CN103013834A - 一种产油微生物的培养方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种产油微生物培养的新方法，即利用纤维二糖和木糖混合物为主要碳源物质，添加其他必要营养物质，通气培养产油微生物，并制备微生物油脂。纤维二糖和木糖混合物可以由木质纤维素原料水解制备。木质纤维素原料完全水解通常得到由葡萄糖和木糖为主要成份的水解液，用于培养微生物时存在葡萄糖效应，发酵周期长。本发明规避了葡萄糖效应，培养周期缩短，生产效率和原料利用率提高，成本降低，改善了微生物油脂的技术经济性，可应用于转化生物质资源制备微生物油脂和生物柴油。

Description

一种产油微生物的培养方法
技术领域
本发明涉及一种产油微生物的培养方法，属于生物技术领域。更具体地讲，是在纤维二糖和木糖为主要碳源的培养基中培养产油微生物，并实现产油微生物细胞内积累超过细胞干重20％以上的油脂。该油脂含有一种或多种长链脂肪酸及其衍生物，可用于制备生物柴油或其他高附加值产品。
背景技术
某些酵母、霉菌、细菌和藻类等在一定条件下，能够以碳水化合物、碳氢化合物等为碳源，在体内合成并贮存大量油脂，凡是可以在胞内油脂积累超过细胞干重20％的微生物称为产油微生物(Ratledge C，Wynn JP.AdvAppl Microbiol，2002，51：1 52)。某些产油微生物的甚至可以积累超过其细胞干重的70％的微生物油脂。微生物油脂，尤其是酵母产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，以C14-C22长链脂肪酸为主。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，被认为是很有潜力的新型油脂资源。因此，微生物油脂不仅可能作为食用油或其他功能性油脂的替代品，还可能在可再生液体燃料生物柴油产业发展中发挥重要作用(赵宗保.中国生物工程杂志，2005，25(2)：811)。
当培养基中含有葡萄糖和木糖时，绝大部分微生物优先利用葡萄糖；只有当葡萄糖浓度较低时才开始利用木糖，称为葡萄糖效应(Dien BS，etal.Appl Microbiol Biotechnol，2003，63：258 266)。葡萄糖效应的直接结果就是微生物培养过程出现二次生长现象。据文献报道，产油微生物斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi(孔祥莉，等.生物加工过程，2007，5(2)：3641)、发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans(Huang C，etal.Bioresour Technol，2009，100(19)：4535 4538)等在利用葡萄糖和木糖的混合物时，优先利用葡萄糖。当产油微生物的培养基存在葡萄糖和其他碳源时，菌体出现二次生长现象，导致发酵周期延长、效率降低、生产成本提高。
木质纤维素材料来源广泛、资源总量丰富，其化学成份主要是纤维素、半纤维素和木质素。纤维素完全水解主要产物为葡萄糖；半纤维素水解可得到木糖、阿拉伯糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖等的混合物。利用木质纤维素水解液培养产油微生物，有可能大幅度降低原料成本，并使规模化制备微生物油脂的原材料得到保障。然而，当前木质纤维素的水解技术得到以葡萄糖和木糖等单糖为主要成分的水解产物。由于微生物，包括产油微生物，普遍存在葡萄糖效应，利用木质纤维素水解液培养微生物存在发酵周期长、效率低、成本高的共性技术问题。
关于规避微生物培养的葡萄糖效应，已有文献报道。在连续发酵过程中将葡萄糖浓度控制在较低水平，并采用合适的稀释速率可实现葡萄糖和木糖同步利用(Kastner J，et al.J Ind Microbiol Biot，1998，20(6)：339343)。利用葡萄糖磷酸转移酶突变株，也可解除葡萄糖抑制，实现葡萄糖和木糖同步利用(Nichols NN，et al.Appl Microbiol Biotechnol，2001，56：120 125)。以上方法通过改变过程操作条件或改造菌株遗传特性，达到了葡萄糖和木糖得被同步利用的目的；但是，这些方法不具备普遍实用性。
为了充分利用木质纤维素中的纤维素和半纤维素资源，并显著改善利用木质纤维素水解产物培养产油微生物的技术经济性，必须寻找其他方法规避葡萄糖效应。文献报道，细胞膜上表达β-葡萄糖苷酶的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae基因工程菌株，可以同时利用纤维二糖和木糖发酵生产乙醇(Nakamura N，et al.Enzyme Microb Technol，2008，43：233 236)。另外，通过表达纤维糊精转运系统和内源β-葡萄糖苷酶的方式获得的酿酒酵母Saccharomyces cerevisiae工程菌株，也可利用纤维二糖和木糖发酵产乙醇(Ha S-J，et al.PNAS，2011，108(2)：504 509)。
