙醇得率，计算获得RYe/xT分别为0.775和0.794（表2），说明敲除MAL33基因对酿酒酵母的木糖代谢影响不大。

SRS值计算：将菌株BSPX045和mal33Δ在3 g/L乙酸中的μ _max除以SC-Ura中的μ _max，计算获得SRS分别为0.176和0.783（表2），说明敲除MAL33基因显著提高了酿酒酵母对乙酸的耐受性。

SI值计算：将BSPX045和mal33Δ的RYe/xT值分别乘以相应的SRS值，计算获得这两个菌株的SI值分别为 0.136和0.622，mal33Δ的RYe/xT值与BSPX045相当，但其SRS显著高于BSPX045，因此SI值显著高于BSPX045；（表2），说明SI指数可量化表征BSPX045和mal33Δ的木糖代谢与乙酸耐受性之间的拮抗程度，我们成功利用该指数挖掘验证到了能缓解C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与乙酸性之间拮抗现象的功能基因MAL33。

Claims

1.一种C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度的定量表征方法，其特征在于，采用协同指数SI定量表征C5/C6共利用酿酒酵母木糖代谢与鲁棒性之间拮抗程度，协同指数SI是乙醇得率比值RYe/xT与SRS存活率的乘积；即SI=RYe/xT ×SRS；

所述RYe/xT是指在C5/C6共利用酿酒酵母以木糖为唯一碳源培养条件下进行限氧摇瓶发酵，利用木糖的实际乙醇得率与理论乙醇得率的比值，即RYe/xT =；

所述SRS是指C5/C6共利用酿酒酵母在含有抑制物的胁迫条件下的最大比生长速率（μ _max）与在标准葡萄糖培养基中μ _max的比值（即SRS =）；

所述的理论乙醇得率为0.51 g g^-1 total xylose；

所述SI值越接近于1，说明C5/C6共利用酿酒酵母菌株在木糖代谢与鲁棒性之间的拮抗程度越低，即拮抗现象平衡程度越高。

2.根据权利要求1所述的定量表征方法，其特征在于，所述抑制物为弱酸类抑制物。

3.根据权利要求1所述的定量表征方法，其特征在于，其特征在于，具体包括以下步骤：

4.根据权利要求3所述的定量表征方法，其特征在于，所述以葡萄糖为唯一碳源的培养基是指在酵母基础MM培养基、合成SC培养基、YP培养基中添加葡萄糖。

5.根据权利要求3所述的定量表征方法，其特征在于，所述以木糖为唯一碳源的培养基是指在酵母基础MM培养基、合成SC培养基、YP培养基中添加木糖。

6.采用权利要求1-5任一项所述的表征方法用于筛选缓解木糖代谢与鲁棒性之间拮抗现象的C5/C6共利用酿酒酵母。

7.利用权利要求1-5任一项所述的表征方法用于挖掘并验证能缓解C5/C6共利用酿酒酵母的木糖代谢与乙酸的耐受性之间拮抗现象的功能基因。