CN101967452B

CN101967452B - 一种发酵性丝孢酵母菌株及其生产微生物油脂的应用

Info

Publication number: CN101967452B
Application number: CN201010281869XA
Authority: CN
Inventors: 吴虹; 黄超; 宗敏华
Original assignee: South China University of Technology SCUT
Current assignee: South China University of Technology SCUT
Priority date: 2010-09-13
Filing date: 2010-09-13
Publication date: 2012-08-22
Anticipated expiration: 2030-09-13
Also published as: CN101967452A

Abstract

本发明公开了一种发酵性丝孢酵母及该酵母利用木质纤维素水解液生产微生物油脂的方法。本发明以发酵性丝孢酵母CICC 1368为出发菌株，经过紫外线诱变，再经紫外线与LiCl的复合诱变，通过发酵筛选得到高产菌株，所得菌株在木质纤维素水解液中进行驯化，最终得到能在木质纤维素水解液中高效积累油脂的油脂酵母菌株CCTCC M209060。该菌株不仅比原始菌株的油脂产率高，而且在含较高浓度抑制剂的木质纤维素水解液中也能高效积累油脂，为廉价、高效、大规模地生产微生物油脂提供了可能。

Description

一种发酵性丝孢酵母菌株及其生产微生物油脂的应用

技术领域

本发明属于发酵工程和微生物工程领域，具体涉及一种高效利用木质纤维素水解液生产微生物油脂的菌株发酵性丝孢酵母CCTCC M209060及该菌株利用木质纤维素水解液发酵生产微生物油脂的方法。

背景技术

生物柴油是一种以动植物油脂为原料生产的能够替代化石柴油的绿色可再生能源，在石油能源替代战略中具有十分重要的地位。目前生物柴油的工业化生产主要以大豆油、菜籽油以及废油脂为原料。我国人多地少，以食用油为原料生产生物柴油不符合国情，而废油脂的数量有限，无法满足现代经济社会对能源的巨大需求。微生物油脂，又称单细胞油脂，是微生物生命活动中的一种代谢产物。某些微生物如酵母、霉菌、微藻、细菌能够积累大量油脂，有的菌体中油脂含量甚至达到干菌丝体的70％以上。这些油脂与一般植物油脂有类似的脂肪酸组成，因此是一种具有巨大潜力的新型生物柴油生产原料。与动植物油脂相比，用微生物生产油脂具有如下优点：生长周期短，占地面积小，不受场地、气候和季节限制，能连续大规模生产。然而对于大多数油脂微生物而言，油脂产率很低，并不能满足微生物油脂工业化生产的需求，筛选具有高油脂产率的油脂微生物尤其重要。此外，现有微生物发酵产油脂一般以葡萄糖为培养基，导致微生物油脂生产成本高，难以实现产业化。

木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，其主要成分为纤维素、半纤维素和木质素。我国是一个农业大国，各种农业废弃物，如农作物秸秆、蔗渣等数量巨大，仅农作物秸秆每年就达7亿吨以上。过去，这部分木质纤维素资源经常被废弃或低值化利用，如农作物秸秆经焚烧后用于农田堆肥，但焚烧过程中产生的黑烟会污染环境。利用农作物秸秆或蔗渣等木质纤维素资源来生产微生物油脂可大大降低微生物油脂的生产成本，但在木质纤维素的稀酸水解以及酶法水解前用稀酸预处理的过程中，会产生许多抑制微生物生长代谢的物质，如有机酸、醛类化合物和醇类化合物等。这些物质降低了水解液中还原糖的可发酵性，并抑制微生物细胞积累油脂。因此，获得能够在含抑制剂的木质纤维素水解液中高效积累油脂的菌株是实现廉价生产微生物油脂的关键。

发明内容

为了解决上述现有技术的不足之处，本发明的首要目的之一是提供一种发酵性丝孢酵母菌株(Trichosporon fermentans)HWZ004，该菌株已经由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M209060，保藏日期为2009年3月26日。

本发明的另一目的是提供上述发酵性丝孢酵母利用木质纤维素水解液生产微生物油脂的应用。

本发明目的通过如下技术方案实现：

一种发酵性丝孢酵母菌株(Trichosporon fermentans)HWZ004，该菌株是以发酵性丝孢酵母CICC 1368(购于中国工业微生物菌种保藏中心)为出发菌株，先经过诱变处理得到高产油脂菌株，然后该菌株在木质纤维素水解液中驯化得到的。

