CN107828829A - 一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，S1、将废弃的玉米秸秆在粉碎机中粉碎至40~120目玉米秸秆；将粉碎后质量分数为10~30%的玉米秸秆加入到反应釜中，并将水倒入反应釜中；S2、调节反应釜内物料pH5.5，温度为55~58℃，在反应釜中加入浓度为12~21u/g的纤维素酶，浓度为2u/g的α‑淀粉酶，浓度为80u/g的糖化酶，浓度为100~112ppm的木聚糖酶，酶解5~6h，灭酶后制得酶解液，测量溶液中总糖含量，并计算总糖回收率；S3、产油微生物菌种筛选，S4、复筛试验。本发明的有益效果是：总糖回收效率高、实现了利用秸秆等低值生物质转化微生物油脂、方法简单。
Description
技术领域
本发明涉及利用玉米秸秆生产，特别是一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法。
背景技术
目前，随着能源危机、粮食短缺、环境污染等问题越来越严重，如何使农业废弃物无害化、资源化利用已成为亟待解决的关键问题。玉米秸秆是一种丰富的农业废弃物，是可再生资源，是生物资源中应用潜力最大、储量最为丰富的资源之一。
玉米秸杆主要成分为纤维素、半纤维素、木质素，三者质量分数之和达70%以上，其它成分为水分、灰分、果胶、蛋白等。纤维素是由葡萄糖组成的大分子多糖，不溶于水及一般有机溶剂，纤维素中的葡萄糖以β-1，4苷键连接，比α-1，4苷键更难水解；半纤维素是由几种不同类型的单糖构成的异质多聚体，这些糖是五碳糖和六碳糖，包括木糖、阿拉伯糖、甘露糖和半乳糖组成，单糖聚合体间分别以共价键、氢键、醚键和酯键连接，它们与伸展蛋白、其它结构蛋白、纤维素、果胶等构成具有一定硬度和弹性的细胞壁，呈现出稳定的化学结构。木质素是由四种醇单体形成的一种复杂酚类聚合物。植物秸秆中木质素平均含量约15 -17%，不含易水解的重复单元，非水溶性、化学结构复杂，木质素与半纤维素以共价键形式结合，将纤维分子包埋其中，形成天然屏障，使纤维素酶不易与纤维素分子接触，因此利用秸杆生产微生物油脂过程中，打破木质素与半纤维素间的共价键所、释放出纤维分子，是有效提高秸秆水解程度的关键因素，促使玉米秸秆中纤维素、半纤维素、木质素裂解、转化成为可发酵性糖，以利微生物菌株生长与油脂生成。
传统秸秆水解以过量强酸水解、碱中和为主，除了对设备具有腐蚀性外，对环境、操作也有较大的影响，并且副反应较多，不利于后续的处理与应用；而以生物酶法水解则效率更高，副反应也更少，不后续应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺点，提供一种总糖回收效率高、实现了利用秸秆等低值生物质转化微生物油脂、方法简单的利用低值生物质发酵微生物油脂的方法。
本发明的目的通过以下技术方案来实现：一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，它包括以下步骤：
S1、将废弃的玉米秸秆在粉碎机中粉碎至40~120目玉米秸秆；将粉碎后质量分数为10~30%的玉米秸秆加入到反应釜中，并将水倒入反应釜中；
S2、调节反应釜内物料pH5.5，温度为55~58℃，在反应釜中加入浓度为12~21u/g的纤维素酶，浓度为2u/g的α-淀粉酶，浓度为80u/g的糖化酶，浓度为100~112ppm的木聚糖酶，酶解5~6h，灭酶后制得酶解液，测量溶液中总糖含量，并计算总糖回收率；
S3、产油微生物菌种筛选，其具体包括以下步骤：
