CN102719371B

CN102719371B - 拜氏梭菌及其以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法

Info

Publication number: CN102719371B
Application number: CN 201210089406
Authority: CN
Inventors: 李福利; 张婉璐; 刘自勇
Original assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Current assignee: Qingdao Institute of Bioenergy and Bioprocess Technology of CAS
Priority date: 2012-03-30
Filing date: 2012-03-30
Publication date: 2013-07-17
Anticipated expiration: 2032-03-30
Also published as: CN102719371A

Abstract

一株高产丁醇的拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y-3，其保藏登记号为：CGMCC 5805。本发明利用拜氏梭菌以木糖渣为原料制备生物丁醇的方法，包括氢氧化钙脱毒预处理、厌氧酶解、C.beijerinckii Y-3厌氧发酵培养基的制备及发酵生产生物丁醇。本发明利用甲基磺酸乙酯(EMS)诱变，淀粉平板和2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选得到的高产丁醇菌株，能够利用经氢氧化钙脱毒工艺处理后的木糖渣为原料发酵生产丁醇，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题，实现了工业废弃物向高附加值生物能源的转变，是一种环境友好、工业应用前景广阔的制备生物丁醇的方法。

Description

拜氏梭菌及其以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法

技术领域

本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及高产丁醇的拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y-3及一种利用工业废弃物木糖渣经氢氧化钙脱毒预处理、厌氧酶解及梭菌发酵生产生物丁醇的方法。

背景技术

丁醇作为重要的有机化工原料，在医药工业、塑料工业、有机工业、印染等方面具有广泛用途。除可用作溶剂外，丁醇还是一种极具潜力的大宗动力燃料，其燃烧值和汽油相当，是汽车用油的替代品。丁醇的生产工艺主要有化学合成法和微生物发酵法两种。

随着石油资源的日益枯竭，采用以石油为原料丙烯羰基合成法生产丁醇已举步维艰，而且由于技术落后，装置偏小导致产能不够，致使中国丁醇市场长期供应不足，不能满足国内市场的需求。

生物发酵法制备丁醇有其独到的优势，发展生物丁醇将极大地缓解丁醇供应不足的现状。目前，困扰生物丁醇产业发展的主要障碍有：第一，发酵原料费用高，发酵用基质在丁醇发酵生产成本的70％左右；第二，由于发酵原料及产物的毒性，导致产物浓度低；第三，产物回收费用高，由于发酵产物浓度低，回收丁醇消耗大量能源。

其中菌株和原料问题一直是困扰丁醇发酵的瓶颈。近年来，国内外对纤维原料发酵产丁醇的研究很多，主要围绕菌种诱变选育，寻找合适的纤维原料及其糖液制备、发酵工艺条件优化和溶剂提取等方面进行。Mermelstein等(Biotechnol.Bioeng.1993，42：176-183)利用基因工程技术构建了重组菌株，丁醇产量比出发菌株提高了37％。可见，进行菌株改良是提高丁醇产量，增强发酵竞争力的关键手段之一。

另外由于我国人口众多，用传统的原料(玉米和甘蔗)发酵生产丁醇势必会造成与人争粮的问题，造成粮食短缺，因此开展以可再生的生物质材料为原料生物转化生产生物丁醇是符合国情的研究方向。木糖渣是玉米棒芯经酸水解制取木糖、木糖醇后剩下的酸性固体纤维残渣，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。木糖渣中的半纤维素比例降低，纤维素比例较高，使木糖渣成为一种很有潜力的纤维素原料。而作为纤维残渣的木糖渣目前却被工厂视为废弃物，其存放不仅占用了大量的耕地，并对周边环境造成了严重污染。因此合理地开发和利用废弃木糖渣，不仅能控制污染，保护农田生态环境，还可取得显著的经济效益。相比于其他原料如谷物、薯类、糖蜜及秸秆等而言，木糖渣作为丁醇生产的原料，具有来源稳定，收集和储存成本低等优点。因此将其应用于液体生物丁醇的开发有具备较好的经济价值。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高产拜氏梭菌菌株，使其厌氧发酵丁醇产量提高，以解决生物发酵生产丁醇菌种能力问题。

本发明的又一目的在于提供一种利用该高产拜氏梭菌菌株以工业废弃物木糖渣为原料制备生物丁醇的方法，以解决木糖渣制备生物丁醇过程中抑制物不利于纤维素酶酶解和该菌株厌氧发酵的难题。