所述的诱变处理是：经过紫外线多次诱变，再经过紫外线与LiCl的多次复合诱变，然后通过发酵筛选得到高产菌株发酵性丝孢酵母(Trichosporonfermentans)HWZ003。该菌株在发酵培养基(葡萄糖100g/L；蛋白胨1.8g/L；酵母粉0.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.4g/L；KH₂PO₄ 2g/L；MnSO₄·H₂O 0.004g/L；CuSO₄·5H₂O 0.0001g/L)中发酵，可以得到生物量为35.1g/L，油脂含量为62％的干菌体，油脂产率21.8g/L。

为了让上述诱变后的发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)HWZ003能更好地利用木质纤维素水解液进行微生物油脂生产，该诱变菌株在木质纤维素水解液中进行长时间的驯化，驯化方法是：把发酵培养基(木糖120g/L；蛋白胨1.8g/L；酵母粉0.5g/L)与木质纤维素水解液(水稻秸秆酸水解液或者甘蔗渣酸水解液)按一定比例(发酵培养基比例从高到低)混合，组成驯化培养基，使发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans HWZ003在驯化培养基中生长。逐步提高木质纤维素水解液在驯化培养基中的比例，直到发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans HWZ003能够在含100％木质纤维素水解液的驯化培养基中获得与发酵培养基中(木糖120g/L；蛋白胨1.8g/L；酵母粉0.5g/L)相近的油脂产率。然后对该菌株进行分离纯化，得到能在木质纤维素水解液(未经预处理)中高效积累油脂的目标菌株，并且命名为Trichosporon fermentansHWZ004，该菌株即为上述保藏的发酵性丝孢酵母CCTCC M209060菌株。

发酵性丝孢酵母CCTCC M209060菌株具有以下特征：菌落呈圆形或者椭圆形，白色，表面粗糙，因培养条件的不同，有时候也会呈粘质状。该菌株在一般培养基上即能存活，在麦芽汁培养基上生长较快，在限氮培养基中(葡萄糖50～100g/L；蛋白胨1.2～2.4g/L；酵母粉0.25～0.75g/L；MgSO₄·7H₂O 0.3～0.6g/L；KH₂PO₄ 1～3g/L；MnSO₄·H₂O 0.002～0.006g/L；CuSO₄·5H₂O 0.0001～0.0004g/L)生长有利于油脂积累，该菌株的生长的温度范围为8-40℃，最适为25-28℃。该菌株在pH 4～10之间均可以生长，最适pH值为6.5～7.5。此外，该菌株在限氮培养基中发酵，可得油脂含量35～68％的干菌体，并且该菌株在脱毒与未脱毒的木质纤维素水解液中均能生长，且都有较高的油脂产率，脱毒预处理后的油脂产率更高，如在脱毒后的甘蔗渣水解液中有13～18g/L的油脂产率(油脂产率＝生物量×油脂含量，生物量是指菌体干重)。

发酵性丝孢酵母CCTCC M209060利用木质纤维素水解液高效发酵生产微生物油脂的应用通过以下技术方案实现。

发酵性丝孢酵母CCTCC M209060利用木质纤维素水解液生产微生物油脂的应用，步骤如下：将该菌种接种在各种含有不同木质纤维素水解液(水解液的还原糖浓度为90～110g/L)、氮源与无机盐的培养基(蛋白胨1.2～2.4g/L；酵母粉0.25～0.75g/L；MgSO₄·7H₂O 0.3～0.6g/L；KH₂PO₄ 1～3g/L；MnSO₄·H₂O0.002～0.006g/L；CuSO₄·5H₂O 0.0001～0.0004g/L)中，在22～30℃下发酵培养7～10天；发酵结束后通过离心，收集菌体，经有机溶剂提取方法获得微生物油脂。在优化条件：接种量10％(v/v)，培养基初始pH值6.5，其油脂产率更高。

所述有机溶剂提取方法为：按每克干菌体加入10mL浓度为3.5～4.5mol/L HCl，于80～100℃处理30～60min；冷却后按体积比为2∶1加入的氯仿和甲醇混合溶剂进行萃取，收集氯仿层，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂。

