CN101343644B - 一种以玉米秸秆为原料制备微生物油脂的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种以玉米秸秆为原料制备微生物油脂的方法，将玉米秸秆水解，水解液浓缩至总还原糖浓度在20g/L以上，在其中添加0-0.4g/L磷酸二氢钾和0-1.5g/L七水硫酸镁，灭菌后按体积比为5-20％接入产油微生物种子液，通气培养52-120小时，至发酵液中总还原糖浓度降至1％以下时停止，离心收集菌体，经常规的有机溶剂提取方法获得微生物油脂。每100g玉米秸秆可获得含油率为15％-66％的含油微生物干菌体16-28g，经提取可获得微生物油脂2.4-18.5g。本发明原料廉价、工艺简便、方法易行，是一种利用可再生资源、几乎不额外占用耕地、可连续生产的微生物油脂制备新途径。

Description

一种以玉米秸秆为原料制备微生物油脂的方法

技术领域

本发明是关于微生物油脂的制备方法，更具体地讲，是关于以玉米秸秆为原料制备微生物油脂的方法。玉米秸秆经粉碎和常规水解，获得水解液，经浓缩，使总还原糖浓度在20g/L以上。按体积比为5-20％将产油微生物种子液接种到秸秆水解液中，通气培养至发酵液中总还原糖浓度降至1％以下时停止，离心收集菌体，经常规的有机溶剂提取获得微生物油脂。本发明技术生产油脂几乎不依赖油料植物种植，且原材料资源丰富、可连续生产。

背景技术

长链脂肪酸甘油酯(油脂)是重要的食用品和化工原料。近年来，油脂还广泛应用于生产可再生能源产品生物柴油。因此，油脂资源的需求量日益显著增加。通常油脂来源于油料植物的种子和果实以及动物脂肪组织，其中油料植物是提取油脂的主要原料。种植油料植物和油料作物需要占用耕地，生产受到季节和自然条件的制约，不利于油脂原料稳定和连续供应。

许多微生物，如酵母、霉菌和藻类等在一定条件下，可以碳水化合物、碳氢化合物等为碳源，在体内合成并贮存大量脂肪酸甘油酯，这种油脂称为微生物油脂。据报道，部分微生物能在菌体内积累含量超过细胞干重60％以上的油脂，微生物油脂和一般植物油具有相似的脂肪酸组成，仍以C₁₆和C₁₈系脂肪酸为主。因此，微生物油脂是潜在的动植物油脂替代资源。

微生物发酵底物范围较广，包括可直接利用的葡萄糖、果糖、蔗糖、糖蜜等，以及需要经过预处理的淀粉、纤维素等。当前微生物油脂的研究主要是以淀粉质原料为发酵底物，利用产油霉菌生产富含多不饱和脂肪酸的油脂。利用廉价碳源，如木质纤维素水解产物，直接发酵生产微生物油脂的方法尚未见公开报道。

玉米秸秆资源高值化利用技术前景广阔，常见的有秸秆直接发酵生产沼气，秸秆水解液发酵生产燃料乙醇、乳酸等。以秸秆为原料，经高温、高压处理，获取“生物油(Bio-oil)”也有文献报道，但“生物油”含有醇、醛、酸、醚和水份等，组成非常复杂，性质不稳定，难以直接应用。

本发明涉及以廉价的玉米秸秆水解液为原料，利用产油微生物发酵制备微生物油脂，可为生物柴油及油脂化工产业提供新的油脂来源，这对于保障我国生物质能源产业和油脂化工行业健康发展都具有重要的意义。

发明内容

本发明提供一种以玉米秸秆为原料制备微生物油脂的方法。利用廉价的玉米秸秆木质纤维素为原料，经水解得到水溶性碳水化合物，经产油微生物转化获取油脂，将显著降低微生物油脂生产成本，形成节约耕地、可连续生产的油脂获取路线，并且还有利于环境保护和社会经济可持续发展。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种以玉米秸秆为原料制备微生物油脂的方法，按常规方法将玉米秸秆进行水解处理，获得水解液，将产油微生物种子液接种到秸秆水解液中，通气培养至发酵液中总还原糖浓度降至1％以下时停止，离心收集菌体，经常规的有机溶剂提取方法获得微生物油脂。

