CN101434913B

CN101434913B - 一种酿酒酵母菌株及其发酵秸秆生产乙醇的方法

Info

Publication number: CN101434913B
Application number: CN2008102044969A
Authority: CN
Inventors: 鲍杰; 楚德强; 张建
Original assignee: East China University of Science and Technology
Current assignee: East China University of Science and Technology
Priority date: 2008-12-12
Filing date: 2008-12-12
Publication date: 2011-01-19
Anticipated expiration: 2028-12-12
Also published as: CN101434913A

Abstract

本发明公开一种酿酒酵母菌株及其发酵秸秆生产乙醇的方法，菌种为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae DQ1)，保藏编号CGMCC No.2528，该菌株能够耐受秸秆水解液中甲酸，乙酸，糠醛类抑制物；可以耐受高的葡萄糖，乙醇浓度；具有宽泛的生长温度，在高温下发酵；发酵秸秆生产乙醇的方法为，两级培养种子，第一级在合成培养基培养16～24小时，第二级以5～10％的接种量接入含有30～70％水解液的混合培养基，培养15～20小时，以10％接种量接入水解液或同步糖化发酵秸秆生产乙醇。本发明的优点：适合于高固体含量秸秆酶解同步糖化发酵，发酵周期短，乙醇得率高，生产成本低，具有很好的工业化应用前景。

Description

一种酿酒酵母菌株及其发酵秸秆生产乙醇的方法

【技术领域】

本发明涉及生物发酵技术领域，具体地说，是一种酿酒酵母菌株及其发酵秸秆生产乙醇的方法，涉及酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae DQ1CGMCC No.2528。

【背景技术】

能源问题关系到民众生活、经济发展、环境保护和国家安全等重要领域，始终是世界各国关注和研究的重点。随着化石燃料的储藏量日益减少，全球变暖，以及人们对能源的需求，寻求可再生的能源迫在眉睫。生物乙醇能够部分替代汽油，同时减轻温室气体的排放，正成为人们非常感兴趣的液体替代燃料。

当前乙醇主要的发酵原料是玉米等淀粉类原料，这引起粮价上涨，导致人车争粮的局面，从长远看，必须开发新的原料从而满足大规模乙醇燃料的发展。秸秆，稻草等纤维质原料是世界资源最丰富的可再生资源，从纤维质原料生产乙醇是一种很有前景的技术，其能够满足当今社会的能源挑战。根据美国2005年农业和能源部的研究报告，美国如果把每年13亿吨干重的生物质，转化为600亿加仑的乙醇，那么可以替代美国30％的交通燃料。秸秆作为一种丰富的农业副产物，成本低廉，以它作为原料能够降低生物乙醇的原料成本。

纤维质原料生产乙醇一般包括三步：预处理，酶解和发酵。现在主要的预处理方法是高温稀酸预处理和汽爆技术，预处理能够破坏原料对酶解过程的抵抗性，但是也产生了大量的抑制物，从而抑制了酵母在水解液中的生长与乙醇生产。为了能有效的发酵纤维素水解液，研究者提出了许多方法用于脱除水解液中的抑制物，以提高发酵效率包括碱中和，离子交换，溶剂萃取等方法，但这些不仅提高了成本，还增加了后续分离的难度。为了获得高的乙醇浓度，就需要一种能够耐受高的固体原料含量，高抑制物浓度的菌株，从而实现过程经济可行。

【发明内容】

本发明目的在于克服现有技术的不足，提供一种酿酒酵母菌株及其发酵秸秆生产乙醇的方法。

本发明提供一种酿酒酵母菌株Saccharomyces cerevisiae DQ1，CGMCCNo.2528；该酿酒酵母菌株的保藏单位是中国微生物菌种保藏委员会普通微生物中心(CGMCC)；保藏日期为2008年5月28日，由华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室生物质能源室培养制得。

本发明的菌种具有如下特征：

(1)在酵母浸膏琼脂平板30℃培养48小时，特征为呈卵形或者椭圆形；菌落为乳白色，表面光滑；

(2)能够发酵葡萄糖，蔗糖，不能够发酵木糖；

(3)具有宽泛的生长28～42℃温度，能够在高温30～40℃下发酵；

(4)生长pH范围：2～6；

(5)秸秆发酵过程，该菌能够承受高固体下应力作用，能够耐受高糖浓度，

(6)在含有抑制物浓度，甲酸0～4g/L，乙酸1～10g/L，糠醛0～5g/L，羟甲基糠醛0～5g/L，能够耐受抑制物的作用；

(7)培养方法为：在摇瓶或反应器内，温度控制37℃，转速150rpm，YPD培养基培养或用含有KH₂(PO₄)₃1～3g/L，MgSO₄0.2～2g/L，(NH₄)₂SO₄1～3g/L，酵母萃取粉或者玉米浆为0.5～2g/L，优选酵母萃取粉；YPD是指含有浓度为葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L，酵母萃取物10g/L的培养基。