所述木质纤维素酸水解液可以是木质纤维素经稀酸处理得到的，所述稀酸可以是稀硫酸、硝酸和磷酸中的一种或几种。

优选地，所述木质纤维素水解液可以是木质纤维素经稀酸预处理得到的酸水解液再依次经Ca(OH)₂预处理、活性炭吸附的脱毒预处理得到的水解液。

优选地，所述木质纤维素水解液也可以是经稀酸预处理后的木质纤维素再依次经碱预处理、酶解预处理后得到的水解液；所述酶为纤维素酶和β-葡萄糖苷酶，并分别按15FPU/g纤维素和60IU/g纤维素的量添加，酶解温度48～50℃，酶解时间3～3.5天。

所述木质纤维素可以是水稻秸秆、小麦秸秆、玉米秸秆等农作物秸秆，也可以是甘蔗渣、硬木或软木等。

本发明与现有技术相比，具有如下优点及有益效果：

(1)在相同发酵培养基(葡萄糖100g/L；蛋白胨1.8g/L；酵母粉0.5g/L；MgSO₄·7H₂O 0.4g/L；KH₂PO₄ 2g/L；MnSO₄·H₂O 0.004g/L；CuSO₄·5H₂O 0.0001g/L)中发酵，本发明的发酵性丝孢酵母CCTCC M209060(油脂产率21.8g/L)与其原始菌株CICC 1368(油脂产率10.4g/L)相比，能够更高效地积累油脂。

(2)本发明的发酵性丝孢酵母CCTCC M209060能高效利用木质纤维素水解液积累油脂(油脂产率13.0～20.4g/L)，而原始菌株CICC 1368在木质纤维素水解液中的油脂产率低于10.4g/L，因此，发酵性丝孢酵母CCTCCM209060为大规模廉价生产微生物油脂提供了可能。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。实施例中所用方法无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为水。

实施例1

发酵性丝孢酵母HWZ004菌株的获得

通过多次紫外线诱变以及紫外线与LiCl复合诱变得到系列诱变发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)菌株，其中筛选出最优的一株命名为发酵性丝孢酵母HWZ003，让其在未经任何吸附脱毒的水稻或者甘蔗渣酸水解液中进行驯化，得到能在木质纤维素水解液中高效积累油脂的目标菌株，命名为发酵性丝孢酵母HWZ004，具体的诱变与驯化过程包括以下方法与步骤：

1)紫外线诱变：将发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)CICC1368(购买于中国工业微生物菌种保藏中心)在活化培养基(葡萄糖20g/L、酵母膏10g/L、蛋白胨10g/L)中培养24～30h后稀释10⁵倍，涂布于固体的活化培养基(葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉10g/L，琼脂0.2g/L，pH 6.0)中，在20W紫外灯下30cm处照射30-60秒，整个操作均在超净工作台中进行。照射后的菌落在28～30℃下避光培养2～3天后检查生长情况并进一步摇瓶发酵筛选较优菌株。

2)LiCl诱变：将发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)CICC 1368(购买于中国工业微生物菌种保藏中心)在活化培养基中培养24～30h后稀释10⁵倍，涂布于已经含有0.2～0.6％剂量LiCl的固体YEPD培养基(葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉10g/L，琼脂0.2g/L，pH 6.0)中，在28～30℃下培养2～3天后检查生长情况并进一步摇瓶发酵筛选较优菌株。

3)复合诱变：将紫外线诱变与LiCl诱变依次应用，即将一次或多次紫外诱变后筛选到的较优菌株使用一次或者多次LiCl诱变，每次诱变后在28～30℃培养2～3天后检查菌落生长情况并进一步摇瓶发酵得到系列更优中间菌株。

4)驯化培养：将木质纤维素水稻秸秆或甘蔗渣粉碎至20目，称取40g，按照水稻秸秆或甘蔗渣(固体)与2％(重量)稀硫酸(液体)的固液比为1g∶20mL加入稀硫酸溶液，于121℃下水解1.5h，过滤后，用氢氧化钙把水解液pH调至碱性(9.0～11.0)，过滤后用硫酸把水解液pH值调到发酵pH(6.0～7.0)，然后浓缩至所需浓度(还原糖浓度在70～120g/L之间)，得到水解液。该水解液没有经过后续吸附等任何脱毒预处理。把发酵培养基(木糖120g/L，蛋白胨1.8g/L；酵母粉0.5g/L)与上述没有经过后续吸附等任何脱毒预处理水解液按一定比例(水稻秸秆或甘蔗渣水解液原始量为20％，然后水解液由少到多，之后到达100％水稻秸秆或甘蔗渣水解液的比例)混合，组成驯化培养基，使发酵性丝孢酵母在驯化培养基中生长(25℃，pH 7.0)。逐步提高木质纤维素水解液在驯化培养基中的比例，直到发酵性丝孢酵母在含100％水稻秸秆水解液的驯化培养基中获得与发酵培养基(木糖120g/L；蛋白胨1.8g/L；酵母粉0.5g/L)中相近的油脂产率(13～16g/L)。