具体为：

(1)以玉米秸秆为原料，粉碎至20-100目，水解得到水解液，并浓缩到总还原糖浓度在20-100g/L，获得玉米秸秆水解液；

所述玉米秸秆的水解过程为：将玉米秸秆粉碎至20-100目，采用无机酸水溶液或纤维素酶对玉米秸秆原料进行水解处理，获得水解液。

(2)玉米秸秆水解液添加0-0.4g/L磷酸二氢钾和0-1.5g/L七水硫酸镁，调节pH至5.0-6.0，经灭菌后用作发酵培养基；

(3)按体积比为5-20％于发酵培养基中接入产油微生物种子液，于25-37℃通气培养52-120小时，离心收集含油菌体；含油干菌体对玉米秸秆原料得率16％-28％(w/w)，干菌体含油率15％-66％(w/w)。

所述有机溶剂提取方法为：将发酵液离心，收集菌体并洗涤；按每克干菌体加入2-4mol/L盐酸5-10mL，于78℃水浴处理0.5-1小时，冷却后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿层，用0.1％的氯化钠水溶液洗涤，以无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经浓缩除去低沸点有机溶剂，并在105℃干燥得到微生物油脂。

(4)所述产油微生物包括红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi、粘红酵母Rhodotorula glutinis、亚罗解脂酵母Yarrowia lipolytica、皮状丝孢酵母Trichosporoncutaneum、深黄被孢霉Mortierella isabellina或少根根霉Rhizopusarrhizus。

本发明具有如下优点：

1、原料成本低。玉米秸秆是农业生产副产物，据统计我国年产量达亿吨，目前尚未得到充分利用，部分地区还造成了环境污染。玉米秸秆易于收集，加工粉碎和水解相对容易，水解液主要是纤维素和半纤维素降解的糖及其它副产物，可用于培养产油微生物。本发明提供了一种由廉价原料制备微生物油脂的方法，拓展了制备微生物油脂的原料来源，可降低微生物油脂制备成本。

2、产油微生物将油脂储存在细胞内，易于进行产物的分离和提取。本发明中每100g玉米秸秆可获得含油率为15％-66％(w/w)的含油微生物干菌体16-28g，经提取可获得微生物油脂2.4-18.5g。

3、本发明可用于大量获取油脂，具有不额外占用耕地、可连续生产、不受场地、季节和气候等变化的影响，是对传统植物油脂生产技术的重要补充，而且有利于资源综合利用和环境保护，可获得显著的综合效益。

综上所述，本发明原料成本低、工艺简便、方法易行，是一种利用可再生资源、几乎不额外占用耕地、可连续生产的微生物油脂制备新途径，为微生物油脂的制备提供了一种新的原料来源。

具体实施方式

首先参考文献方法(中国资源综合利用，2003，(11)，9-11；华南理工大学学报，1997，25(8)，10-15；中国资源综合利用，2004，(8)，25-27)制备玉米秸秆水解液。将玉米秸秆粉碎至20-100目，采用硫酸和磷酸等无机酸水溶液或纤维素酶对玉米秸秆原料进行水解处理，获得水解液，经浓缩至总还原糖浓度在20g/L以上，添加0-0.4g/L磷酸二氢钾和0-1.5g/L七水硫酸镁，调节pH至5.0-6.0，高温灭菌，以5-20％(v/v)的接种量接入产油微生物种子液(活菌数2×10⁶-3×10⁶个/毫升)，于25-37℃通气培养52-120小时，离心收集含油菌体，经常规的有机溶剂提取方法获得微生物油脂。利用该技术含油干菌体对玉米秸秆原料得率16％-28％(w/w)，菌体含油率15％-66％(w/w)。

本发明使用的产油微生物包括红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides、斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi、粘红酵母Rhodotorulaglutinis、亚罗解脂酵母Yarrowia lipolytica、皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum、深黄被孢霉Mortierella isabellina或少根根霉Rhizopus arrhizus。产油微生物在液体种子培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，余量为水，pH 5.8～6.0)中，于30℃，180-200转/分钟振荡培养24小时，制得发酵种子液。

