CN102061262B - 一种产油微生物培养的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种微生物培养的方法，通过调整碳源和磷源相对用量，或清除培养基中磷源，控制培养基碳源和磷源比率(C/P比)大于80g/g，培养基中碳源浓度大于40g/l，在20℃～40℃下通气培养产油微生物，得到微生物菌体材料的油脂含量可达到细胞干重40％以上。本方法切实有效，简单易行，可降低生产成本，提高效率，改善微生物油脂发酵的技术经济性，尤其适用于利用复杂天然原料进行油脂发酵生产。
Description
技术领域
本发明涉及一种产油微生物培养的方法，更具体地讲，是在碳源浓度大于40g/L的培养基中，控制培养基中碳源和磷源的比率(C/P比)，使产油微生物经通气培养后得到的菌体含有超过细胞干重40％的油脂。本发明技术简单，可减少磷源用量，提高微生物利用天然原料发酵生产油脂的能力，提高菌体油脂含量和生产效率，降低成本，改善微生物油脂发酵的技术经济性。
背景技术
许多微生物，如酵母、霉菌和藻类等在一定条件下，能以碳水化合物、碳氢化合物等为碳源，在体内合成并贮存大量油脂。凡是可以在胞内油脂积累超过细胞干重20％的微生物称为产油微生物(Ratledge C，Wynn JP.Thebiochemistry and molecular biology of lipid accumulation in oleaginousmicroorganisms.Advances in Applied Microbiology，2002，51，1-52)。部分产油微生物能在菌体内积累含量超过细胞干重60％以上的油脂。以产油微生物菌体为原料分离得到的油脂称为微生物油脂。微生物油脂，尤其是酵母产生的油脂，其主要成份是甘油三酯，脂肪酸组成与商品化的动植物油脂相似，仍以C16和C18系脂肪酸为主。相对于动植物油脂，微生物油脂生产周期短，不受季节与气候限制，原料来源广，基本不占用额外耕地资源，易于实现规模生产，被认为很有潜力的新型油脂资源。因此，微生物油脂不仅可能作为食用油或其它功能性油脂的替代品，还可能在可再生液体燃料生物柴油产业发展中发挥重要作用(赵宗保.加快微生物油脂研究为生物柴油产业提供廉价原料.中国生物工程杂志，2005，25(2)，8-11)。
目前微生物油脂发酵主要建立在氮源限制的调控机制上。培养基中可同化氮源耗尽，细胞生长受到限制，代谢活动主要将过量的碳源转化为脂类分子。许多文献研究也表明控制培养基碳源和氮源的比率(C/N比)能显著改善微生物油脂积累，如Papanikolaou S.等报道多限制因素对刺孢小克银汉霉和深黄被孢霉的培养中发现当培养基的C/N比从83.5增加到133.5时，刺孢小克银汉霉的油脂含量从36％增加到47％；深黄被孢霉的油脂含量由50％提高到56％(Papanikolaou S，Sarantou S，Komaitis M，Aggelis G..Repressionof reserve lipid turnover in Cunninghamella echinulata and Mortierellaisabellina cultivated in multiple-limited media.Journal of Applied Microbiology，2004，97，867-875)。Angerbauer C.等研究斯达氏油脂酵母转化城市淤泥为油脂时也发现C/N比为15时，干菌体油脂含量仅为34％；C/N比为60时，干菌体油脂含量为40％；C/N比为150时，干菌体油脂含量为68％；表现为随着C/N比升高，干菌体油脂含量增加，发酵液中油脂量也增加。进一步优化结果表明C/N比为100时，尽管干菌体油脂含量为56％，但油脂量达到7.5g/L(Angerbauer C，Siebenhofer M，Mittelbach M，Guebitz GM.Conversion ofsewage sludge into lipids by Lipomyces starkeyi for biodiesel production.Bioresources Technology，2008，99，3051-3056)。
磷也是微生物生长的必需元素，它参与核酸、磷脂、ATP、辅酶等重要分子的组装。通常微生物培养基中含有丰富的磷源，例如培养酵母菌的YEPD培养基(葡萄糖20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5-6.0)，其碳源和磷源的比率(C/P比)为50g/g，C/N比为3.1g/g。在这样的条件下，产油微生物正常增殖，不在胞内过量积累油脂。通过控制培养基的C/P比，可以抑制产油微生物菌体生长，而有机碳源能转化为油脂贮存在细胞内。Granger等研究不同营养限制下Rhodotorula glutinis油脂积累发现，葡萄糖和(NH4)2SO4浓度分别为浓度为20g/L和4.0g/L、KH2PO4浓度为2.4g/L、Na2HPO4·12H2O为2.3g/L时，即C/N比为9.4g/g、C/P比为10.7g/g的条件下连续发酵，菌体内油脂积累量仅为菌体干重5.4％；其他条件不变，减少培养基中含磷盐浓度使C/P比率提高至208g/g，细胞能将过量的碳源转化为占生物量干重18％的油脂(Granger LM，Perlot P，Goma G，Pareilleux A.Effect ofvarious nutrient limitations on fatty acid production by Rhodotorula glutinis.Applied Microbiology and Biotechnology，1993，38，784-789)。显然，控制培养基C/P比可能调控微生物油脂发酵，提高微生物油脂生产的经济性。