从以上诱变中间菌株进一步筛选，最终获得一株发酵性丝孢酵母菌株，该菌株为依次经过上述1)、2)、3)三种方法复合诱变得到的最优菌株HWZ003。然后将菌株HWZ003按照上述步骤4)的方法驯化培养得到利用木质纤维素水解液高效积累生产微生物油脂的菌株HWZ004。驯化后获得的菌株保藏在麦芽琼脂斜面(该培养基的成分：麦芽膏粉130g、琼脂15g、氯霉素0.1g；该培养基主要用于酵母菌的培养、鉴定及菌种保藏)上，每隔一个月传代一次。该酵母(Trichosporon fermentans)HWZ004已经于2009年3月26日在中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M209060。

实施例2

菌株CCTCC M209060高效利用活性炭脱毒后的水稻秸秆酸水解液进行发酵产微生物油脂的应用：

水稻秸秆水解液的制备：将水稻秸秆粉碎至20目，称取40g，按照水稻秸秆(固体)与2％(重量)稀硫酸(液体)的固液比为1g∶20mL加入稀硫酸溶液，于121℃下水解1h，过滤后得水稻秸秆酸水解液。

水稻秸秆水解液的脱毒预处理：向水稻秸秆酸水解液中加入Ca(OH)₂粉末，调节其pH至10.0，保持1h后，过滤。用HCl调节滤液pH到5.5，静置1h，再离心10min除去沉淀。按活性炭与水解液固液比1g∶10mL，将活性炭(ca.2.5mm，德国Merck公司)加入所得的水解液中，在40℃下搅拌处理1h后过滤除去活性炭。

处理后的水解液在减压条件下，于60℃下浓缩至还原糖浓度为100g/L，然后在还原糖浓度为100g/L的水解液中添加如下物质：1.8g/L的蛋白胨、0.5g/L的酵母粉、0.4g/L的MgSO₄·7H₂O、2.0g/L的KH₂PO₄、0.003g/L的MnSO₄·H₂O和0.0001g/LCuSO₄·5H₂O，用H₂SO₄调节pH至6.5，121℃灭菌20min，制得发酵培养基。

在斜面上挑取3环发酵性丝孢酵母CCTCC M209060接种到YEPD培养基(葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉10g/L)中进行活化，24小时后以10％的接种量转接到50mL上述制得的发酵培养基中，于28℃、160r/min摇瓶振荡培养9天，停止发酵；将发酵液于4000r/min离心10min，收集菌体，用水洗涤后于105℃干燥至恒重，得干菌体34.1g/L。

按每克干菌体加入10mL 4.5mol/L HCl，于90℃水浴处理40min；冷却后加入体积比为2∶1的氯仿和甲醇混合溶剂(30mL)进行萃取，收集氯仿层，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂，生物量36.1g/L，菌体油脂含量为48.1％，油脂产率17.4g/L。

实施例3

菌株CCTCC M209060高效利用未用活性炭脱毒的水稻秸秆酸水解液进行发酵产微生物油脂的应用：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

发酵培养基所用的木质纤维素水解液没有经过任何活性炭或者其他物质的吸附脱毒作用，而培养基中的其他组成与实施例2中的其他成分完全相同。

在斜面上挑取3环发酵性丝孢酵母CCTCC M209060接种到YEPD培养基(葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉10g/L)中进行活化，24小时后以10％的接种量转接到50mL上述制得的发酵培养基中，于28℃、160r/min摇瓶振荡培养10天，停止发酵；将发酵液于4000r/min离心10min，收集菌体，用水洗涤后于105℃干燥至恒重，得干菌体30.4g/L。

按每克干菌体加入10mL 4.5mol/L HCl，于90℃水浴处理40min；冷却后加入体积比为2∶1的氯仿和甲醇混合溶剂进行萃取(30mL)，收集氯仿层，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂，生物量31.8g/L，菌体油脂含量为43.1％，油脂产率13.7g/L。

实施例4

菌株CCTCC M209060高效利用活性炭脱毒后的甘蔗渣水解液进行发酵产微生物油脂的应用：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

水解液的制备所使用的原料是甘蔗渣，而其水解条件与水解液的处理方法，与实施例2中的完全相同。发酵培养基的组成除了使用了甘蔗渣水解液外，其他成分与实施例2中的完全相同。