本发明使用常规的有机溶剂提取方法获得微生物油脂，具体是按每克干菌体加入2-4mol/L盐酸5-10mL，于78℃水浴处理0.5-1小时，冷却后加入有机溶剂提取，浓缩除去低沸点有机溶剂，于105℃干燥得到微生物油脂。

本发明产油微生物干菌体是指经离心分离和洗涤得到的菌体，并在105℃干燥至恒重。菌体油脂含量是通过有机溶剂提取方法提取的油脂质量除以提取时所使用产油微生物干菌体的质量而得到。

实施例1

1)玉米秸秆水解液制备：参考文献方法(中国资源综合利用，2003，(11)，9-11)制备玉米秸秆酸水解液。将玉米秸秆粉碎至40目，称取50克，采用稀硫酸水溶液进行水解处理，获得水解液，经浓缩至总还原糖浓度为21g/L，添加0.4g/L磷酸二氢钾和1.5g/L七水硫酸镁，用1mol/L氢氧化钠调节pH至5.0，于121℃灭菌15分钟；

2)油脂发酵：以10％(v/v)接种量接入产油红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(活菌数2×10⁶个/毫升)，于30℃通气培养60小时，停止发酵；将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体、洗涤，并在105℃干燥至恒重，得到干菌体8.0g/L；

3)微生物油脂提取：按每克干菌体加入2.0mol/L盐酸10mL，于78℃水浴处理1小时，冷却后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿层，用0.1％的氯化钠水溶液洗涤，以无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经浓缩除去低沸点有机溶剂，并在105℃干燥得到微生物油脂，菌体油脂含量15％。

实施例2

1)玉米秸秆水解液制备：参考文献方法(中国资源综合利用，2003，(11)，9-11)制备玉米秸秆酸水解液。将玉米秸秆粉碎至100目，称取50克，采用稀硫酸水溶液进行水解处理，获得水解液，经浓缩至总还原糖浓度为24g/L，添加1.5g/L七水硫酸镁，用1mol/L氢氧化钠调节pH至5.8，于121℃灭菌15分钟；

2)油脂发酵：以10％(v/v)接种量接入产油红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389的种子液(活菌数3×10⁶个/毫升)，于25℃通气培养52小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，在105℃干燥至恒重，得到干菌体5.6g/L；

3)微生物油脂提取：按每克干菌体加入4.0mol/L盐酸5mL，于78℃水浴处理0.5小时，冷却后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿层，用0.1％的氯化钠水溶液洗涤，以无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经浓缩除去低沸点有机溶剂，并在105℃干燥得到微生物油脂，菌体油脂含量62％。

实施例3

1)玉米秸秆水解液制备：参考文献方法(华南理工大学学报，1997，25(8)，10-15)制备玉米秸秆酸水解液。将玉米秸秆粉碎至40目，称取50克，采用浓硫酸进行水解处理，获得水解液，经浓缩至总还原糖浓度为30g/L，添加0.2g/L磷酸二氢钾和1.0g/L七水硫酸镁，用1mol/L氢氧化钠调节pH至5.5，于121℃灭菌15分钟；

2)油脂发酵：以10％(v/v)接种量接入产油红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389种子液(活菌数2.5×10⁶个/毫升)，于37℃通气培养84小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，在105℃干燥至恒重，得到干菌体12.0g/L；

3)微生物油脂提取：按每克干菌体加入3.0mol/L盐酸5mL，于78℃水浴处理1小时，冷却后加入甲醇和氯仿萃取，收集氯仿层，用0.1％的氯化钠水溶液洗涤，以无水硫酸钠干燥，过滤，滤液经浓缩除去低沸点有机溶剂，并在105℃干燥得到微生物油脂，菌体油脂含量30％。

实施例4

1)玉米秸秆水解液制备：参考文献方法(中国资源综合利用，2003，(11)，9-11)制备玉米秸秆酸水解液。将玉米秸秆粉碎至40目，称取50克，采用稀硫酸水溶液进行水解处理，获得水解液，经浓缩至总还原糖浓度为45g/L，添加0.4g/L磷酸二氢钾和1.5g/L七水硫酸镁，用1mol/L氢氧化钠调节pH至5.8，于121℃灭菌15分钟；

