CN105713851B - 一株拜氏梭菌及其应用 - Google Patents

一株拜氏梭菌及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN105713851B
CN105713851B CN201410731297.9A CN201410731297A CN105713851B CN 105713851 B CN105713851 B CN 105713851B CN 201410731297 A CN201410731297 A CN 201410731297A CN 105713851 B CN105713851 B CN 105713851B
Authority
CN
China
Prior art keywords
clostridium beijerinckii
butanol
fermentation
enzymolysis liquid
detoxification
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN201410731297.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN105713851A (zh
Inventor
李福利
张全
刘自勇
曹长海
田磊
刘振
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
China Petroleum and Chemical Corp
Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Original Assignee
China Petroleum and Chemical Corp
Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by China Petroleum and Chemical Corp, Sinopec Fushun Research Institute of Petroleum and Petrochemicals filed Critical China Petroleum and Chemical Corp
Priority to CN201410731297.9A priority Critical patent/CN105713851B/zh
Publication of CN105713851A publication Critical patent/CN105713851A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN105713851B publication Critical patent/CN105713851B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Landscapes

  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一株高产丁醇的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.9354。本发明的拜氏梭菌CM20可以利用经氢氧化钙脱毒后的木质纤维素酶解液发酵高产丁醇，总溶剂产量可达19g/l，具有糖利用率高，丁醇产量高等特点，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题。