一种利用酿酒酵母菌株发酵秸秆生产乙醇的方法，其步骤为，

(1)酵母菌株驯化：从酵母菌种保藏平板选取单菌落或甘油管，接种于合成培养基，温度30～37℃，摇床转速100～200rpm，培养16～24小时，OD600在5～12，以1％～15％(v/v)的接种量接入到含20％水解液的混合培养基培养，培养15～24小时，然后依次转接入含有40％，60％，80％，100％水解液的混合培养基，对菌种进行逐步的驯化；

所述的合成培养基中的葡萄糖，浓度为15～25g/L；

所述的OD₆₀₀指的是某种溶液在600nm波长处的吸光值；

所述的混合培养基中的葡萄糖，浓度为40～60g/L；

所述的混合培养基中的营养盐，组份浓度分别为KH₂(PO₄)₃1～3g/L，MgSO₄0.2～2g/L，(NH₄)₂SO₄1～3g/L，酵母萃取粉或者玉米浆为0.5～2g/L，优选酵母萃取粉；

(2)两级发酵种子的制备：从菌种保藏平板或冷冻的甘油管中，首先在摇瓶中合成培养基培养，温度30～37℃，摇床转速100～200rpm，培养16～24小时，然后再以1～15％的接种量，接入含有30～50％水解液的混合培养基中，转速为150～200rpm，培养18～24小时，然后5～10％的液体接种或离心后获取等量的细胞接种发酵；

所述的水解液是指秸秆稀酸预处理液或者蒸汽爆破秸秆酶解后离心所获得的上清液，其中，秸秆稀酸预处理液是将将秸秆在170～200℃，硫酸为0.5～5％(w/w)，处理时间为1～5分钟，获得的液体组份；蒸汽爆破秸秆酶解后离心所获得的上清液是在发酵罐中固体质量分数为10～20％(w/w)，加酶量在5～20FPU/gDM，FPU指纤维素酶液中的纤维素酶活，DM是指秸秆干重，50℃水解48～72小时，获得的固液混合物10000rpm，离心10分钟获得上清液；

(3)种子的扩大培养：根据发酵罐的装液量大小，可以扩大培养种子液的体积，其方法是，两级培养后的种子以1～15％的接种量，接入水解液中通气搅拌培养种子，逐次扩大获得更多的种子培养液；

(4)接种与发酵：在发酵罐中加入预处理秸杆原料，调整固体含量，利用纤维素酶在发酵接种前预先酶解时间为0～24小时，酶解温度在45～55℃，用酸或碱调节pH控制在4.5～5.0，发酵温度为30～40℃，发酵周期为48～84小时；以10％的接种量接入两级或多级培养所获得的种子，实现同步糖化发酵生产乙醇；

在发酵罐中加入预处理秸杆原料的方式为一次加入或者分批加入，固体质量分数为15～32％；

所述的纤维素酶液为纤维素酶和纤维二糖酶两种酶的混合或者一种同时含有纤维素酶和纤维二糖酶的酶液，加酶量为5～20FPU/DM；

所述的预先酶解是指加入酵母菌种之前，水解秸秆0～24小时，发酵罐中加入营养盐，组份浓度分别为KH₂(PO₄)₃1～3g/L，MgSO₄0.2～2g/L，(NH₄)₂SO₄1～3g/L，酵母萃取粉或玉米浆为0.5～2g/L，优选酵母萃取粉；

所述的酸选自浓度为98％的硫酸；

所述的碱选自饱和氢氧化钙溶液，氢氧化钠溶液或者氢氧化钠固体中的一种，优选饱和氢氧化钙溶液；氢氧化钠溶液浓度为50％；

所述的酵母菌种为酿酒酵母CGMCC No.2528；

在所述的混合培养基，水解液，发酵罐中含有抑制物，组份浓度为甲酸0～4g/L，乙酸1～10g/L，糠醛0～5g/L，羟甲基糠醛0～5g/L，酵母菌种CGMCCNo.2528能够耐受抑制物的作用；

所述的秸杆选自玉米秸杆，汽爆玉米秸杆，小麦秸秆或者稻子秸秆中的一种，优选为汽爆玉米秸杆。

图1为本发明适合于秸秆乙醇发酵的酿酒酵母培养及其应用方法示意图。

与现有技术相比，本发明的积极效果是：

(1)本发明是基于发酵菌株在含有抑制物的培养基中培养驯化能够提高其水解液耐受性，采用两级培养扩大提高了菌种的水解液存活能力，缩短了发酵时间，降低了成本，提高了乙醇产率和得率，适用于大规模应用；

(2)当前生物质原料预处理技术，都会产生许多抑制物，本发明能够实现纤维质原料发酵生产乙醇过程的可行性，解决纤维质乙醇发酵过程的关键问题；

(3)同现有技术相比，本发明适合于不同来源的生物质原料，具有工艺上的可移植性，能够促进纤维质原料生产乙醇的实质性发展；

(4)本发明采用可承受的营养盐浓度范围和酶解工艺，采用高的秸秆原料固体含量，充分利用水解液资源，提高了生产效率，降低了生产成本，环境友好，适合于大规模和工业化生产。