纤维二糖由两分子葡萄糖通过β-1，4-糖苷键连接形成的二糖，也可以认为是纤维素的基本重复结构单位。纤维二糖经酸催化或β-葡萄糖苷酶催化水解得到葡萄糖。通过控制水解条件，如降低催化剂的浓度或活性，可以使木质纤维素水解产物中含有大量纤维二糖，而葡萄糖含量较低。因此，可以水解木质纤维素原料获取以纤维二糖和木糖为主要成分的水解产物。筛选高效利用纤维二糖的产油微生物，具有重要应用价值。
发明内容
规避产油微生物的葡萄糖效应可显著促进碳源有效利用，缩短发酵周期，改善微生物油脂的技术经济性。因此，发明人对产油微生物进行了筛选，发现部分产油微生物能够有效利用纤维二糖作为碳源生长并积累油脂。进而，发现可利用纤维二糖和木糖的混合糖培养产油微生物，并且在培养过程中混合糖消耗速度快，所得到的菌体富含油脂。基于上述发现，本发明提出一种产油微生物的培养新方法，其特点在于培养基的碳源中纤维二糖的质量含量为20％-90％，并且木糖的质量含量为5％-75％。该方法使产油微生物培养更高效地利用木质纤维素来源的原料，提高微生物油脂生产的技术经济性，具有广阔应用前景。该方法获得的微生物油脂含有一种或多种脂肪酸及其衍生物，可用于制备生物柴油或其他高附加值产品。
本发明通过下述技术方案予以实现：
1、制备产油培养基。通过下述方法的一种或它们的必要组合方法获得培养基：
A.将碳源物质纤维二糖、木糖和其他微生物培养常见的碳源物质，葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖或甘油制成水溶液，其中纤维二糖和木糖分别占总碳源物质的20％-90％和5％-75％，其他碳源物质占总碳源物质的0％-20％，添加其他微生物培养常用营养物质，包括氮源、磷源、硫源、无机盐、维生素或它们的组合，调整pH 4.0-8.0，灭菌后备用；
B.将木质纤维素原料水解，得到主要成分为纤维二糖和木糖的水解液，其中纤维二糖和木糖分别占总碳源物质的20％-90％和5％-75％，添加其他微生物培养常用营养物质，包括氮源、磷源、硫源、无机盐、维生素或它们的组合，调整pH 4.0-8.0，灭菌后备用；
C.将木质纤维素原料水解，所得水解液添加适量纤维二糖或木糖，制成水溶液，其中纤维二糖和木糖分别占总碳源物质的20％-90％和5％-75％，添加其他微生物培养常用营养物质，包括氮源、磷源、硫源、无机盐、维生素或它们的组合，调整pH 4.0-8.0，灭菌后备用；
2、木质纤维素水解液的制备。为了获得以纤维二糖和木糖为主要成分的木质纤维素水解液，本发明采用文献方案通过部分去除商品纤维素酶制剂中β-葡萄糖苷酶活性(Homma T et al.Biotechnol Bioeng，1993，41：405 410)、或水解过程中使用β-葡萄糖苷酶抑制剂(Kim M，Day D F.ApplBiochem Biotechnol，2010，162：1379 1390)、或通过纤维素酶回收复用的方法(夏黎明，岑沛霖.浙江大学学报，1999，33(4)：381 385)，或通过不添加β-葡萄糖苷酶组分的酶混合物(Zhou et al.BioresourTechnol，2009，100：819 825)，水解木质纤维素原料，使水解中间产物纤维二糖进一步降解为葡萄糖的速度显著降低，水解液中纤维二糖相对含量高，用于制备产油微生物培养基。
3、产油微生物培养。向步骤1所述培养基中接种产油微生物种子液(每毫升含105～108个活细胞)，接种量2％-20％(v/v)，在20℃-37℃下通空气培养，至发酵液中残糖浓度低于5g/L，终止发酵，收集菌体。
4、生物量和油脂量的测定。参照文献(Li YH，et al.Enzyme MicrobTechnol，2007，41：312 317)的方法，发酵液经离心、洗涤，收集菌体沉淀。菌体在105℃干燥至恒重，即得干菌体。参照文献(李植峰，等.微生物学通报，2001，28(6)：72 75)使用酸热-有机溶剂法抽提获得油脂，计算菌体油脂含量。
5、生物柴油的制备。参照文献(Liu B，Zhao Z B.J Chem TechnolBiotechnol，2007，82(8)：775 780)的方法，直接利用产油微生物菌体为原料，在酸催化条件下转酯化制备生物柴油；或参照文献(里伟，等.过程工程学报，2007，7(1)：137 140)的方法，利用提取的微生物油脂，在酶催化条件下转酯化制备生物柴油。
本发明所述的微生物油脂主要为长链脂肪酸及其衍生物的甘油酯，经转酯化后，可制成生物柴油。微生物油脂含有的不饱和脂肪酸还可用于制备其他高附加值产品。
本发明所述的其他微生物培养常用营养物质，包括氮源、磷源、硫源和维生素，为微生物培养过程普遍使用的物质，如酵母粉、蛋白胨、铵盐、硫酸盐、磷酸盐、硫胺素等或它们的组合，其中氮源质量为碳源总质量的0.1％-25％、磷源质量为碳源总质量的0.01％-25％、硫源质量为碳源总质量的0.01％-10％。
本发明所述的木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的生物质材料，如玉米秸秆、麦秆、稻草、林业生产下脚料、松木、云杉中的一种或二种以上组合。