2)油脂发酵：以10％(v/v)接种量接入产油红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389种子液(活菌数3.0×10⁶个/毫升)，于30℃通气培养90小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，在105℃干燥至恒重，得到干菌体9.4g/L；

3)微生物油脂提取：按实施例3步骤3)操作，菌体油脂含量66％。

实施例5

1)玉米秸秆水解液制备：参考文献方法(中国资源综合利用，2004，(8)，25-27)制备玉米秸秆酶水解液。将玉米秸秆粉碎至20目，称取50克，采用纤维素酶进行水解处理，获得水解液，经浓缩至总还原糖浓度为55g/L，添加0.4g/L磷酸二氢钾和1.5g/L七水硫酸镁，用1mol/L氢氧化钠调节pH至6.0，于121℃灭菌15分钟；

2)油脂发酵：以10％(v/v)接种量接入产油红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389种子液(活菌数3.0×10⁶个/毫升)，于30℃通气培养96小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，在105℃干燥至恒重，得到干菌体14.0g/L；

3)微生物油脂提取：按实施例3步骤3)操作，菌体油脂含量63％。

实施例6

与实施例1不同之处在于，步骤1)中玉米秸秆水解液的总还原糖浓度为100g/L；步骤2)中使用产油斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS

2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，接种量为20％(v/v)(活菌数4.0×10⁶个/毫升)，培养时间为120小时。实施结果得到干菌体21.0g/L，菌体油脂含量23％。

实施例7

与实施例1不同之处在于，步骤1)中玉米秸秆水解液的总还原糖浓度为48g/L；步骤2)中使用产油斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi AS

2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，接种量为10％(v/v)(活菌数3.0×10⁶个/毫升)，培养时间为96小时。实施结果得到干菌体8.0g/L，菌体油脂含量15％。

实施例8

与实施例4不同之处在于，步骤1)中玉米秸秆水解液的总还原糖浓度为27g/L；步骤2)中使用产油粘红酵母Rhodotorula glutinis AS 2.499(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，培养时间为86小时。实施结果得到干菌体11.0g/L，菌体油脂含量32％。

实施例9

与实施例1不同之处在于，步骤2)中使用产油微生物亚罗解脂酵母Yarrowia lipolytica AS 2.1398(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。实施结果得到干菌体8.5g/L，菌体油脂含量27％。

实施例10

与实施例1不同之处在于，步骤2)中使用产油微生物皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)。实施结果得到干菌体7.1g/L，菌体油脂含量55％。

实施例11

与实施例1不同之处在于，步骤2)中使用产油微生物深黄被孢霉Mortierella isabellina AS 3.3410(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，接种量为5％(v/v)(活菌数3.0×10⁶个/毫升)。实施结果得到干菌体6.8g/L，菌体油脂含量33％。

实施例12

与实施例1不同之处在于，步骤2)中使用产油微生物少根根霉Rhizopus arrhizus AS 3.2896(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，接种量为5％(v/v)(活菌数3.0×10⁶个/毫升)。实施结果得到干菌体7.7g/L，菌体油脂含量25％。

Claims (1)

1.一种以玉米秸秆为原料制备微生物油脂的方法，其特征在于：首先将玉米秸秆进行水解处理，将其中的木质纤维素水解成水溶性碳水化合物，获得水解液，将产油微生物种子液接种到秸秆水解液中，通气培养至发酵液中总还原糖浓度降至1％以下时停止，离心收集菌体，经有机溶剂提取方法获得微生物油脂；

所述产油微生物选自红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides、斯达氏油脂酵母Lipomyces starkeyi、粘红酵母Rhodotorula glutinis、亚罗解脂酵母Yarrowia lipolytica、皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum或深黄被孢霉Mortierella isabellina；

具体过程如下：

(1)以玉米秸秆为原料，粉碎至20-100目，水解得到水解液，并浓缩到总还原糖浓度在20-100g/L；

(2)玉米秸秆水解液添加0-0.4g/L磷酸二氢钾和0-1.5g/L七水硫酸镁，经灭菌后用作发酵培养基；

(3)按体积比为5-20％于发酵培养基中接入产油微生物种子液，于25-37℃通气培养52-120小时，离心收集含油菌体，经有机溶剂提取方法获得微生物油脂。