【附图说明】

图1为本发明秸秆乙醇发酵的酿酒酵母培养及其应用方法示意图；

图2实施例1发酵周期曲线。

【具体实施方式】

以下提供本发明一种酿酒酵母菌株及其发酵秸秆生产乙醇的方法的具体实施方式。

实施例1

请参见附图2，为发酵周期曲线，汽爆秸秆为原料，发酵罐初始固体含量为15％，加入纤维素酶15FPU/DM，50℃酶解12小时，按照两步培养的种子液以10％接入发酵罐中，随后补料操作；氢氧化钙饱和溶液调节pH为5.0，为营养盐浓度分别为KH₂(PO₄)₃2g/L，MgSO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，酵母萃取粉1g/L，使固体含量到达到25％，发酵周期控制在72小时，乙醇浓度到6.0％，得率在78％。

实施例2

玉米秸秆在180℃，5％硫酸浓度，预处理5min，获得预处理液和预处理秸杆，然后稀酸预处理秸杆调整液固比加酶15FPU/DM水解48小时，离心获得上清夜，用固体氢氧化钙调节pH；汽爆秸杆调整水含量同样加酶15FPU/DM水解48小时，离心后获得上清液。按照两级培养的方式，获得种子，以10％接种于离心后的水解液，种子培养和发酵营养盐浓度分别为KH₂(PO₄)₃3g/L，MgSO₄2g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，酵母萃取粉2g/L，37℃发酵72小时，乙醇基于葡萄糖的得率均在89％。

实施例3

玉米秸秆在200℃，0.5％硫酸浓度，预处理1min，获得预处理液和预处理秸杆，然后稀酸预处理秸杆调整液固比加酶5FPU/DM水解48小时，离心获得上清夜；汽爆秸杆调整水含量同样加酶解5FPU/DM糖化48小时，离心后获得上清液。按照两级培养的方式，获得种子，以10％接种于离心后的水解液，种子培养和发酵营养盐浓度分别为KH₂(PO₄)₃3g/L，MgSO₄2g/L，(NH₄)₂SO₄3g/L，酵母萃取粉2g/L，37℃发酵72小时，乙醇基于葡萄糖的得率均在85％。

实施例4

汽爆秸杆为原料，在发酵罐中调整固体含量为15％，加入相应浓度的纤维素酶20FPU/DM，加入盐浓度分别为KH₂(PO₄)₃1g/L，MgSO₄0.2g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，酵母萃取粉0.5g/L，50℃酶解12小时，降低温度在35～38℃，按照两级培养的种子液以10％接入发酵罐中，发酵周期控制在72小时，乙醇浓度达3.5％，得率在80％。

实施例5

汽爆秸杆为原料，在发酵罐中调整固体含量为15％，加入相应浓度的纤维素酶7FPU/DM，50℃酶解12小时，降低温度在35～38℃，按照种子扩大培养的方式，采用四级培养的种子液以10％接入发酵罐中，营养盐浓度分别为KH₂(PO₄)₃2g/L，MgSO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，酵母萃取粉1g/L，发酵周期控制在72小时，乙醇浓度达3.5％，得率在80％。

实施例6

汽爆秸秆为原料，发酵罐初始固体含量为15％，加入纤维素酶7FPU/DM，按照两步培养的种子液以10％接入发酵罐中，随后补料操作，使固体含量到达到25％，氢氧化钙饱和溶液调节pH 5.0，发酵周期控制在84小时；为营养盐浓度分别为KH₂(PO₄)₃2g/L，MgSO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，酵母萃取粉1，乙醇浓度到5.5％，得率在72％。

实施例7

汽爆秸杆为原料，在发酵罐中调整固体含量为30％，加入相应浓度的纤维素酶7FPU/DM，50℃酶解6小时，为营养盐浓度分别为KH₂(PO₄)₃2g/L，MgSO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄2g/L，酵母萃取粉1g/L，降低温度在35～38℃，按照两级培养的种子液以10％接入发酵罐中，发酵周期控制在72小时，乙醇浓度达7.2％，得率在67％。

实施例8

汽爆秸杆为原料，在发酵罐中调整固体含量为30％，加入相应浓度的纤维素酶7FPU/DM，50℃酶解12小时，为营养盐浓度分别为KH₂(PO₄)₃1g/L，MgSO₄1g/L，(NH₄)₂SO₄1g/L，酵母萃取粉1g/L，降低温度在38℃，按照两级培养的种子液以10％接入发酵罐中，发酵周期控制在72小时，乙醇浓度达7％，得率在65％。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围内。

Claims

1.一种酿酒酵母菌株，其特征在于，酿酒酵母菌株为Saccharomycescerevisiae DQ1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)登记保藏，保藏日期为2008年5月28日，保藏编号为CGMCCNo.2528。