为实现上述目的，本发明提供的一株高产拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y-3，其保藏登记号为：CGMCC 5805，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

本发明提供的利用高产拜氏梭菌Y-3以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法，包括如下步骤：

1)利用氢氧化钙脱毒工艺对木糖渣的固液混合物进行预处理；

2)步骤1)预处理得到的木糖渣残渣中加入纤维素酶进行酶解，得到含多组份糖的酶解液；

3)在酶解液中加入氮源，调节pH至6-8，制成木糖渣水解液发酵培养基；

4)将拜氏梭菌Y-3接种至步骤3)制成的木糖渣水解液发酵培养基中，厌氧条件下发酵制备生物丁醇。

所述的方法，其中，步骤1)的木糖渣为玉米芯酸水解后的残渣。

所述的方法，其中，步骤1)的氢氧化钙脱毒工艺中氢氧化钙为0.4-0.6M的氢氧化钙溶液，木糖渣的固液混合物中的料液比为8-12％w/v，用氢氧化钙溶液调节木糖渣的固液混合物的pH至10-11，之后加入亚硫酸钠。

所述的方法，其中，步骤2)加入纤维素酶之前，先将经氢氧化钙脱毒工艺处理的木糖渣残渣和pH为4-5，浓度为0.1-0.2M的醋酸钠-醋酸缓冲液按固液比8-10％w/v混合，经过脱氧处理后高压灭菌。

所述的方法，其中，步骤2)所述纤维素酶为纤维素酶复合物和β-葡萄糖苷酶；酶解的pH值为4-5。

所述的方法，其中，步骤3)中的木糖渣水解液发酵培养基为pH 6-8的含有碳源、氮源及无机盐的固液培养基；其中的碳源为酶解液中的多组分糖；氮源为麸皮、玉米粉、豆粕、米糠、花生饼、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸盐或铵盐中的一种以上混合物。

所述的方法，其中，步骤4中发酵温度为33-37℃。

本发明的方法，将氢氧化钙脱毒处理工艺应用于木糖渣的预处理，减少了纤维素酶解和梭菌厌氧发酵过程中存在的抑制物，从而提高产糖量及溶剂产量，最终减少生物丁醇的生产成本，解决了传统生物发酵生产丁醇菌种能力和原料不足的问题，实现了工业废弃物向高附加值生物能源的转变，是一种环境友好、工业应用前景良好的制备生物丁醇的方法。

具体实施方式

一方面，本发明要解决的技术问题是提供一株高产拜氏梭菌菌株，使其厌氧发酵丁醇产量提高，以解决生物发酵生产丁醇菌种能力问题；

另一方面，本发明要解决的技术问题是提供一种该高产拜氏梭菌菌株以工业废弃物木糖渣为原料制备生物丁醇的方法，以解决木糖渣制备生物丁醇过程中抑制物不利于纤维素酶酶解和该菌株厌氧发酵的难题。

为了解决上述技术问题，发明采用的技术方案如下：

一株高产拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌Clostridium beijerinckiiY-3，其保藏登记号为：CGMCC 5805，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院生物研究所)，保藏日期为2012年2月24日。

本发明所述的高产拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y-3的筛选方法，将出发菌株拜氏梭菌Clostridium beijerinckii NCIMB 8052(购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心)经甲基磺酸乙酯(EMS)诱变后，利用淀粉平板和2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选得到高淀粉酶活力的菌株，再经厌氧发酵筛选得到高产丁醇、丙酮、乙醇的目标菌株。

其具体诱变步骤如下：

a)EMS诱变：将拜氏梭菌原始菌株活化培养，25mL厌氧瓶装液量10～15mL，培养温度33～37℃，培养时间12～16小时，得到处于对数生长期的菌液；取1mL，离心收集菌体，用50mM无菌磷酸盐缓冲液(pH 7.0)洗涤菌体3次，之后加入含有0.5～2％EMS的种子培养基中，处理10～60分钟后，离心弃上清，加入5％的硫代硫酸钠终止反应；

b)淀粉平板初筛：菌株经EMS诱变后，用无菌生理盐水洗出，稀释成不同浓度涂布于淀粉平板培养基上，在33～37℃温度下厌氧培养12～30小时，滴加碘液，挑选出在该平板上透明圈较大的菌落；

c)2-脱氧-D-葡萄糖平板复筛：将步骤b)筛选的菌株接种于25mL厌氧瓶装液量10～15mL的种子培养基中，33～37℃厌氧培养10～14小时，无菌生理盐水稀释至适当浓度涂布于2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基中，在33～37℃温度下厌氧培养12～30小时，滴加碘液，挑选出在该平板上透明圈较大的菌落；

d)厌氧发酵：将步骤c)筛出的菌落接入种子培养基扩大培养，培养温度33～37℃，厌氧培养培养时间10～16小时，然后在发酵培养基中发酵，接种量5％～15％(v/v)，发酵温度33～37℃，厌氧发酵发酵时间60～80小时；考察筛选出的菌落发酵丁醇和总溶剂的产量。