本发明所述产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20％的真核微生物，它们包括但不限于，油脂酵母，如斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi；红酵母，如圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides、粘红酵母Rhodotorula glutinis和掷孢酵母Sporobolomycesroseus；丝孢酵母，如皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum和发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans；隐球酵母，如白色隐球酵母Cryptococcus albidus和弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus；霉菌，如伯顿拟内孢霉Endomycopsis burtonii、健强地霉Geotrichum robustum、深黄被孢霉Mortierella isabellina和卷枝毛霉Mucor circinelloides；产油微藻，如布朗葡萄藻Botryococcus braunii、寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii、原壳小球藻Chlorella protothecoides和裂殖壶菌Schizochytrium limacinum。这些菌株可以直接从中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)、美国典型培养物保藏中心(ATCC)、中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)、或澳大利亚CSIRO微藻研究中心等菌种保藏机构购买或从自然界中分离，也可以使用与原来菌株性状不同的人工或自然突变菌株。
本发明的有益效果是：
1)本发明以纤维二糖和木糖为主要碳源，为培养产油微生物并制备微生物油脂提供了一种新方法；
2)木质纤维素原料含有纤维素和半纤维素，通常水解后得到以葡萄糖和木糖为主的水解产物；然而，利用葡萄糖和木糖混合物培养微生物，通常出现葡萄糖效应，即微生物先利用葡萄糖，再利用木糖，结果造成发酵周期长，效率低。本发明将木质纤维素原料水解为以纤维二糖和木糖为主的水解产物，用于培养产油微生物，培养过程规避了葡萄糖效应，发酵周期缩短，糖利用效率和生产强度提高，成本降低，具有明显的经济效益；
3)在木质纤维素原料水解所用的酶制剂中通常需要使用活性较高的β-葡萄糖苷酶，以使纤维素酶水解中间产物纤维二糖完全水解得到葡萄糖。由于本发明采用以纤维二糖和木糖为主要碳源的产油微生物培养技术，水解产物中纤维二糖含量较高。因此，可在制备木质纤维素原料水解的酶制剂时不使用或减量使用β-葡萄糖苷酶。所以，应用本发明的技术转化木质纤维素原料，可降低原料处理过程酶用量，降低成本，具有明显的综合技术优势；
4)与充分水解木质纤维素原料得到以葡萄糖和木糖为主的水解产物，再用于培养产油微生物的现有技术相比，本发明总体上具有发酵时间短、原料利用效率高、成本低的技术优势，可更有效地将木质纤维素原料转化为微生物油脂，用于制备生物柴油及其他高附加值产品。因此，本发明具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为对比例1中底物消耗、生物量和油脂量曲线。
图2为实施例1中底物消耗、生物量和油脂量曲线。
具体实施例
对比例1
1)将葡萄糖和木糖配制成混合糖溶液，葡萄糖47g/L，木糖23g/L，添加0.5g/L酵母粉，1.0g/L硫酸铵，1.0g/L七水硫酸镁，1.0g/L磷酸氢二钾，余量为水，pH 5.8，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)在YEPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中接入斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)，30℃，200rpm振荡培养40h，得种子液(每毫升含107个活细胞)；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养144h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余的葡萄糖和木糖浓度分别为0g/L和2.5g/L，发酵过程中首先观察到葡萄糖浓度下降，当葡萄糖浓度很低时木糖浓度开始下降；固液分离收集菌体，得干菌体23.6g/L，油脂量12.6g/L。
实施例1
1)将纤维二糖和木糖配制成混合糖溶液，纤维二糖47g/L，木糖23g/L，添加0.5g/L酵母粉，1.0g/L硫酸铵，1.0g/L七水硫酸镁，1.0g/L磷酸氢二钾，余量为水，pH 5.8，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi AS 2.1560在YEPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，30℃，200rpm振荡培养40h，得种子液；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液(每毫升含107个活细胞)，接种量10％(v/v)，在30℃下通气培养108h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖和木糖浓度分别为0.5g/L和0g/L，发酵过程中，纤维二糖和木糖浓度同时下降；固液分离收集菌体，得干菌体26.7g/L，油脂量13.2g/L。