为降低微生物油脂的生产成本，许多天然原料如玉米、甘薯、木薯、菊芋、麦秆、玉米秸秆、稻草等都可作为微生物油脂发酵的底物。然而，由于氮和磷是植物生长的必须元素，它们也贮存在植物的种子、块茎、根和秸秆中。分析表明：玉米颗粒总C/N比和C/P比分别为21g/g和69g/g；甘薯块茎中总C/N比和C/P比分别为28g/g和61g/g；木薯块茎中总C/N比和C/P比分别为33g/g和68g/g；菊芋块茎中总C/N比和C/P比分别为17g/g和78g/g；麦秆总C/N比和C/P比分别为42g/g和66g/g；玉米秸秆总C/N比和C/P比分别为41g/g和70g/g；稻草总C/N比和C/P比分别为39g/g和63g/g(高云.黑甜玉米的营养成分分析及开发利用.食品科学，2000，21(12)，59-61。张立明，王庆美，王荫墀.甘薯的主要营养成分和保健作用.中国食物与营养，2003，07。Lee J.Biological conversion of lignocellulosic biomass to ethanol.Journal of Biotechnology，1997，56，1-24)。显然，这些原料均含有丰富的氮源和磷源，直接用于油脂发酵时效率低。由于氮元素主要整合到蛋白质中，磷元素整合到核酸、磷脂、ATP、辅酶等不稳定活性分子中，天然底物在预处理过程中磷源较易释放出来，而氮源不容易释放。因此，通过适当的化学处理可以从原料中有效移去磷源，提高原料的C/P比，使其有利于微生物油脂发酵(Szogi AA，Vanotti MB.Prospects for phosphorus recovery frompoultry litter.Bioresource Technology，2009，100，5461-5465.赵芯，朱义年，廖雷，等.微生物蛋白硫酸水解提取复合氨基酸的研究.中国资源综合利用，2006，24(10)，10-13.Morgan GB，Lackey JB，Gilcreas FW.Quantitativedetermination of organic nitrogen in water，sewage，and industrial wastes.Anal.Chem.，1957，29，833-835.)。
本发明通过控制培养基组成，使碳源浓度大于40g/L的培养基中培养基C/P比大于80g/g，产油微生物经通气培养后得到的菌体含有超过细胞干重40％的油脂。本发明提供的产油微生物培养的方法，技术简单，可减少磷源用量，提高微生物利用天然原料发酵生产油脂的能力，提高菌体油脂含量和生产效率，降低成本，显著改善微生物油脂发酵的技术经济性。
发明内容
本发明通过调整培养基初始碳源和磷源的用量、清除培养基中富余磷源、在微生物培养过程中增加碳源投料或添加磷清除剂的策略，在碳源浓度大于40g/L的培养基中得到C/P比大于80g/g的培养基。产油微生物在上述培养基中通气培养，得到的菌体含有超过细胞干重40％的油脂。本发明技术简单，可减少磷源用量，菌体油脂含量高，提高利用天然原料发酵生产油脂的能力，降低成本，改善微生物油脂发酵的技术经济性。本发明切实有效，简单易行，为高效培养产油微生物，获取微生物油脂提供了一种新方法。
本发明通过下述技术方案予以实现：
1、通过下述方法的一种或它们的必要组合方法，获得C/P比大于80g/g的培养基(碳源浓度≥40g/L)：
A.控制磷源使用量，获得C/P比率大于80g/g的培养基(碳源浓度≥40g/L)，此方法适用于碳源中不含磷源的情况；或，
B.使用磷源清除剂，降低磷源含量，获得C/P比率大于80g/g的培养基(碳源浓度≥40g/L)，此方法适用于发酵原料同时含有碳源和磷源的情况；
或，
C.在培养过程中增加碳源投料，获得总C/P比率大于80g/g的培养基(碳源浓度≥40g/L)，此方法适用于培养基初始C/P比小于80g/g的情况；或，
D.在培养过程中添加磷源清除剂，除去部分磷源，获得总C/P比率大于80g/g的培养基(碳源浓度≥40g/L)，此方法适用于培养基初始C/P比小于80g/g的情况。
2、产油微生物培养。按照上述方法A或B制备的培养基，调节pH2.5-8.0，直接灭菌或补充微生物生长所需的常规营养成份后灭菌，接种产油微生物种子液，于20℃-40℃通气培养，待发酵液中总还原糖浓度降至10g/L以下时停止培养，收集菌体。
除非另外说明，本发明使用液体培养基(葡萄糖或相应碳源20g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨10g/L，pH5.5-6.0)制备产油微生物种子液。种子液培养条件为：温度25-37℃，通风培养20-48小时，细胞密度达到105-108个细胞/mL。其中酵母粉N和P的质量含量分别为9.0％和1.31％；蛋白胨N和P的质量含量分别为14.5％和0.14％。
本发明参考文献(Li YH，Zhao ZB，Bai FW.High-density cultivation ofoleaginous yeast Rhodosporidium toruloides Y4 in fed-batch culture.EnzymeMicrobial Technology，2007，41，312-317)的方法，在发酵结束后，经离心、洗涤，收集菌体沉淀。菌体在105℃干燥至恒重，即得干菌体。参照文献(李植峰，张玲，沈晓京，等.四种真菌油脂提取方法的比较研究.微生物学通报，2001，28(6)，72-75.)使用酸热-有机溶剂法抽提获得油脂，计算菌体油脂含量。