步骤a)中所述的EMS诱变方法中，优选1％EMS作为诱变剂量，20分钟作为诱变时间。

步骤b)所采用的淀粉平板培养基，碳源为淀粉和葡萄糖两种的混合，氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B₁、生物素和玉米浆中的一种或多种的混合，固体培养基中添加琼脂。

步骤c)所采用的2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基，碳源为2-脱氧-D-葡萄糖和淀粉两种的混合，氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B₁、生物素和玉米浆中的一种或多种的混合，固体培养基中添加琼脂。

步骤a)、c)和d)所采用的种子培养基中，碳源为葡萄糖和淀粉中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B₁、生物素和玉米浆中的一种或多种的混合。

步骤d)所采用的发酵培养基中，碳源为葡萄糖、淀粉、木质纤维水解液中的一种或多种；氮源为有机或无机含氮化合物，其中无机含氮化合物为乙酸铵、氯化铵中的一种或多种，有机含氮化合物为蛋白胨、酵母粉、牛肉膏和玉米浆的一种或多种；无机盐为钠盐、钾盐、镁盐、钙盐、磷酸盐、亚铁盐中的一种或多种；生长因子为对氨基苯甲酸、维生素B₁、生物素和玉米浆中的一种或多种的混合。

本发明提供的利用上述高产拜氏梭菌以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法，包括如下步骤：

4)将高产拜氏梭菌接种至步骤3)制成的木糖渣水解液发酵培养基中，发酵制备生物丁醇。

所述的方法，其中，所述纤维素酶为诺维信公司生产的用于转化木质纤维素原料的Biomass Kit，其中包括纤维素酶复合物(NS 50013)和β-葡萄糖苷酶(NS 50010)；酶解的pH值为4-5。

所述的方法，其中，步骤3)中的木糖渣水解液发酵培养基为pH 6-8的含有碳源、氮源及无机盐的固液培养基；其中的碳源为木糖渣酶解液中的多组分糖；氮源为麸皮、玉米粉、豆粕、米糠、花生饼、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸盐或铵盐中的一种以上混合物。

所述的方法，其中，步骤4)中的丁醇生产菌为拜氏梭菌Clostridiumbeijerinckii Y-3，发酵条件为厌氧，发酵温度为33-37℃。

本发明采用EMS诱变拜氏梭菌，利用淀粉平板和2-脱氧-D-葡萄糖平板筛选出高淀粉酶活力的菌株，该菌株能高效利用不同碳源发酵生产丁醇，葡萄糖为碳源时，在5L发酵罐中总溶剂和丁醇产量分别达到了15.8g/L和9.4g/L，分别比出发菌提高了30.6％和40.3％。

以下提供更佳实施例，同时列举对比例对本发明的效果进行比较，以更好的理解本发明。然而本领域技术人员容易理解，实施例中所描述的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明和帮助理解本发明的技术方案，而不应当也不会限制权利要求的范围。

实施例1：本实施例说明将原始菌株拜氏梭菌C.beijerinckii NCIMB8052进行甲基磺酸乙酯(EMS)诱变的方法。

原始菌株拜氏梭菌C.beijerinckii NCIMB 8052购于英国国家工业、海洋和食品菌种保藏中心(NCIMB)，进行EMS诱变的方法如下：

将原始菌株拜氏梭菌C.beijerinckii NCIMB 8052于33～37℃下活化培养12～18小时，得到生长旺盛、菌体粗壮的菌液；取新鲜培养的菌液1mL，离心收集菌体，用50mM无菌磷酸缓冲液(pH 7.0)洗涤菌体3次，之后加入含有0.5～2％EMS的种子培养基中，处理10～60分钟后，离心弃上清，加入5％的硫代硫酸钠终止反应；通过计算存活率可知，1％EMS是最佳诱变剂量，20分钟是最佳诱变时间。