S3（1）、菌种来源：菌种分离来自土壤，土壤样品采集地富含油脂的土壤，采样面积为25cm×25cm，采样深度5~20cm，采集时先用小铲除去表土，采样量约1000g，共采集土样8份，分别装入自封袋中，于0~5℃冰箱中保存备用；
S3（2）、分离筛选：称取土样5g，盛于装有45ml无菌生理盐水的玻珠三角瓶中，充分振荡混匀，制成悬液，无菌操作制成不同稀释梯度溶液，取0.5ml稀释溶液，分别涂布于筛选平板中，正置30min后，倒置于28℃恒温培养箱中培养2~5天，挑取平板上菌落形态有差异的单菌落进行划线分离纯化，从而获得的纯菌株；
S3（3）、制备分离培养基；
S3（4）、产油菌的初筛：将步骤S3（2）中分离纯化获得的菌株接入分离培养基中，将其在28℃、180r/min恒温摇床上培养3天，取1滴菌液于干净的载玻片上，涂布均匀，固定后加苏丹黑B染液染色10min，酒精脱色后再以流水冲至无色，用滤纸吸干，制成苏丹黑B染色片，显微镜下观察，选取染色深的菌株；该菌株因菌丝体发达，采用滤纸法对筛选霉菌菌丝进行苏丹黑B染色，即在28℃、180r/min恒温摇床上培养5天，以滤纸过滤菌液，滤纸上的菌丝轻压风干，浸泡于苏丹黑B染色液中10min，再用95%乙醇漂洗至滤纸呈白色，观察菌体，选取带有蓝黑色菌株；
S4、复筛试验：采用摇瓶液态培养法，在酶解液中接种蓝黑色菌株，接种量5%，在28℃、180r/min恒温摇床上培养5天，发酵结束后，发酵液以12000r/min离心5min，收集菌体，分别测定菌体生物量、脂含量及产脂量，从而实现了利用玉米秸秆发酵生产油脂。
所述的步骤S3（3）中分离培养基为酵母菌或霉菌。
所述的酵母菌用培养基由葡萄糖20g/L、酵母膏1 g/L、硫酸铵0.5 g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁1 g/L、孟加拉红0.05 g/L、链霉素0.02 g/L和琼脂20 g/L组成，并在pH6.2、温度为121℃条件下灭菌20min；
所述的霉菌为PDA培养基，临用前加入用少量乙醇溶解的氯霉素，1000ml培养基加0.1g氯霉素。
本发明具有以下优点：本发明总糖回收效率高、实现了利用秸秆等低值生物质转化微生物油脂、方法简单。
具体实施方式
下面对本发明做进一步的描述，本发明的保护范围不局限于以下所述：
实施例一：一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，它包括以下步骤：
S1、将废弃的玉米秸秆在粉碎机中粉碎至40目玉米秸秆；将粉碎后质量分数为18%的玉米秸秆加入到反应釜中，并将水倒入反应釜中；
S2、调节反应釜内物料pH5.5，温度为55℃，在反应釜中加入浓度为13u/g的纤维素酶，浓度为2u/g的α-淀粉酶，浓度为80u/g的糖化酶，浓度为105ppm的木聚糖酶，酶解5h，灭酶后制得酶解液，测量溶液中总糖含量，并计算出的总糖回收率为75.6%；
所述的木聚糖酶是由内切木聚糖酶、外切木糖苷酶和降解支链取代基的辅助酶组成的能将植物细胞壁中半纤维素的木聚糖降解成单糖的一组酶，通过对半纤维素的有效降解从而打破木质素与半纤维素所形成的对纤维素的包埋作用，实现对纤维素的有效利用，从而使植物秸秆的水解更为彻底；
S3、产油微生物菌种筛选，其具体包括以下步骤：
S3（1）、菌种来源：菌种分离来自土壤，土壤样品采集地富含油脂的土壤，采样面积为25cm×25cm，采样深度5~20cm，采集时先用小铲除去表土，采样量约1000g，共采集土样8份，分别装入自封袋中，于0~5℃冰箱中保存备用；