在斜面上挑取3环发酵性丝孢酵母CCTCC M209060接种到YEPD培养基(葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉10g/L)中进行活化，24小时后以10％的接种量转接到50mL上述制得的发酵培养基中，于28℃、160r/min摇瓶振荡培养8天，停止发酵；将发酵液于4000r/min离心10min，收集菌体，用水洗涤后于105℃干燥至恒重，得干菌体36.6g/L。

按每克干菌体加入10mL 4.5mol/L HCl，于90℃水浴处理40min；冷却后加入体积比为2∶1的氯仿和甲醇混合溶剂进行萃取(30mL)，收集氯仿层，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂，生物量36.6g/L，菌体油脂含量为47.8％，油脂产率17.5g/L。

实施例5

菌株CCTCC M209060高效利用活性炭脱毒后的玉米秸秆酸水解液进行发酵产微生物油脂的应用：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

水解液的制备所使用的原料是玉米秸秆。而其水解条件与水解液的处理方法，与实施例2中的完全相同。发酵培养基的组成除了使用了玉米秸秆水解液外，其他成分与实施例2中的完全相同。

发酵性丝孢酵母CCTCC M209060在玉米秸秆酸水解液中发酵9天后获得生物量37.6g/L，菌体油脂含量为46.7％，油脂产率17.6g/L。

实施例6

菌株CCTCC M209060高效利用活性炭脱毒后的小麦秸秆酸水解液进行发酵产微生物油脂的应用：

本实施例与实施例2的不同之处在于：

水解液的制备所使用的原料是小麦秸秆。而其水解条件与水解液的处理方法，与实施例2中的完全相同。发酵培养基的组成除了使用了小麦秸秆水解液外，其他成分与实施例2中的完全相同。

发酵性丝孢酵母CCTCC M209060在小麦秸秆酸水解液中可以在发酵9天后获得生物量38.1g/L，菌体油脂含量为45.3％，油脂产率17.3g/L。

实施例7

菌株CCTCC M209060高效利用水稻秸秆酶水解液进行发酵产微生物油脂的应用：

水稻秸秆酸预处理：将秸秆粉碎至20目，称取40g，按照水稻秸秆(固体)与2％(重量)稀硫酸(液体)的固液比为1g∶10mL加入稀硫酸溶液，于121℃下水解1h。

水稻秸秆碱预处理：将酸预处理后的秸秆经过滤水洗后，按照固液比(水稻秸秆与NaOH溶液)1g∶6ml加入2％(重量)NaOH溶液，于50℃、160r/min下处理12h。

水稻秸秆酶解：将经过酸、碱预处理过后的水稻秸秆过滤、水洗和干燥后，按照15FPU纤维素酶(Sigam-Aldrich公司)/克纤维素和60IU β-葡萄糖苷酶(Novozyme)/克纤维素的加入量加入两种酶，于50℃、160r/min下酶解3.5天。

在酶解后水解液(还原糖浓度为100g/L)中添加如下物质：1.8g/L的蛋白胨、0.5g/L的酵母粉、0.4g/L的MgSO₄·7H₂O、2.0g/L的KH₂PO₄、0.003g/L的MnSO₄·H₂O和0.0001g/LCuSO₄·5H₂O，用H₂SO₄调节pH至6.5，121℃灭菌20min，制得发酵培养基。

在斜面上挑取3环发酵性丝孢酵母CCTCC M209060接种到YEPD培养基(葡萄糖20g/L；蛋白胨10g/L；酵母粉10g/L)中进行活化，24小时后以10％的接种量转接到50mL上述制得的发酵培养基中，于28℃、160r/min摇瓶振荡培养9天，停止发酵；将发酵液于4000r/min离心10min，收集菌体，用水洗涤后于105℃干燥至恒重，得干菌体35.7g/L。

按每克干菌体加入10mL 4.5mol/L HCl，于90℃水浴处理40min；冷却后加入体积比为2∶1的氯仿和甲醇混合溶剂进行萃取(30mL)，收集氯仿层，用旋转蒸发仪减压去除有机溶剂，得到微生物油脂，生物量35.7g/L，菌体油脂含量为57.1％，油脂产率20.4g/L。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种发酵性丝孢酵母菌株，其特征在于，所述菌株是发酵性丝孢酵母(Trichosporon fermentans)HWZ004，由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC M209060，保藏日期为2009年3月26日。