通过比较对比例1和实施例1的实验结果，发现，在总糖浓度以及发酵条件相同情况下，实施例1到达发酵终点所需时间为108h，是对比例1发酵时间的76％，发酵时间明显缩短。实施例1发酵结束时残糖浓度为0.5g/L，比对比例1浓度更低，表明在纤维二糖和木糖共发酵条件下，总糖消耗速率提高；同时，与对比例1比较，实施例1获得的油脂量更高，提高了4.8％，实施例1获得的非油生物量是对比例1的1.23倍，而非油生物体适合作为饲料。因此，采用实施例1的方案培养产油微生物的生产效率和原料利用效率提高，成本降低。
实施例2
1)将纤维二糖和木糖配制成混合糖溶液，纤维二糖35g/L，木糖35g/L，添加0.5g/L酵母粉，0.5g/L硫酸铵，1.0g/L七水硫酸镁，7.0g/L磷酸二氢钾，2.0g/L磷酸氢二钠，余量为水，pH 5.5，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)掷孢酵母Sporobolomyces roseus IAM 13481(购自日本JCM菌株保藏中心)在液体种子培养基(葡萄糖40g/L，硫酸铵5g/L，酵母粉0.5g/L，磷酸二氢钾1g/L，七水硫酸镁0.5g/L)中，30℃，200rpm振荡培养24h，得种子液(每毫升含5×106个活细胞)；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在30℃下通气培养103h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖和木糖浓度分别为3.8g/L和1.1g/L；固液分离收集菌体，得干菌体22.9g/L，油脂量9.8g/L。
实施例3
1)将纤维二糖和木糖配制成混合糖溶液，纤维二糖23g/L，木糖47g/L，添加1.0g/L酵母粉，2.0g/L硫酸铵，0.5g/L七水硫酸镁，2.0g/L磷酸氢二钾，余量为水，pH 4.0，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)健强地霉Geotrichum robustum CICC 1256(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)在YEPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，28℃，200rpm振荡培养28h，得种子液(每毫升含8×105个活细胞)；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在28℃下通气培养120h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖和木糖浓度分别为0.5g/L和2.3g/L；固液分离收集菌体，得干菌体21.7g/L，油脂量8.4g/L。
实施例4
1)将纤维二糖、木糖、葡萄糖和果糖配制成混合糖溶液，纤维二糖25g/L，木糖35g/L，葡萄糖5g/L，果糖5g/L，添加1.0g/L酵母粉，0.1g/L氯化铵，1.0g/L氯化镁，0.1g/L硫酸钠，11.8g/L磷酸二氢钾，3.7g/L磷酸氢二钠，余量为水，pH 6.0，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)皮状丝孢酵母Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)在YEPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，32℃，200rpm振荡培养20h；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在32℃下通气培养112h，得种子液；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖和木糖的浓度分别为3.8g/L和0.5g/L；固液分离收集菌体，得干菌体19.1g/L，油脂量8.4g/L。
实施例5
1)将纤维二糖、木糖和蔗糖配制成混合糖溶液，纤维二糖40g/L，木糖25g/L，蔗糖5g/L，甘油3g/L，添加0.5g/L酵母粉，1.0g/L硫酸铵，1.0g/L七水硫酸镁，2.7g/L磷酸二氢钾，0.9g/L磷酸氢二钠，余量为水，pH 5.5，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)白色隐球酵母Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自美国典型培养物保藏中心)在YEPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L)中，20℃，200rpm振荡培养28h，得种子液(每毫升含8×107个活细胞)；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量12％(v/v)，在20℃下通气培养144h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖和蔗糖的浓度分别为0.7g/L，1.5g/L和0.4g/L；固液分离收集菌体，得干菌体21.9g/L，油脂量11.0g/L。