S3（2）、分离筛选：称取土样5g，盛于装有45ml无菌生理盐水的玻珠三角瓶中，充分振荡混匀，制成悬液，无菌操作制成不同稀释梯度溶液，取0.5ml稀释溶液，分别涂布于筛选平板中，正置30min后，倒置于28℃恒温培养箱中培养2~5天，挑取平板上菌落形态有差异的单菌落进行划线分离纯化，从而获得的纯菌株；
S3（3）、制备分离培养基，分离培养基分别适用于酵母菌或霉菌，所述的酵母菌用培养基由葡萄糖20g/L、酵母膏1 g/L、硫酸铵0.5 g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁1 g/L、孟加拉红0.05 g/L、链霉素0.02 g/L和琼脂20 g/L组成，并在pH6.2、温度为121℃条件下灭菌20min；所述的霉菌为PDA培养基，临用前加入用少量乙醇溶解的氯霉素，1000ml培养基加0.1g氯霉素；
S3（4）、产油菌的初筛：将步骤S3（2）中分离纯化获得的菌株接入分离培养基中，将其在28℃、180r/min恒温摇床上培养3天，取1滴菌液于干净的载玻片上，涂布均匀，固定后加苏丹黑B染液染色10min，酒精脱色后再以流水冲至无色，用滤纸吸干，制成苏丹黑B染色片，显微镜下观察，选取染色深的菌株；该菌株因菌丝体发达，采用滤纸法对筛选霉菌菌丝进行苏丹黑B染色，即在28℃、180r/min恒温摇床上培养5天，以滤纸过滤菌液，滤纸上的菌丝轻压风干，浸泡于苏丹黑B染色液中10min，再用95%乙醇漂洗至滤纸呈白色，观察菌体，选取带有蓝黑色菌株；
S4、复筛试验：采用摇瓶液态培养法，在酶解液中接种蓝黑色菌株，接种量5%，在28℃、180r/min恒温摇床上培养5天，发酵结束后，发酵液以12000r/min离心5min，收集菌体，分别测定菌体生物量、脂含量及产脂量，从而实现了利用玉米秸秆发酵生产油脂，使农业废弃物无害化、资源化利用，得到的重复利用玉米秸秆，同时避免了农民将玉米秸秆直接焚烧而污染大气，非常环保。
实施例二：本实施例与实施例一的区别在于：一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，它包括以下步骤：
S1、将废弃的玉米秸秆在粉碎机中粉碎至90目玉米秸秆；将粉碎后质量分数为20%的玉米秸秆加入到反应釜中，并将水倒入反应釜中；
S2、调节反应釜内物料pH5.5，温度为56℃，在反应釜中加入浓度为15u/g的纤维素酶，浓度为2u/g的α-淀粉酶，浓度为80u/g的糖化酶，浓度为115ppm的木聚糖酶，酶解5.5h，灭酶后制得酶解液，测量溶液中总糖含量，并计算出的总糖回收率为84.2%；。
实施例三：本实施例与实施例一的区别在于：一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，它包括以下步骤：
S1、将废弃的玉米秸秆在粉碎机中粉碎至120目玉米秸秆；将粉碎后质量分数为22%的玉米秸秆加入到反应釜中，并将水倒入反应釜中；
S2、调节反应釜内物料pH5.5，温度为58℃，在反应釜中加入浓度为17u/g的纤维素酶，浓度为2u/g的α-淀粉酶，浓度为80u/g的糖化酶，浓度为110ppm的木聚糖酶，酶解6h，灭酶后制得酶解液，测量溶液中总糖含量，并计算出的总糖回收率为81.3%；。
在不同物料质量分数、不同纤维酶浓度、不同木聚糖酶浓度下，总糖回收率如下表：
| 序号 | 物料质量分数 | 纤维素酶浓度（u/g） | 木聚糖酶浓度（ppm） | 总糖回收率 |
| 1 | 18% | 13 | 105 | 75.6% |
| 2 | 18% | 15 | 110 | 80.5% |
| 3 | 18% | 17 | 115 | 83.3% |