Description

一株拜氏梭菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株高产丁醇的拜氏梭菌及其在以木质纤维素原料发酵生产丁醇中的应用。
背景技术
丁醇是一种重要的有机化工原料，在化工、医药和石油等工业部门有广泛的用途。而且作为一种有潜力的可以替代汽油的可再生生物能源，丁醇越来越受到世界各国的关注。
丁醇的生产工艺主要有化学合成法和微生物发酵法两种。随着石油资源的日益枯竭，采用以石油为原料丙烯羰基合成法生产丁醇已举步维艰，而且由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。
其中菌株和原料问题一直是困扰丁醇发酵的瓶颈。近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕菌种诱变选育，寻找合适的纤维原料及其糖液制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等方面进行。目前工业上用于丁醇生产的菌株主要是丙酮丁醇梭菌和拜氏梭菌。丙酮丁醇梭菌对抑制剂耐受性低，因此主要用于对淀粉类和糖类的发酵生产丁醇。拜氏梭菌对环境适应性好，但糖的利用率较低，因此丁醇产量不高，需要通过生物技术手段提高拜氏梭菌的糖摄取量。Mermelstein 等(Biotechnol.Bioeng.1993，42:176-183) 利用基因工程技术构建了重组菌株，丁醇产量比出发菌株提高了37％。可见，进行菌株改良是提高丁醇产量，增强发酵竞争力的关键手段之一。
由于我国人口众多，用传统的原料( 玉米和甘蔗) 发酵生产丁醇势必会造成与人争粮的问题，造成粮食短缺，因此开展以可再生的生物质材料为原料生物转化生产生物丁醇是符合国情的研究方向。木质纤维素类农业副产物，蕴含大量的纤维素，作为可再生资源，越来越受到关注。
CN201210089406.2公开了一株高产丁醇的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）Y-3，该菌是通过对出发菌株Clostridium beijerinckii NCIMB8052采用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变获得的突变株，可以木糖渣为原料制备生物丁醇，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题。但是，在以木糖渣酶解液为碳源时，总溶剂产量为16g/L，丁醇产量为8.2g/L。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一株拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20及其应用。该菌株可以利用经氢氧化钙脱毒后的木质纤维素酶解液发酵高产丁醇，具有糖利用率高，丁醇产量高等特点。
本发明高产丁醇的拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9354。
本发明所述拜氏梭菌CM20的筛选方法，是将出发菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052（购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心）经紫外诱变后，利用淀粉平板和葡萄糖平板筛选得到高活力产丁醇菌株，再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、乙醇的目标菌株。
本发明所述拜氏梭菌CM20在生产丁醇中的应用。
本发明所述拜氏梭菌CM20在以木质纤维素为原料发酵生产丁醇中的应用，包括如下内容：
（1）将木质纤维素原料进行预处理；
（2）对预处理后的原料进行酶解，获得含多组份糖的酶解液；
（3）利用氢氧化钙对酶解液进行脱毒处理；
（4）以脱毒后的酶解液为碳源，补加营养元素配成P2发酵培养基；
（5）将拜氏梭菌CM20接种至发酵培养基中，发酵制备生物丁醇。
步骤（1）所述的木质纤维素原料含有纤维素、半纤维素以及木质素，可以采用秸秆、木屑、能源植物等，优选采用玉米秸秆。所述预处理方式可以采用一切可提高木质纤维素酶解性能的物理、化学和热化学技术，包括机械粉碎、辐射、微波、酸处理、碱处理、蒸汽爆破预处理和溶剂预处理，或上述方法的组合预处理等，优选采用蒸汽爆破预处理。蒸汽爆破预处理具体如下：将切碎的玉米秸秆装入汽爆罐，在1.2-1.7MPa的压力下维持5-10分钟，瞬间减压释放，即得到汽爆秸秆。
步骤（2）将预处理后的木质纤维素原料和pH为4.0-5.0，浓度为0.1-0.5M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按固液比10%-15%（w/v）混合，经过脱氧处理后高压灭菌，然后加入纤维素酶进行酶解。所述纤维素酶为诺维信公司生产的用于转化木质纤维素原料的BiomassKit，其中包括纤维素酶复合物(NS 50013) 和β-葡萄糖苷酶(NS 50010)，纤维素酶的加入量为500IU/g汽爆秸秆，酶解的pH值为4.8-5.0，温度为45-55℃。
步骤（3）采用直接加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH至10-11，于50℃，110rpm摇床中振荡1小时，离心后去除沉淀，液体即为脱毒后的酶解液。
步骤（4）以脱毒后的酶解液为发酵培养基的碳源，控制培养基中还原糖浓度为60-80g/L，补加营养元素配成P2发酵培养基。
步骤（5）发酵条件为厌氧发酵，接种量为5%-10%（v/v），发酵温度为33-37℃，发酵时间为72-84小时，即得到生物溶剂（丙酮，丁醇和乙醇）。
本发明以拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052为出发菌株，经紫外诱变获得突变菌CM20，利用突变株发酵氢氧化钙脱毒后的木质纤维素酶解液，总溶剂（丁醇、丙酮和乙醇）产量可达19g/L，明显高于原始菌株13.1g/L，也高于相同条件下以葡萄糖为碳源时的总溶剂产量（16g/L）。本发明拜氏梭菌CM20在以木质纤维素为原料发酵生产丁醇的总溶剂产量明显增加，稳定性好，对利用木质纤维素原料生产丁醇的大规模工业应用具有重要意义。
生物材料保藏说明
本发明提供的拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii）CM20菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号 中国科学院微生物研究所；保藏编号：CGMCC No. 9354；保藏日期： 2014年06月17日。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