本发明使用的磷源清除剂包括镁盐、铁盐、铝盐及钙盐，或它们的混合物，按照文献的方法(汤琪.磷酸铵镁技术中不同沉淀剂脱氮除磷效果比较.重庆交通大学学报，2008，27(1)，148-151。黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105。徐建宇，宫宇周，潘明富.几种混凝剂深度除磷性能的对比研究.广西轻工业，2009，(1)，89-91)从溶液中脱除磷源。
本发明所述的碳源为戊糖、己糖、氨基糖及经水解可释放出戊糖、己糖、氨基糖的材料，包括化学组成明确的有机物，如葡萄糖、木糖、蔗糖、N-乙酰葡糖胺等，天然有机质或工农业副产品，如玉米、小麦、水稻、甘薯、木薯、菊芋、土豆、麦秆、玉米秸秆、稻草、蔗渣、糖蜜、乳清、淀粉废水、发酵废水、废甘油以及它们的组合。
本发明所述的磷源为磷酸盐及经水解可释放出磷酸根的物质。
本发明所述的其它微生物生长必需的营养物质包括氮源、硫源、金属离子、维生物素及其它具有显著作用的物质或它们的组合。
本发明使用的产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20％(w/w)的真菌、细菌或微藻。它们包括但不限于，产油真菌，如Rhodosporidium toruloides、Cryptococcus curvatus、Cryptococcus albidus、Yarrowia lipolytica、Rhodotorula glutinis、Rhizopus arrhizus、Lipomycesstarkeyi、Trichosporon cutaneum、Mortierella isabellina、Mucor circinelloides和Cunninghamella；产油细菌，如Croynebacterium、Nocardia、Mycobacterium和Rhodococcus opacus；产油微藻，如Botryococcus braunii、Crypthecodiniumcohnii、Chlorella protothecoides、Nannochloropsis sp.和Schizochytriumlimacinum。
本发明的有益效果是：1)与现有使用高C/N比培养基进行油脂发酵相比，本发明使用高C/P比培养基，减少了磷源用量，降低了油脂发酵辅料成本；2)当使用天然材料作为油脂发酵原料时，采用本发明的策略去除磷源简单易行，效果好，原料处理工艺简化，降低了油脂发酵原料成本；3)采用本发明的方法，低C/N比的原料不经过非常复杂的氮源脱除处理，也可以用于微生物油脂生产，扩展了油脂发酵的原料范围；4)本发明的方法培养产油微生物效率高，所获得的菌体材料油脂含量占细胞干重40％以上，有效提高了油脂发酵的产物得率，降低了生产成本。总之，本发明技术简单有效，投资少，有利于大规模工业化生产。
具体实施方式
下面是提高微生物油脂生产效率的具体实施例。通过实施例可进一步了解控制培养基中C/P比率大于80g/g对微生物油脂生产的影响。
对比例1：
培养基组成(g/L)：葡萄糖70，KH2PO43.6，(NH4)2SO4 5.0，MgSO4·7H2O1.5，EDTA 0.1，蛋白胨2.0，调节pH6.0，C/N比率为21g/g，C/P比率为34g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodosporidiumtoruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养138小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体23.7g/L，油脂量5.5g/L，菌体油脂含量23.2％。
实施例1：
培养基组成(g/L)：葡萄糖70，KH2PO4 0.1，(NH4)2SO4 5.0，MgSO4·7H2O1.5，EDTA 0.1，蛋白胨2.0，调节pH6.0，C/N比率为21g/g，C/P比率为1093g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodosporidiumtoruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养138小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体20.7g/L，油脂量10.0g/L，菌体油脂含量48.2％。与对比例1比较，油脂量和油脂含量增率分别为81％和108％。
实施例2：
培养基组成(g/L)：葡萄糖70，KH2PO4 0.04，(NH4)2SO4 5.0，MgSO4·7H2O 1.5，EDTA 0.1，蛋白胨2.0，调节pH6.0，C/N比率为21g/g，C/P比率为2343g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养138小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体19.0g/L，油脂量10.7g/L，菌体油脂含量56.5％。与对比例1比较，油脂量和油脂含量增率分别为95％和143％。