| 4 | 20% | 13 | 110 | 83.4% |
| 5 | 20% | 15 | 115 | 84.2% |
| 6 | 20% | 17 | 105 | 81.4% |
| 7 | 22% | 13 | 115 | 81.7% |
Claims (4)
1.一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，其特征在于：它包括以下步骤：
S1、将废弃的玉米秸秆在粉碎机中粉碎至40~120目玉米秸秆；将粉碎后质量分数为10~30%的玉米秸秆加入到反应釜中，并将水倒入反应釜中；
S2、调节反应釜内物料pH5.5，温度为55~58℃，在反应釜中加入浓度为12~21u/g的纤维素酶，浓度为2u/g的α-淀粉酶，浓度为80u/g的糖化酶，浓度为100~112ppm的木聚糖酶，酶解5~6h，灭酶后制得酶解液，测量溶液中总糖含量，并计算总糖回收率；
S3、产油微生物菌种筛选，其具体包括以下步骤：
S3（1）、菌种来源：菌种分离来自土壤，土壤样品采集地富含油脂的土壤，采样面积为25cm×25cm，采样深度5~20cm，采集时先用小铲除去表土，采样量约1000g，共采集土样8份，分别装入自封袋中，于0~5℃冰箱中保存备用；
S3（2）、分离筛选：称取土样5g，盛于装有45ml无菌生理盐水的玻珠三角瓶中，充分振荡混匀，制成悬液，无菌操作制成不同稀释梯度溶液，取0.5ml稀释溶液，分别涂布于筛选平板中，正置30min后，倒置于28℃恒温培养箱中培养2~5天，挑取平板上菌落形态有差异的单菌落进行划线分离纯化，从而获得的纯菌株；
S3（3）、制备分离培养基；
S3（4）、产油菌的初筛：将步骤S3（2）中分离纯化获得的菌株接入分离培养基中，将其在28℃、180r/min恒温摇床上培养3天，取1滴菌液于干净的载玻片上，涂布均匀，固定后加苏丹黑B染液染色10min，酒精脱色后再以流水冲至无色，用滤纸吸干，制成苏丹黑B染色片，显微镜下观察，选取染色深的菌株；该菌株因菌丝体发达，采用滤纸法对筛选霉菌菌丝进行苏丹黑B染色，即在28℃、180r/min恒温摇床上培养5天，以滤纸过滤菌液，滤纸上的菌丝轻压风干，浸泡于苏丹黑B染色液中10min，再用95%乙醇漂洗至滤纸呈白色，观察菌体，选取带有蓝黑色菌株；
S4、复筛试验：采用摇瓶液态培养法，在酶解液中接种蓝黑色菌株，接种量5%，在28℃、180r/min恒温摇床上培养5天，发酵结束后，发酵液以12000r/min离心5min，收集菌体，分别测定菌体生物量、脂含量及产脂量，从而实现了利用玉米秸秆发酵生产油脂。
2.根据权利要求1所述的一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，其特征在于：所述的步骤S3（3）中分离培养基为酵母菌或霉菌。
3.根据权利要求2所述的一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，其特征在于：所述的酵母菌用培养基由葡萄糖20g/L、酵母膏1 g/L、硫酸铵0.5 g/L、磷酸二氢钾1g/L、硫酸镁1 g/L、孟加拉红0.05 g/L、链霉素0.02 g/L和琼脂20 g/L组成，并在pH6.2、温度为121℃条件下灭菌20min。
4.根据权利要求2所述的一种利用低值生物质发酵微生物油脂的方法，其特征在于：所述的霉菌为PDA培养基，临用前加入用少量乙醇溶解的氯霉素，1000ml培养基加0.1g氯霉素。
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