实施例1 拜氏梭菌CM20菌株的紫外诱变筛选过程
将出发菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052（购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心）经紫外诱变后，利用淀粉葡萄糖固体平板筛选得到高活力菌株，再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、乙醇的目标菌株。
具体过程如下：以Clostridium beijerinckii NCIMB 8052为出发菌株，首先在P2（葡萄糖为底物）液体发酵培养基中培养，待生长至指数期后，取600微升菌液，在厌氧条件下进行诱变，紫外诱变条件为UV：15W，高度：10cm，时间：2-3min。诱变后的菌液适当稀释涂布筛选平板，挑选淀粉圈大的突变株继续诱变，经过若干轮的诱变，获得一株活性高的突变株，命名为CM20。
淀粉葡萄糖固体平板：在P2发酵培养基添加1wt%的琼脂，碳源是2wt%淀粉和4wt%葡萄糖混合物。
以葡萄糖为碳源，葡萄糖含量为60g/L，补加以下营养元素配成P2发酵培养基：酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01 g/L，对氨基苯甲酸0.001 g/L，维生素B1 0.001 g/L，生物素0.0001g/L，调节pH至6~7，接种量5%（v/v）。获得的突变株CM20和出发菌株NCIMB 8052发酵72h结束后，糖利用率和丙酮丁醇产量比较如表1所示。
表1 突变株CM20和出发菌株NCIMB 8052发酵效果比较
菌株 总溶剂产量，g/l 丁醇产量，g/l 糖利用量，g/l
CM20 16.4 11.1 55
NCIMB 8052 12.9 7.8 42
由表1可知，以葡萄糖为碳源时，丁醇产量为11.1g/l，比原始菌株的7.8g/l高出了3.3g/l，相较原始菌株，丁醇产量提高了42%。
实施例2 拜氏梭菌CM20菌株的传代稳定性
在以葡萄糖为碳源的P2发酵培养基中，检测拜氏梭菌CM20的传代稳定性。
在7次连续转接培养中，CM20利用葡萄糖为碳源生产丁醇与总溶剂的产量比较稳定，具有良好的传代稳定性，具体结果如表2所示。
表2 突变株CM20的传代稳定性检测结果
以葡萄糖为碳源时，总溶剂产量为15.3-17.6g/l，丁醇产量为10.6-12.1g/l，说明该突变株CM20遗传性状稳定。
实施例3 突变株CM20 16sRNA的序列鉴定和菌株鉴定
以葡萄糖为碳源的P2发酵培养基培养突变株CM20，对数生长期时涂布平板，得到单克隆，无菌牙签挑单克隆至PCR管内作为PCR模板，进行16sRNA的序列的扩征，引物选用通用引物，27F：AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG和1492r：TAC GGY TAC CTT GTT ACG ACT T。PCR循环条件是：95℃，10min；95℃，20s；55℃，20s；72℃，1min；32个循环；72℃，10min。扩增出的条带送华大基因公司测序，序列用NCBI网站进行比对，序列和Clostridium beijerinckii NCIMB8052的16sRNA有100%的相似性，证明突变株是Clostridium beijerinckii。
实施例4 采用玉米秸秆对突变株CM20产丁醇能力进行检测
（1）将玉米秸秆进行预处理：将切碎的玉米秸秆装入汽爆罐，在1.5MPa的压力下维持5分钟，瞬间减压释放，即得到汽爆秸秆，主要由纤维素、半纤维素以及木质素组成。
（2）对汽爆秸秆进行酶解：预处理后的玉米秸秆和pH为4.0，浓度为0.1M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按固液比10%（w/v）混合，经脱氧处理后于115℃灭菌20min。待冷却至室温后，加入纤维素酶（500IU/g汽爆秸秆），于50℃、110rpm摇床酶解72h。所述纤维素酶为诺维信公司生产的用于转化木质纤维素原料的Biomass Kit，其中包括纤维素酶复合物(NS50013) 和β-葡萄糖苷酶(NS 50010)，酶解pH值为4.5。
水解液中还原糖浓度的检测主要使用3,5-二硝基水杨酸（DNS）法。将样品还原糖浓度稀释至1.5g/l以下，取稀释后溶液150µl，加入DNS 200µl，沸水煮10min，冷却后向反应液中加入1ml蒸馏水，取350µl于酶标板中，540nm下测吸光度。以0、0.25、0.5、0.75、1、1.25、1.5g/l的葡萄糖为标准样品，以DNS法测得的吸光度值与糖浓度绘制标准曲线，根据标准曲线计算所得样品还原糖的量。
标准曲线为：y=0.012+0.655×(A-A0)，R2=0.9964；
其中，A0为空白吸光度，A为样品吸光度，y为水解液中还原糖含量。
根据标准曲线，测得酶解液中还原糖浓度为90g/l左右，加水稀释至还原糖浓度为60g/l。
（3）利用氢氧化钙对酶解液进行脱毒处理：直接加入氢氧化钙固体调节酶解液的pH至10.5，于50℃，110rpm摇床中1h，离心后去除沉淀，液体即为脱毒后的酶解液。主要原理为：弱碱性的Ca(OH)2能够中和部分低分子量的有机酸，处理过程中形成的钙盐沉淀能够吸附部分抑制剂，通过离心的方式得以分离，且Ca2+能够增强细胞膜稳定性，对细胞内糖运输相关基因、产溶剂相关基因都有重要影响。
（4）以酶解液为碳源，控制还原糖浓度为60g/L，补加以下营养元素配成P2发酵培养基：酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2 g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01 g/L，对氨基苯甲酸0.001 g/L，维生素B1 0.001 g/L，生物素0.0001g/L，调节pH至6~7。
（5）将拜氏梭菌CM20按照5%的接种量接种至发酵培养基中，发酵制备生物丁醇：发酵条件为厌氧发酵，发酵温度为37℃，发酵72小时，即得到生物溶剂（丙酮，丁醇和乙醇）。
以脱毒酶解液为碳源时，相对于原始菌株，总溶剂产量从13.1g/l提高到19g/l，丁醇产量从8.7g/l提高到11.8g/l。
比较例1
采用本发明的突变株CM20，处理步骤及操作条件同CN201210089406.2实施例5，以木糖渣为原料。发酵结束后，总溶剂产量为16.5g/l，丁醇含量为9.3g/l。
比较例2
处理步骤及操作条件与实施例4相同，不同之处在于：酶解液不进行脱毒，直接用于发酵。以未脱毒酶解液为碳源时，发酵结束后，相对于原始菌株，总溶剂产量从8.1g/l提高到9.7g/l，丁醇产量从5.7g/l提高到6.9g/l。