实施例6
1)将纤维二糖、木糖和乳糖配制成混合糖溶液，纤维二糖10g/L，木糖10g/L，乳糖2g/L，添加2.0g/L酵母粉，0.1g/L硫酸铵，1.5g/L七水硫酸镁，1.0g/L磷酸氢二钾，余量为水，pH 6.5所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)圆红冬孢酵母Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)在YEPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，37℃，200rpm振荡培养24h，得种子液(每毫升含4×107个活细胞)；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量20％(v/v)，在37℃下通气培养48h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖为2.1g/L；固液分离收集菌体，得干菌体5.7g/L，油脂量1.5g/L。
实施例7
1)将纤维二糖、木糖、乳糖和半乳糖配制成混合糖溶液，纤维二糖30g/L，木糖10g/L，乳糖2g/L，半乳糖2g/L，添加2g/L酵母粉，2g/L柠檬酸钠，2g/L磷酸氢二钾，0.5g/L硫酸镁，余量为水，pH 6.0所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)深黄被孢霉Mortierella isabellina AS 3.3410(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)在液体种子培养基(葡萄糖80g/L，尿素3g/L，酵母粉1g/L，磷酸氢二钾1g/L)中，25℃，200rpm振荡培养36h，得种子液(每毫升含8×106个活细胞)；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量5％(v/v)，在25℃下通气培养72h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖、乳糖和半乳糖浓度分别为1.1g/L，0.5g/L，0.5g/L和0.1g/L；固液分离收集菌体，得干菌体10.7g/L，油脂量3.8g/L。
实施例8
1)将纤维二糖、木糖和阿拉伯糖配制成混合糖溶液，纤维二糖40g/L，木糖17g/L，阿拉伯糖3g/L，添加0.5g/L酵母粉，0.1g/L硫酸铵，2g/L磷酸氢二钾，0.5g/L七水硫酸镁，0.2g/L氯化钙，0.01g/L七水硫酸亚铁，0.01g/L七水硫酸锌，1mg/L硫酸锰，0.5mg/L五水硫酸铜，余量为水，pH 5.5，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)卷枝毛霉Mucor circinelloides AS 3.2208(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)在PDA液体培养基中，28℃，200rpm振荡培养30h；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在25℃下通气培养120h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖和阿拉伯糖的浓度分别为1.8g/L，0.5g/L和1.2g/L；固液分离收集菌体，得干菌体15.7g/L，油脂量6.1g/L。
实施例9
1)将纤维二糖、木糖和葡萄糖配制成混合糖溶液，纤维二糖15g/L，木糖40g/L，葡萄糖5g/L，添加2.0g/L酵母粉，0.3g/L氯化铵，0.5g/L七水硫酸镁，1.0g/L磷酸氢二钾，微量元素溶液1％(v/v)，余量为水，pH 5.5，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)粘红酵母Rhodotorula glutinis AS 2.703(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)在YEPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，34℃，200rpm振荡培养28h，得种子液(每毫升含6×107个活细胞)；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在34℃下通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖和葡萄糖浓度分别为0.1g/L，1.1g/L和0.5g/L；固液分离得干菌体15.7g/L，油脂量6.6g/L。
实施例10