实施案例2：本发明说明筛选优良拜氏梭菌的方法。

其中，所使用的培养基配方如下：

(1)淀粉平板培养基：可溶性淀粉5g/L，葡萄糖5g/L，酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01g/L，对氨基苯甲酸0.001g/L，维生素B₁ 0.001g/L，生物素0.0001g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH 6.5。

(2)2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基：可溶性淀粉5g/L，2-脱氧-D-葡萄糖5g/L，酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01g/L，对氨基苯甲酸0.001g/L，维生素B₁ 0.001g/L，生物素0.0001g/L，琼脂15g/L，其余为水，pH 6.5。

(3)发酵种子培养基：葡萄糖20g/L，酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01g/L，对氨基苯甲酸0.001g/L，维生素B₁ 0.001g/L，生物素0.0001g/L，其余为水，pH 6.5。

(4)发酵培养基：葡萄糖60g/L，酵母粉1g/L，磷酸氢二钾0.5g/L，磷酸二氢钾0.5g/L，乙酸铵2.2g/L，七水合硫酸镁0.2g/L，一水合硫酸锰0.01g/L，七水合硫酸亚铁0.01g/L，氯化钠0.01g/L，对氨基苯甲酸0.001g/L，维生素B₁ 0.001g/L，生物素0.0001g/L，其余为水，pH 6.5。

筛选步骤：

1)淀粉平板初筛

菌株经EMS诱变后，用无菌生理盐水洗出，稀释成不同浓度涂布于淀粉平板培养基上，在37℃温度下厌氧培养30小时，滴加碘液，挑选出在该平板上生长、菌落较大、且透明圈明显较大的菌落10株。

2)2-脱氧-D-葡萄糖平板复筛

将初筛得到的菌株接种于25mL厌氧瓶装液量10～15mL的种子培养基中，37℃厌氧培养14小时，无菌生理盐水稀释至适当浓度涂布2-脱氧-D-葡萄糖平板培养基中，在33～37℃温度下厌氧培养30小时，滴加碘液，挑选出在该平板上透明圈明显大于出发菌的菌落。

最终菌株Y-3显示了较高的淀粉酶活力。

3)摇瓶发酵

将诱变菌株Y-3和原始菌株接入种子培养基扩大培养，培养温度37℃，100mL厌氧瓶装液量50mL，培养12小时。然后在发酵培养基中发酵，接种量为5％(v/v)，发酵温度35℃，250mL厌氧瓶装液量100mL，发酵时间96小时后检查诱变菌株的总溶剂产量和丁醇产量如表1所示：

表1 诱变菌株Y-3和原始菌株发酵结果比较

实施例4：本实施例说明诱变菌株Y-3的传代稳定性。

在以葡萄糖为碳源的发酵培养基中，检测突变株Y-3的传代稳定性，结果表明经过8次转接，淀粉酶活稳定，且丁醇和总溶剂产量稳定，与摇瓶发酵筛选结果一致。

实施例5：本实施例说明诱变菌株Y-3以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法

1)氢氧化钙脱毒工艺处理木糖渣

10g的木糖渣放入100mL蒸馏水中，搅拌均匀后用0.5M氢氧化钙调pH至10.1，后加入亚硫酸钠至终浓度为1g/L；于恒温培养箱中45℃，100rpm处理1小时，之后用盐酸调pH至6.8；处理完毕后，离心(7000g，10分钟)，弃上清，将沉淀烘干备用。

2)木糖渣的酶解

步骤1)脱氧处理后的沉淀物，以固液比1∶10的比例，将5g经氢氧化钙脱毒工艺处理后得到的木糖渣和50mL 0.2M醋酸-醋酸钠缓冲液(pH4.8)于厌氧瓶中混合均匀，121℃，20分钟进行高压灭菌处理。之后于超净工作台中加入纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，使每克底物对应48FPU纤维素酶和20 CBIUβ-葡萄糖苷酶，然后移到50℃恒温培养箱中，150rpm酶解72小时，最终得到糖浓度为58g/L的酶解液。

3)木糖渣水解液发酵培养基制备

步骤2)得到的酶解液中，通过过滤除菌加入0.5g/L磷酸氢二钾、0.5g/L磷酸二氢钾、2.2g/L乙酸铵、0.2g/L七水合硫酸镁、0.01g/L一水合硫酸锰、0.01g/L七水合硫酸亚铁、0.01g/L氯化钠、1g/L酵母粉、0.001g/L对氨基苯甲酸、0.001g/L维生素B₁和0.0001g/L生物素；用10M无菌氢氧化钾溶液调pH至6.8左右。

4)以木糖渣水解液为底物的梭菌发酵

在步骤3)制备得到的木糖渣水解液发酵培养基中，无菌的状态下以5％的接种量接种拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y-3进行发酵培养。厌氧条件下，发酵温度为37℃，发酵时间为48小时。发酵结束后，经气相色谱检测，丁醇含量为8.2g/L，丙酮含量为6.8g/L，乙醇含量为1.0g/L，共16.0g/L溶剂(ABE)。结果与相当浓度的葡萄糖为碳源时的发酵结果相近。

对比例1

同实施例1步骤2的方法，不同的是木糖渣未经氢氧化钙脱毒工艺处理，结果酶解液中还原糖量为28.2g/L。

对比例2

同实施例1步骤3和步骤4的方法，不同的是发酵培养基中的木糖渣酶解液是由未经过氢氧化钙脱毒工艺处理的烘干的木糖渣酶解得到，96小时发酵结束后，丁醇含量为2.1g/L，丙酮含量1.3g/L，乙醇含量为0.4g/L，共3.8g/L溶剂(ABE)，糖消耗10.3g/L。

对比例3

同实施例1步骤3和步骤4的方法，不同的是以丙酮丁醇梭菌ATCC824作为发酵菌株进行发酵，96小时发酵结束后，丁醇含量为1.1g/L，丙酮含量0.5g/L，乙醇含量为0.3g/L，共1.9g/L溶剂(ABE)，糖消耗4.5g/L。

结果表明氢氧化钙脱毒预处理能够有效去除纤维素酶的抑制物，从而提高酶解得率；并能进一步去除厌氧发酵中抑制梭菌生长及发酵的抑制物，从而提高丁醇产量。诱变菌株Y-3能以氢氧化钙脱毒预处理的木糖渣为原料生产丁醇，而丙酮丁醇梭菌在同等条件下生长缓慢，无法进行发酵。说明诱变菌株Y-3具有良好的抗逆性。这表明以木糖渣为原料，以诱变菌株Y-3生产生物丁醇的这套工艺是可行的，实现了工业废弃物向高附加值生物能源的转变，是一种环境友好、工业应用前景良好的制备生物丁醇的方法。

Claims

1.一株拜氏梭菌，其分类命名为拜氏梭菌Clostridium beijerinckii Y-3，其保藏登记号为：CGMCC5805，保藏单位：中国普通微生物菌种保藏管理中心。

2.权利要求1所述的拜氏梭菌在生产丁醇中的应用。

3.一种利用权利要求1所述的拜氏梭菌Y-3以木糖渣为原料发酵制备生物丁醇的方法，包括如下步骤：

4)将拜氏梭菌Y-3接种至步骤3)制成的木糖渣水解液发酵培养基中，厌氧条件下发酵制备生物丁醇；

步骤1)中所述的木糖渣为玉米芯酸水解后的残渣。

4.如权利要求3所述的方法，其中，步骤1)的氢氧化钙脱毒工艺中氢氧化钙为0.4-0.6M的氢氧化钙溶液，木糖渣的固液混合物中的料液比为8-12％w/v，用氢氧化钙溶液调节木糖渣的固液混合物的pH至10-11，之后加入亚硫酸钠。

5.如权利要求3所述的方法，其中，步骤2)加入纤维素酶之前，先将经氢氧化钙脱毒工艺处理的木糖渣残渣和pH为4-5，浓度为0.1-0.2M的醋酸钠-醋酸缓冲液按固液比8-10％w/v混合，经过脱氧处理后高压灭菌。

6.如权利要求3所述的方法，其中，步骤2)所述纤维素酶为纤维素酶复合物和β-葡萄糖苷酶；酶解的pH值为4-5。

7.如权利要求3所述的方法，其中，步骤3)中的木糖渣水解液发酵培养基为pH6-8的含有碳源、氮源及无机盐的固液培养基；其中的碳源为酶解液中的多组分糖；氮源为麸皮、玉米粉、豆粕、米糠、花生饼、牛肉膏、酵母膏、蛋白胨、硝酸盐或铵盐中的一种以上混合物。

8.如权利要求3所述的方法，其中，步骤4)中发酵温度为33-37℃。