Claims (10)

1.一株拜氏梭菌CM20，其分类命名为拜氏梭菌（Clostridium beijerinckii），已于2014年06月17日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No. 9354。
2.权利要求1所述的拜氏梭菌CM20在生产丁醇中的应用。
3.权利要求1所述的拜氏梭菌CM20在以木质纤维素为原料发酵生产丁醇中的应用，其特征在于包括如下内容：
（1）将木质纤维素原料进行预处理；
（2）对预处理后的原料进行酶解，获得含多组份糖的酶解液；
（3）利用氢氧化钙对酶解液进行脱毒处理；
（4）以脱毒后的酶解液为碳源，补加营养元素配成P2发酵培养基；
（5）将拜氏梭菌CM20接种至发酵培养基中，厌氧发酵制备生物丁醇。
4.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（1）所述木质纤维素原料采用玉米秸秆，预处理采用蒸汽爆破预处理。
5.按照权利要求4所述的应用，其特征在于：蒸汽爆破预处理具体为：将切碎的玉米秸秆装入汽爆罐，在1.2-1.7MPa的压力下维持5-10分钟，瞬间减压释放，即得到汽爆秸秆。
6.按照权利要求3或5所述的应用，其特征在于：预处理后的木质纤维素原料和pH为4.0-5.0，浓度为0.1-0.5M的柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液按固液质量体积比10%-15%混合，经过脱氧处理后高压灭菌，然后加入纤维素酶进行酶解。
7.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（2）所述纤维素酶包括纤维素酶复合物和β-葡萄糖苷酶，纤维素酶的加入量为500IU/g汽爆秸秆，酶解的pH 值为4.8-5.0，温度为45-55℃。
8.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（3）采用直接加入氢氧化钙固体颗粒调节酶解液的pH 至10-11，于50℃，110rpm摇床中振荡1小时, 离心后去除沉淀，液体即为脱毒后的酶解液。
9.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（4）以脱毒后的酶解液为发酵培养基的碳源，控制培养基中还原糖浓度为60-80g/L，补加营养元素配成P2发酵培养基。
10.按照权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤（5）发酵条件为厌氧发酵，接种量体积比为5%-10%，发酵温度为33-37℃，发酵时间为72-84小时。
CN201410731297.9A 2014-12-05 2014-12-05 一株拜氏梭菌及其应用 Active CN105713851B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410731297.9A CN105713851B (zh) 2014-12-05 2014-12-05 一株拜氏梭菌及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201410731297.9A CN105713851B (zh) 2014-12-05 2014-12-05 一株拜氏梭菌及其应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN105713851A CN105713851A (zh) 2016-06-29
CN105713851B true CN105713851B (zh) 2019-06-11