1)将纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖配制成混合糖溶液，纤维二糖27.5g/L，木糖5g/L，阿拉伯糖1.4g/L，半乳糖0.7g/L，甘露糖0.4g/L，添加0.1g/L甘氨酸，0.7g/L磷酸二氢钾，0.3g/L磷酸氢二钾，0.3g/L七水硫酸镁，3.0mg/L氯化钙，2.0mg/L硫酸亚铁，10μg/L维生素B1，余量为水，pH 6.5，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)原壳小球藻Chlorella protothecoides CS-41(菌株来源于澳大利亚CSIRO微藻研究中心)在液体培养基(甘氨酸5g/L，磷酸二氢钾0.7g/L，磷酸氢二钾0.3g/L，七水硫酸镁0.3g/L，七水硫酸亚铁3mg/L，维生素B1 10μg/L)中，28℃光照自养培养，制成种子液；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量2％(v/v)，在28℃下通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖浓度分别为3.4g/L，0g/L，1.1g/L，0.1g/L和0g/L；固液分离收集菌体，得干菌体8.8g/L，油脂量3.6g/L。
实施例11
1)将纤维二糖、木糖和甘露糖配制成混合糖溶液，纤维二糖20g/L，木糖15g/L，甘露糖5g/L，添加1.0g/L酵母粉，0.5g/L蛋白胨，0.2g/L玉米浆，18g/L氯化钠，1.0g/L硝酸钠，0.5g/L氨基乙酸，1.2g/L硫酸镁，0.7g/L磷酸二氢钾，0.3g/L氯化钙，1.0μg/L维生素B12，余量为水，pH 7.8，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)裂殖壶菌Schizochytrium limacinum SR21(购自美国典型培养物保藏中心)在液体种子培养基(葡萄糖30g/L，酵母粉10g/L)中，25℃，170rpm振荡培养36h；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在26℃下通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖和甘露糖的浓度分别为2.4g/L，2.1g/L和0.1g/L；固液分离收集菌体，得干菌体13.8g/L，油脂量5.1g/L。
实施例12
1)将纤维二糖、木糖和甘油配制成混合糖溶液，纤维二糖40g/L，木糖20g/L，甘油5g/L，添加2g/L酵母粉，3g/L硝酸钾，1g/L磷酸二氢钾，0.6g/L七水硫酸镁，5.8g/L氯化钠，0.1g/L二水氯化钙，6.7mg/L七水硫酸锌，14mg/L六水氯化铁，0.4mg/L五水硫酸铜，余量为水，pH 6.0所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)寇氏隐甲藻Crypthecodinium cohnii ATCC 30556(购自美国典型培养物保藏中心)在液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉1g/L，蛋白胨1g/L，磷酸二氢钾2g/L，七水硫酸镁0.5g/L，氯化钠2g/L，二水氯化钙0.2g/L，)中，25℃，200rpm振荡培养72h，得种子液(每毫升含2×105个活细胞)；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量15％(v/v)，在28℃下通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖和甘油的浓度分别为1.3g/L，0.8g/L和1.5g/L；固液分离收集菌体，得干菌体14.7g/L，油脂量5.3g/L。
实施例13
1)将纤维二糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖配制成混合糖溶液，纤维二糖38g/L，木糖20g/L，葡萄糖8g/L，阿拉伯糖2.7g/L，半乳糖0.8g/L，甘露糖0.5g/L，添加0.5g/L酵母粉，1.0g/L硫酸铵，1.0g/L七水硫酸镁，1.0g/L磷酸氢二钾，余量为水，pH 6.5，所得培养基121℃灭菌15min后备用；
2)弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自美国典型培养物保藏中心)在YEPD液体培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L)中，28℃，200rpm振荡培养24h；
3)向步骤(1)所述培养基中接入步骤(2)制备的产油微生物种子液，接种量10％(v/v)，在28℃下通气培养112h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖、葡萄糖、阿拉伯糖、半乳糖和甘露糖的浓度分别为1.5g/L、0.1g/L、0.1g/L、1.4g/L、0.1g/L和0g/L；固液分离收集菌体，得干菌体22.1g/L，油脂量11.6g/L。
对比例2
1)参照文献(Tucker MP，et al.Appl Biochem Biotechnol，2003，105：165178)，以玉米秸秆为原料，洗净，干燥，粉碎过60目筛，用0.98％的硫酸浸渍4h，然后自然风干成50％(w/w)的秸秆，硫酸浓度达到1.0％，190C处理90s后，稀释至料液比为5％(w/w)，调pH 4.8；
2)加入25FPU/g干秸秆的纤维素酶制剂(杰能科公司)、60CBU/g干秸秆的β-葡萄糖苷酶(诺维信公司)和0.01g/g干秸秆的木聚糖酶(杰能科公司)，50℃，200r/min水浴摇床中反应48h后过滤，滤液浓缩，水解液总还原糖浓度为60g/L，其中葡萄糖37g/L，木糖19g/L，纤维二糖1.7g/L其他糖2.3g/L。在此糖液中加入2.0g/L酵母粉，0.4g/L硫酸铵，1.0g/L七水硫酸镁，2.7g/L磷酸二氢钾，0.9g/L磷酸氢二钠，调pH 6.0，121℃灭菌15min后备用；
3)以15％(v/v)接种量接入斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi AS2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液(每毫升含2×108个活细胞)，于30℃通气培养144h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余葡萄糖、木糖和纤维二糖浓度分别为0.1g/L、2.4g/L和0g/L，最终得干菌体18.7g/L，油脂量7.4g/L。
实施例14
1)按照对比例2步骤1)的方法处理玉米秸秆；
2)参照文献(Homma T et al.Biotechnol Bioeng，1993，41：405410)的方法，将纤维素酶制剂(杰能科公司)通过亲和层析滤除部分β-葡萄糖苷酶后，参照文献(夏黎明，岑沛霖.浙江大学学报，1999，33(4)：381385)的方法制备玉米秸秆水解液，将水解液浓缩至总还原糖浓度为60g/L，其中纤维二糖30g/L，木糖19g/L，葡萄糖8.5g/L，其他糖2.5g/L。在此糖液中加入2.0g/L酵母粉，0.4g/L硫酸铵，1.0g/L七水硫酸镁，2.7g/L磷酸二氢钾，0.9g/L磷酸氢二钠，调pH 6.0，121℃灭菌15min后备用；
3)以15％(v/v)接种量接入斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi AS2.1560(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养96h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖和葡萄糖浓度分别为1.1g/L、0.1g/L和0g/L，最终得干菌体21.5g/L，油脂量8.7g/L。
通过比较对比例2和实施例14的实验结果，发现，在总糖浓度及发酵条件相当情况下，实施例14到达发酵终点所需时间为96h，是对比例2发酵时间的66％，发酵时间明显缩短；并且发酵终点时实施例14总残糖浓度更低。同时，实施例14获得了更高的菌体和油脂量。因此，采用实施例14的方案，以玉米秸秆为基础原料，培养产油微生物的生产效率和原料利用效率提高，成本降低。
实施例15
1)参照文献(Zhang J，et al.Bioresour Technol，2011，102：44804488)，以稻草为原料，洗净，干燥，粉碎过60目筛，并用2.5％的硫酸浸渍18h，190C蒸汽处理3min后，稀释至料液比为10％(w/w)，调pH 4.8；
2)参照文献(Homma T et al.Biotechnol Bioeng，1993，41：405410)的方法，除去纤维素酶制剂(杰能科公司)的β-葡萄糖苷酶活性，参照文献(Kim M，Day D F.Appl Biochem Biotechnol，2010，162：13791390)的方法制备稻草水解液，将水解液浓缩至总还原糖浓度为45g/L，其中纤维二糖20g/L，木糖15g/L，葡萄糖6g/L，其他糖3g/L。在此糖液中加入纤维二糖25g/L，酵母粉0.5g/L，硫酸铵1.0g/L，磷酸二氢钾2.7g/L，磷酸氢二钠0.9g/L，肌醇六磷酸钠1.0g/L，调pH 5.5，121℃灭菌15min后备用；
3)以10％(v/v)接种量接入弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus ATCC20509(购自美国典型培养物保藏中心)种子液(每毫升含4×107个活细胞)，于25℃通气培养144h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖和葡萄糖浓度分别为2.7g/L、0.1g/L和0g/L，最终得干菌体22.1g/L，油脂量8.8g/L。
实施例16
1)参照文献(Krishnan C，et al.Biotechnol Bioeng，2010，107：441450)，以云杉为原料，洗净，干燥，粉碎过60目筛，2∶1(w/w)的氨水和云杉，120℃氨膨胀处理30min，调整料液比为10％(w/w)，调pH 4.8；
2)参照文献(Zhou J et al.Bioresour Technol，2009，100：819825)的方法，对纤维素酶(杰能科公司)进行分离纯化，将得到的内切β-1，4-葡聚糖酶和纤维二糖水解酶按质量比2∶1混合，按20FPU/g干秸秆加入混合酶组分，按0.01g/g干秸秆加入木聚糖酶(杰能科公司)，50℃，200r/min水浴摇床中反应48h后过滤，制备云杉水解液，将水解液浓缩至总还原糖浓度为60g/L，其中纤维二糖35g/L，木糖17g/L，葡萄糖3g/L，其他糖5g/L。在此糖液中加入1.0g/L酵母粉，0.5g/L七水硫酸镁，1.0g/L磷酸二氢钾，0.4g/L的EDTA，调pH 6.0。121℃灭菌15min后备用；
3)以12％(v/v)接种量接入发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentansCICC 1368(购自中国工业微生物菌种保藏管理中心)种子液，于28℃通气培养120h；
4)终止发酵，此时发酵液中残余纤维二糖、木糖和葡萄糖浓度分别为0.5g/L、2.7g/L和0g/L，最终得干菌体17.7g/L，油脂量6.7g/L。
实施例17
参照文献(Liu B，Zhao Z B.J Chem Technol Biotechnol，2007，82(8)：775 780)的方法，以实施例1获得的干菌体1.0g为材料，制备生物柴油，得生物柴油0.46g，收率为93％，所得生物柴油的辛烷值为59，适合作为柴油的替代品。
实施例18
参照文献(Li YH，et al.Enzyme Microb Technol，2007，41：312317)的方法，从实施例14获得菌体中提取微生物油脂，得到0.30g。参照文献(里伟，等.过程工程学报，2007，7(1)，137140)的方法，取0.25g油脂在酶催化条件下转酯化制备和纯化生物柴油，得到0.22g，生物柴油收率88％，所得生物柴油的辛烷值为58，适合作为柴油的替代品。

Claims (8)

1.一种产油微生物的培养方法，其特征在于，所述产油微生物培养基的碳源中包括碳源总重量20％-90％的纤维二糖和碳源总重量5％-75％的木糖，培养基pH 4.0-8.0。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产油微生物培养基的碳源除含有纤维二糖和木糖外，还含有质量含量为5-20％以内的其他微生物培养常用碳源有机物，其他微生物培养常用碳源为葡萄糖、蔗糖、阿拉伯糖、乳糖、半乳糖、甘露糖、果糖或甘油中的一种或二种以上组合。
3.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述产油微生物培养基除含有碳源外，还含有其他微生物培养常用营养物质，其他微生物培养常用营养物质包括质量为碳源总质量0.1％-25％的氮源、质量为碳源总质量0.01％-25％的磷源、或质量为碳源总质量0.01％-10％的硫源或它们中的二种或三种的组合。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产油微生物培养基的碳源来自木质纤维素原料的水解液，或来自添加有纤维二糖和/或木糖的木质纤维素原料的水解液。
5.按照权利要求4所述的方法，其特征在于：所述木质纤维素原料为含有纤维素、半纤维素和木质素的生物质材料。
6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述木质纤维素原料为玉米秸秆、麦秆、稻草、林业生产下脚料、松木、云杉中的一种或二种以上组合。
7.按照权利要求1所述的方法，其特征在于：所述产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20％的真核微生物，包括下述微生物中的一种或二种以上，油脂酵母中的斯达油脂酵母Lipomyces starkeyi；红酵母中的圆红冬孢酵母Rhodosporidiumtoruloides、粘红酵母Rhodotorula glutinis和掷孢酵母Sporobolomyces roseus；丝孢酵母中的皮状丝孢酵母Trichosporoncutaneum和发酵性丝孢酵母Trichosporon fermentans；隐球酵母中的白色隐球酵母Cryptococcus albidus和弯曲隐球酵母Cryptococcus curvatus；霉菌中的伯顿拟内孢霉Endomycopsisburtonii、健强地霉Geotrichum robustum、深黄被孢霉Mortierellaisabellina和卷枝毛霉Mucor circinelloides；产油微藻中的布朗葡萄藻Botryococcus braunii、寇氏隐甲藻Crypthecodiniumcohnii、原壳小球藻Chlorella protothecoides和裂殖壶菌Schizochytrium limacinum。
8.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述产油微生物经培养后得到的菌体积累含有一种或多种长链脂肪酸及其衍生物的油脂，培养温度20℃-37℃，并且油脂含量占细胞干重的20％以上；所述产油微生物菌体内积累的油脂，可以作为制备生物柴油的原料。
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