实施例3：
培养基组成(g/L)：葡萄糖70，KH2PO4 0.005，(NH4)2SO4 5.0，MgSO4·7H2O 1.5，EDTA 0.1，蛋白胨2.0，调节pH6.0，C/N比率为21g/g，C/P比率为9858g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养138小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体16.3g/L，油脂量8.8g/L，菌体油脂含量53.9％。与对比例1比较，油脂量和油脂含量增率分别为59％和132％。
对比例2：
培养基组成(g/L)：木糖70，KH2PO4 3.6，(NH4)2SO4 4.0，MgSO4·7H2O1.5，EDTA 0.1，酵母粉0.75，调节pH6.0，C/N比率为31g/g，C/P比率为34g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Lipomyces starkeyiAS 2.1608(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养144小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体21.2g/L，油脂量5.2g/L，菌体油脂含量24.5％。
实施例4：
培养基组成(g/L)：木糖70，KH2PO4 0.1，(NH4)2SO4 4.0，MgSO4·7H2O1.5，EDTA 0.1，酵母粉0.75，调节pH6.0，C/N比率为31g/g，C/P比率为849g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Lipomyces starkeyiAS 2.1608(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养144小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体20.2g/L，油脂量9.7g/L，菌体油脂含量48.0％。与对比例2比较，油脂量和油脂含量增率分别为86％和96％。
实施例5：
培养基组成(g/L)：木糖70，KH2PO4 0.04，(NH4)2SO4 4.0，MgSO4·7H2O1.5，EDTA 0.1，酵母粉0.75，调节pH6.0，C/N比率为31g/g，C/P比率为1450g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Lipomycesstarkeyi AS 2.1608(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养144小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体19.3g/L，油脂量10.5g/L，菌体油脂含量54.4％。与对比例2比较，油脂量和油脂含量增率分别为102％和122％。
对比例3：
培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 2.7，Na2HPO4 0.95，MgSO4·7H2O 0.2，酵母粉1.0，调节pH5.5，C/N比率为6.7g/g，C/P比率为36g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Cryptococcuscurvatus ATCC 20509(购自the American Type Culture Collection)种子液，于30℃通气培养120小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体21.7g/L，油脂量7.7g/L，菌体油脂含量35.4％。
实施例6：
培养基组成(g/L)：N-乙酰葡糖胺70，KH2PO4 0.1，MgSO4·7H2O 0.2，酵母粉1.0，调节pH5.5，C/N比率为6.7g/g，C/P比率为836g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自the American Type Culture Collection)种子液，于30℃通气培养120小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体得到干菌体20.1g/L，油脂量11.4g/L，菌体油脂含量56.9％。与对比例4比较，油脂量和油脂含量增率分别为48％和46％。
对比例4：
以新鲜菊芋块茎为原料，参照文献方法(华艳艳，赵鑫，赵金，张素芳，赵宗保.圆红冬孢酵母发酵菊芋块茎产油脂的研究.中国生物工程杂志，2007，27(10)，59-63)处理，得到菊芋水解液，调整总还原糖浓度为70g/L，pH5.5，C/N比率为17.4g/g，总磷浓度为0.356g/L，C/P比率为78.6g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Cryptococcus curvatus ATCC20509(购自the American Type Culture Collection)种子液，于30℃通气培养110小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体20.4g/L，油脂量8.0g/L，菌体油脂含量39.2％。
实施例7：
同对比例4的方法制备菊芋水解液，参照文献方法(黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105)调菊芋水解液总还原糖浓度为70g/L，pH5.5，加入FeCl3 2.4g/L，搅拌1h，过夜沉降，过滤，C/N比率为17.4g/g，总磷浓度为0.083g/L，C/P比率为337g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自the American Type CultureCollection)种子液，于30℃通气培养110小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得干菌体19.8g/L，油脂量10.2g/L，菌体油脂含量51.5％。与对比例4比较，油脂量和油脂含量增率分别为27％和31％。
实施例8：
同对比例4的方法制备菊芋水解液，参照文献方法(黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105.)调菊芋水解液总还原糖浓度为70g/L，pH5.5，加入FeCl3 3.2g/L，搅拌1h，过夜沉降，过滤，C/N比率为17.4g/g，总磷浓度为0.027g/L，C/P比率为1037g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Cryptococcus curvatus ATCC 20509(购自the American Type CultureCollection)种子液，于30℃通气培养110小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得干菌体18.9g/L，油脂量12.5g/L，菌体油脂含量66.1％。与对比例4比较，油脂量和油脂含量增率分别为56％和68％。
对比例5：
参照文献方法(蒋常德，木薯燃料酒精浓醪发酵工艺研究，南宁：广西大学)，以市售木薯粉为原料，粉碎过40目筛，经液化(液化工艺：料水比为1∶2.3，液化酶加入量为10μ/g，配料水温为60℃，预热温度和时间分别为60℃、30min，液化温度和时间分别为105℃、2h。)、糖化(糖化工艺：即在液化醪降温到60℃时，调pH4.5，加糖化酶60℃保温糖化至多糖完全水解。糖化液调整总还原糖浓度为70g/L，pH5.5，添加MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉1.0g/L，总磷浓度为0.426g/L，C/N比率为28g/g，C/P比率为65g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Mortierella isabellina AS 3.3410(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于25℃通气培养150小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体22.7g/L，油脂量7.9g/L，菌体油脂含量34.8％。
实施例9：
同对比例5的方法制备木薯水解液，调整总还原糖浓度为70g/L，参照文献方法(黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105)，调整水解液pH6.0，加入Al2(SO4)3 1.8g/L，搅拌1h，过夜沉降。调整pH5.5，添加MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉1.0g/L，总磷浓度为0.273g/L，C/N比率为28g/g，C/P比率为102g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Mortierellaisabellina AS 3.3410(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于25℃通气培养150小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体得到干菌体22.2g/L，油脂量9.1g/L，菌体油脂含量41.0％。与对比例5比较，油脂量和油脂含量增率分别为15％和18％。
实施例10：
同对比例5方法制备木薯水解液，调整总还原糖浓度为70g/L，pH5.5，添加MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉1.0g/L，121℃水解15min。以10％(v/v)接种量接入Mortierella isabellina AS 3.3410(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养24h。参照文献方法(黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105.)，向发酵液中添加Al2(SO4)3至终浓度达到4.0g/L，继续培养至120小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体得到干菌体20.5g/L，油脂量10.7g/L，菌体油脂含量52.2％。与对比例5比较，油脂量和油脂含量增率分别为35％和50％。经实验验证，按对比例5方法制备的总还原糖浓度为70g/L的木薯水解液，经4.0g/L的Al2(SO4)3处理，C/P可达到410g/g。这说明为在发酵过程中使用磷源清除剂，提高发酵体系中的C/P比率，可以达到增加菌体油脂含量的有益效果。
对比例6：
参照文献方法(杜娟，王宏勋，金红林，颜克亮，张晓昱.甘薯淀粉废水发酵生产微生物油脂的研究.生物加工过程，2007，5，33-36)，以新鲜甘薯为原料，切碎，料水比为1∶2.3匀浆，4层纱布过滤，滤液经液化(液化酶加入量为10μ/g，配料水温为60℃，预热温度和时间分别为60℃、30min，液化温度和时间分别为105℃、2h)、糖化(在液化醪降温到60℃时，调pH4.5，加糖化酶60℃保温糖化至多糖完全水解)。调整总还原糖浓度为70g/L，pH5.5，添加MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉1.0g/L，总磷浓度为0.467g/L，C/N比率为24g/g，C/P比率为60g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入白色隐球酵母ATCC 56298(购自the American Type CultureCollection)种子液，于20℃通气培养192小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体23.5g/L，油脂量7.1g/L，菌体油脂含量30.2％。
实施例11：
同对比例6的方法制备甘薯水解液，调整总还原糖浓度为70g/L，pH10.0，参照文献方法(黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105)，加入CaCl2 1.5g/L，搅拌1h，过夜沉降。调整pH5.5，添加MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉1.0g/L，总磷浓度为0.269g/L，C/N比率为24g/g，C/P比率为104g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自the American Type Culture Collection)种子液，于20℃通气培养192小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体得到干菌体22.1g/L，油脂量8.9g/L，菌体油脂含量40.3％。与对比例6比较，油脂量和油脂含量增率分别为25％和33％。
实施例12：
同对比例6的方法制备甘薯水解液，调整总还原糖浓度为70g/L，pH10.0，参照文献方法(黄自力，肖晶晶，李密.化学沉淀-磁絮凝深度快速除磷的研究.武汉科技大学学报，2009，32(1)，102-105.)，加入CaCl2 3.5g/L，搅拌1h，过夜沉降。调整pH5.5，添加MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉1.0g/L，总磷浓度为0.036g/L，C/N比率为24g/g，C/P比率为783g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自the American Type Culture Collection)种子液，于20℃通气培养192小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体得到干菌体19.9g/L，油脂量12.0g/L，菌体油脂含量60.3％。与对比例6比较，油脂量和油脂含量增率分别为69％和99％。
对比例7：
参照文献方法(吴素萍.甘薯淀粉废水发酵生产微生物油脂的研究.生物加工过程，2007，5，33-36)，以新鲜玉米粉(淀粉含量为65.9％)为原料，过60目筛，料水比为1∶2.3匀浆，4层纱布过滤，滤液经液化(液化酶加入量为10μ/g，配料水温为60℃，预热温度和时间分别为60℃、30min，液化温度和时间分别为105℃、2h)、糖化(在液化醪降温到60℃时，调pH4.5，加糖化酶60℃保温糖化至多糖完全水解)。调整总还原糖浓度为70g/L，pH5.5，添加MgSO4·7H2O 1.5g/L，酵母粉1.0g/L，总磷浓度为0.417g/L，C/N比率为18g/g，C/P比率为67g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodotorula glutinis AS 2.499(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养120小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体23.1g/L，油脂量8.2g/L，菌体油脂含量35.5％。
实施例13：
同对比例7的方法制备玉米粉水解液，调整总还原糖浓度为70g/L，pH9.0，参照文献方法(汤琪.磷酸铵镁技术中不同沉淀剂脱氮除磷效果比较.重庆交通大学学报，2008，27(1)，148-151)，加入MgCl2·6H2O 4.0g/L、NH4Cl0.8g/L，搅拌1h，过夜沉降。调整pH5.5，添加MgSO4·7H2O 1.0g/L，酵母粉1.0g/L，总磷浓度为0.023g/L，C/N比率为18g/g，C/P比率为1242g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodotorulaglutinis AS2.499(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养120小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，得干菌体19.6g/L，油脂量12.9g/L，菌体油脂含量65.8％。与对比例7比较，油脂量和油脂含量增率分别为57％和85％。
对比例8：
培养基组成(g/L)：蔗糖30，KH2PO4 3.6，(NH4)2SO4 4.0，MgSO4·7H2O0.5，NaCl 5.0，酵母粉0.75，CaCl2 3x10-3，FeSO4 2x10-3，调节pH7.8，C/N比率为14g/g，C/P比率为15g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodococcus opacus PD630(购自德国生物材料资源中心)种子液。于37℃通气培养，48h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到50g/L；培养96h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到70g/L。培养144小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体19.2g/L，油脂量4.8g/L，菌体油脂含量25.0％。
实施例14：
培养基组成(g/L)：蔗糖30，KH2PO4 1.0，(NH4)2SO4 4.0，MgSO4·7H2O0.5，NaCl 5.0，酵母粉0.75，CaCl2 3x10-3，FeSO4 2x10-3，调节pH7.8，C/N比率为14g/g，C/P比率为53g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodococcus opacus PD630(购自德国生物材料资源中心)种子液。于37℃通气培养，48h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到50g/L；培养96h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到70g/L。培养144小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体18.3g/L，油脂量8.7g/L，菌体油脂含量47.5％。与对比例8比较，油脂量和油脂含量增率分别为81％和90％。这说明在初始C/P比率较低的条件下，通过在培养过程中补加碳源，提高发酵体系的总C/P比率，也可以达到增加菌体油脂含量的有益效果。
对比例9：
培养基组成(g/L)：葡萄糖70，KH2PO4 3.6，K2SO4 1.5，氨基乙酸4.0，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl2 3x10-3，FeSO4 2x10-3，Vitamin B1 0.01x10-3，酵母粉2.0，调节pH6.5，C/N比率为30g/g，C/P比率为33g/g。115℃灭菌30min后，以10％(v/v)接种量接入Chlorella protothecoides(购自美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻种保藏中心)种子液，于28℃通气培养120小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体22.4g/L，油脂量5.2g/L，菌体油脂含量23.2％。
实施例15：
培养基组成(g/L)：葡萄糖70，KH2PO4 0.05，K2SO4 1.5，氨基乙酸4.0，MgSO4·7H2O 0.3，CaCl2 3x10-3，FeSO4 2x10-3，Vitamin B1 0.01x10-3，酵母粉2.0，调节pH6.5，C/N比率为30g/g，C/P比率为725g/g。115℃灭菌30min后，以10％(v/v)接种量接入Chlorella protothecoides(购自美国德克萨斯大学奥斯汀分校藻种保藏中心)种子液，于28℃通气培养120小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体19.6g/L，油脂量9.1g/L，菌体油脂含量46.4％。与对比例9比较，油脂量和油脂含量增率分别为75％和100％。
实施例16：
参照文献方法(Kootstra AMJ，Beeftink HH，Scott EL，Sanders JPM.Comparison of dilute mineral and organic acid pretreatment for enzymatichydrolysis of wheat straw.Biochemical Engineering Journal，2009，46，126-131)，以新鲜玉米秸秆为原料，干燥，粉碎过60目筛，和50mM马来酸溶液混合，料液比为10％(w/w)，浸泡24h，170℃消化30min，稀释至料液比为5％(w/w)，调pH4.8，纤维素酶加入量为50FPU/g固体，60℃、150rpm反应72h，过滤，调整总还原糖浓度为25g/L，C/N比为33g/g，C/P比为67g/g。在此糖液中加入葡萄糖50g/L，(NH4)2SO4 3.0g/L，MgSO4·7H2O1.0g/L，酵母粉1.0g/L，调pH3.5。此时培养基中C/N比率为29.1g/g，C/P比率为202.5g/g。115℃灭菌30min后，以10％(v/v)接种量接入Trichosporon cutaneum AS 2.571(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于35℃通气培养144小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体18.0g/L，油脂量7.8g/L，菌体油脂含量43.3％。
实施例17：
培养基组成(g/L)：市售蔗糖蜜(含总糖50％，总氮0.4％，总磷0.145％)100，葡萄糖20，(NH4)2SO4 4.0，MgSO4·7H2O 1.5，酵母粉1.0，调节pH2.5，过滤，C/N比率为25g/g，C/P比率为491g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Cryptococcus albidus ATCC 56298(购自the AmericanType Culture Collection)种子液，于24℃通气培养144小时，停止发酵，将发酵液于6000转/分钟离心10分钟，收集菌体，得到干菌体19.0g/L，油脂量12.7g/L，菌体油脂含量66.8％。
实施例18：
培养基组成(g/L)：葡萄糖150，(NH4)3PO4 0.08，(NH4)2SO4 10.0，MgSO4·7H2O 1.5，EDTA 0.1，酵母粉2.0，调节pH6.0，C/N比率为26g/g，C/P比率为2033g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodosporidium toruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液，于30℃通气培养168小时，停止发酵，将发酵液于10000转/分钟离心15分钟，收集菌体，得到干菌体61.3g/L，油脂量31.9g/L，菌体油脂含量52.1％。
实施例19：
培养基组成(g/L)：蔗糖45，KH2PO4 0.5，(NH4)2SO4 10.0，MgSO4·7H2O1.5，酵母粉10.0，蛋白胨10.0，调节pH7.0，C/N比率为4.5g/g，C/P比率为73g/g。121℃灭菌15min后，以10％(v/v)接种量接入Rhodosporidiumtoruloides AS 2.1389(购自中国普通微生物菌种保藏管理中心)种子液。于30℃通气培养，24h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到60g/L；培养48h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到90g/L；72h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到120g/L；96h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到150g/L；120h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到180g/L；144h后向发酵液中补加蔗糖，至发酵液中蔗糖累积用量达到210g/L；培养180小时，停止发酵，将发酵液于10000转/分钟离心30分钟，收集菌体，得到干菌体85.2g/L，油脂量42.1g/L，菌体油脂含量49.4％。这说明在初始C/P比率较低的条件下，通过在培养过程中补加碳源，提高发酵体系的总C/P比率，也可以得到高菌体油脂含量。
Claims (5)
1.一种产油微生物培养的方法，其特征是培养基中碳源浓度大于40g/l，并且碳源和磷源的比率、C/P比大于80g/g；
所述的碳源包括戊糖、己糖、或经水解可释放出戊糖和/或己糖的材料中的一种或多种，所述戊糖为木糖，所述己糖为葡萄糖或蔗糖；
所述培养基C/P比大于80g/g的条件通过调整培养基初始碳源或磷源物质的用量，或去除培养基中磷源的方法来实现；
或，在微生物培养过程中，培养基C/P比大于80g/g的条件可以通过增加碳源投料或去除磷源的方法实现。
2.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：微生物采用液体培养基通空气培养，培养温度为20℃～40℃，pH值2.5～8.0。
3.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述的磷源为磷酸盐和经水解可释放出磷酸根的物质中的一种或多种。
4.按照权利要求1所述的方法，其特征还在于：所述的培养基除含有碳源和磷源外，还含有微生物生长必需的其它营养物质，所述其它营养物质为氮源、硫源、金属离子、维生物素及其它具有显著作用的物质中的一种或多种。
5.按照权利要求1-4任一权利要求所述的方法，其特征还在于：所述的产油微生物为经发酵培养后菌体油脂含量可超过细胞干重20％的真菌、细菌或微藻。
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