Family

ID=56144501

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201410731297.9A Active CN105713851B (zh) 2014-12-05 2014-12-05 一株拜氏梭菌及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN105713851B (zh)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN106467920B (zh) * 2015-08-17 2020-04-14 中国石油化工股份有限公司 一种淀粉同步糖化发酵生产丁醇的方法
CN108118071B (zh) * 2016-11-29 2021-05-04 中国石油化工股份有限公司 一种提高发酵生产丁醇产量的方法
CN106754553B (zh) * 2017-01-23 2020-04-03 天津大学 利用木糖生产丁醇的拜氏梭菌及应用
CN115058361B (zh) * 2022-06-14 2023-06-09 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 一种拜氏梭菌及其生产丁醇的方法

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533612A (zh) * 2012-02-16 2012-07-04 广西科学院 拜氏梭菌菌株及其筛选方法和应用
CN102719371A (zh) * 2012-03-30 2012-10-10 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 拜氏梭菌及其以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法
CN103320358A (zh) * 2013-06-13 2013-09-25 中南林业科技大学 一株用于燃料丁醇发酵的拜氏梭菌 u-57及其应用方法

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102533612A (zh) * 2012-02-16 2012-07-04 广西科学院 拜氏梭菌菌株及其筛选方法和应用
CN102719371A (zh) * 2012-03-30 2012-10-10 中国科学院青岛生物能源与过程研究所 拜氏梭菌及其以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法
CN103320358A (zh) * 2013-06-13 2013-09-25 中南林业科技大学 一株用于燃料丁醇发酵的拜氏梭菌 u-57及其应用方法

Also Published As

Publication number Publication date
CN105713851A (zh) 2016-06-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN102719371B (zh) 拜氏梭菌及其以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法
CN106636226B (zh) 一种以木质纤维素为原料发酵制备丁醇的方法
CN101215582B (zh) 利用秸秆原料发酵生产琥珀酸的方法
CN102321722B (zh) 一种利用餐厨垃圾生产燃料乙醇的方法
CN103667110B (zh) 一株凝结芽孢杆菌及使用该菌同步糖化共发酵木质纤维素生产乳酸的集成工艺
CN102424831B (zh) 一种利用餐厨垃圾生产乳酸的方法
CN102174433B (zh) 一株高抗逆性贝氏梭菌及其应用
CN101974436A (zh) 一种木质纤维素降解菌及其应用
CN102321671B (zh) 一种生物预处理木质纤维素及同步糖化发酵产氢的方法
CN106811438B (zh) 一种秸秆降解酸化菌剂及其制备方法
CN105713851B (zh) 一株拜氏梭菌及其应用
CN102766615B (zh) 一种利用芽孢杆菌制备纤维素酶的方法
CN106957876B (zh) 一种利用木质纤维素原料发酵制备丁醇的方法
CN106554931A (zh) 一株拜氏羧菌及其应用
CN101613722B (zh) 一种利用纤维素类原料发酵生产乙醇和丁二酸的方法
CN112029681B (zh) 一种酒糟腐熟专用液态复合菌剂的制备
CN106957875B (zh) 一种利用木质纤维素原料发酵生产丁醇的方法
CN102220386B (zh) 一种以浮萍为原料高效生产燃料丁醇的方法
JP2011115110A (ja) クロストリジウム属微生物を利用したセルロース分解酵素の生産方法及びクロストリジウム属微生物の培養増殖方法。
CN102492634B (zh) 一株耐高温酵母菌及其应用
CN102433321B (zh) 可利用木糖发酵乳酸且耐高温的融合乳酸菌的育种方法
CN102787076B (zh) 一株耐冷玫红假裸囊菌及其在制备冷水纤维素酶中的应用
CN102161971B (zh) 一种用于生产纤维素酶和半纤维素酶的发酵菌剂
CN103667147A (zh) 一株高阿魏酸抗逆性拜氏梭菌及其应用
CN103082083B (zh) 一种微生物发酵生产蛋白饲料的方法

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant