CN108949591A - 一种调节单细胞蛋白或油脂比例的发酵方法 - Google Patents
一种调节单细胞蛋白或油脂比例的发酵方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种调节单细胞蛋白或油脂比例的发酵方法。具体而言，本发明调节单细胞蛋白或油脂比例的发酵方法包括在发酵过程中控制发酵液中的C/N重量比为≤15或在80‑160的范围内的步骤。采用本发明方法，可使得发酵所得的微生物中单细胞蛋白的重量百分比提高到80wt％以上，或将发酵所得微生物中单细胞油脂的重量本发明提高到40‑60wt％。
Description
技术领域
本发明涉及一种调节单细胞蛋白或油脂比例的发酵方法。
背景技术
单细胞蛋白，也叫微生物蛋白，它是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。单细胞蛋白是一类凝缩的蛋白类产品，含粗蛋白50％-85％，其中氨基酸组分齐全，可利用率高，还含维生素、无机盐、脂肪和糖类等，其营养价值优于鱼粉和大豆粉。20世纪80年代中期，全世界的单细胞蛋白年产量已达2.0×106吨，广泛用于食品加工和饲料中。单细胞蛋白不仅能制成“人造肉”，供人们直接食用，还常作为食品添加剂，用以补充蛋白质或维生素、矿物质等。由于某些单细胞蛋白具有抗氧化能力，使食物不容易变质，因而常用于婴儿粉及汤料、作料中。干酵母的含热量低，常作为减肥食品的添加剂。此外，单细胞蛋白还能提高食品的某些物理性能，如意大利烘饼中加入活性酵母，可以提高饼的延薄性能。酵母的浓缩蛋白具有显著的鲜味，已广泛用作食品的增鲜剂。单细胞蛋白作为饲料蛋白，也在世界范围内得到了广泛应用。
单细胞油脂，也叫微生物油脂，是微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源，辅以氮源、无机盐生产的油脂和另一些有商业价值的脂质。单细胞油脂除可代替动植物油脂生产食用油脂，特别是保健类功能性油脂外，还可以作为生产生物柴油的油源。生物柴油由各种动、植物油脂经酯化或转酯化工艺而得，而大部分微生物油的脂肪酸组成和一般植物油相近，以C16和C18系脂肪酸，如油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸为主,因此单细胞油脂可替代植物油脂生产生物柴油。
尽管单细胞蛋白或油脂具有上述优点，但是在单细胞蛋白或油脂的生产成本中，原料成本仍占总生产成本的60％以上，其中，碳源的成本最高。因此，寻找单细胞蛋白或油脂的低成本原料，成为该领域发展的亟待解决的问题。
亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)是一类能产生单细胞蛋白和油脂的微生物，特别是能利用来源广泛的生产原料，比如有机酸或有机酸盐，具有很大的工业应用潜力。
发明内容
本发明的目的是提供一种调节单细胞蛋白或油脂比例的发酵方法。
本发明第一方面提供一种调节单细胞蛋白或油脂比例的发酵方法，所述方法包括在发酵过程中，控制发酵液中的C/N重量比为≤15或在80-160的范围内的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述发酵在好氧条件下进行。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括，在发酵过程中，控制发酵液中的C/N比≤15，例如，1-15，从而将发酵产物中单细胞蛋白含量控制在80％以上。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括，在发酵过程中，控制发酵液中的C/N比≤12的范围内，例如2-12。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括，在发酵过程中，控制发酵液中的C/N比在80-160的范围内，从而将发酵产物中油脂的含量控制在40％以上。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括，在发酵过程中，控制发酵液中的C/N比在90-160的范围内，例如90-120或90-110。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括在好氧条件下，连续流加有机酸、有机酸盐和氮源，从而控制发酵中的C/N比。
在一个或多个实施方案中，所述有机酸选自：甲酸，乙酸，丙酸，乳酸，丁酸，或它们的两种或多种的组合。
在一个或多个实施方案中，所述有机酸盐选自：甲酸盐，乙酸盐，丙酸盐，乳酸盐，丁酸盐，或它们的两种或多种的组合。
在一个或多个实施方案中，所述有机酸盐为有机酸的钠盐、钾盐或铵盐。
在一个或多个实施方案中，所述的氮源选自：氨水，铵盐，或其混合物。
在一个或多个实施方案中，发酵过程中，将发酵液的pH控制在6.0-8.0的范围内，优选6.5～7.5，更优选6.8～7.0。
在一个或多个实施方案中，在发酵过程中，连续流加无菌的含有机酸的溶液，流加的速度是实现控制发酵液的pH值在6.0-8.0范围内的速度。
在一个或多个实施方案中，每隔一段时间测定一次发酵液中的pH，设定含有机酸的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10×(最近一次测得的pH-6.9)。
在一个或多个实施方案中，利用在线pH电极测定所述pH。
在一个或多个实施方案中，测定pH的时间间隔不超过10分钟，例如每隔30s、1min或2min测试一次。
在一个或多个实施方案中，所述无菌的含有机酸的溶液是发酵液，优选是来自以合成气为原料的发酵液。
在一个或多个实施方案中，所述无菌的含有机酸的溶液中，有机酸的含量为1-70wt％，例如，1-50wt％。
在一个或多个实施方案中，在发酵过程中，连续流加无菌的含有机酸盐的溶液，流加的速度是实现控制发酵液中有机酸和有机酸盐的含量为0-0.1wt％时的速度。
在一个或多个实施方案中，每隔一段时间测定一次发酵液中的有机酸盐的含量，设定含有机酸盐的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000×(0.05％-最近一次测得的有机酸盐含量)。
在一个或多个实施方案中，利用离线HPLC测定发酵液中有机酸盐的含量。
在一个或多个实施方案中，测定发酵液中有机酸盐含量的时间间隔不超过2小时，例如每隔30min或1h或2h测试一次。
在一个或多个实施方案中，所述无菌的含有机酸盐的溶液是发酵液，优选是来自以合成气为原料的发酵液。
在一个或多个实施方案中，所述无菌的含有机酸盐的溶液中，有机酸盐的含量为1-20wt％，例如1-12wt％或2-10wt％。
在一个或多个实施方案中，连续流加含有氮源的溶液，以将发酵液中的C/N重量比控制在≤15或80-160的范围内。
在一个或多个实施方案中，每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定含氮源的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+10000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)。
在一个或多个实施方案中，每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定含氮源的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+25000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)，以将C/N重量比控制在4-12的范围内。
在一个或多个实施方案中，每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+500000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+750000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)，以将C/N重量比控制在90-160的范围内。
在一个或多个实施方案中，进行测定的时间间隔不超过2小时，例如每隔30min或1h或2h测试一次。
在一个或多个实施方案中，利用离线铵离子电极测定发酵液中铵离子的含量。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括在无菌的含有机酸和/或有机酸盐的溶液中接入微生物种子液进行发酵的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述无菌的含有机酸和/或有机酸盐的溶液是发酵液或培养基。
在一个或多个实施方案中，所述的含有有机酸和/或有机酸盐的发酵液来自以合成气为原料的发酵液。
在一个或多个实施方案中，所述无菌的含有机酸和/或有机酸盐的溶液中，有机酸和/或有机酸盐的总浓度为1-4wt％。
在一个或多个实施方案中，所述方法还包括从发酵液中分离出微生物细胞，提取细胞内的油脂和单细胞蛋白的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述的微生物是亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)。
在一个或多个实施方案中，所述方法包括：所述方法包括在好氧条件下，连续流加有机酸、有机酸盐和氮源，从而将发酵液的pH控制在6.0-8.0的范围内，并控制发酵液的C/N重量比；其中，
(1)每隔一段时间测定一次发酵液中的pH，设定含有有机酸的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10×(最近一次测得的pH-6.9)；
(2)每隔一段时间测定一次发酵液中的有机酸盐的含量，设定含有有机酸盐的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000×(0.05％-最近一次测得的有机酸盐含量)；和
(3)每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定含氮源的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+10000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)，从而将发酵液中的C/N比控制在15以内的范围内；或每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定含氮源的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+500000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+750000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)，从而将发酵液的C/N比控制在90-160的范围内。
本发明第二方面还提供一种提高发酵微生物中单细胞蛋白相对于单细胞油脂的含量的方法，所述方法包括发酵所述微生物的步骤，其中，在发酵过程中，将发酵液的C/N重量比控制在15以内。
本发明第三方面还提供一种提高发酵微生物中单细胞油脂相对于单细胞蛋白的含量的方法，所述方法包括发酵所述微生物的步骤，其中，在发酵过程中，将发酵液的C/N重量比控制在80-160的范围内。
本发明的其他方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1：本发明发酵方法的示意图。图中的溶液A为发酵液；溶液B为含有机酸的溶液；溶液C为含有机酸盐的溶液；溶液D为含氮源的溶液。
具体实施方式
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
本发明人发现，培养基中的C/N重量比对该微生物合成蛋白或油脂有至关重要的作用。因此，可以在培养过程中调节C/N重量比例，从而灵活调节发酵产物中单细胞蛋白或油脂的比例。具体而言，本文发现，在发酵过程中，将发酵液的C/N重量比控制为≤15，例如1-15，或≤12，例如2-12、4-12、6-10、6-12、4-10等，可将发酵获得的微生物中的单细胞蛋白含量控制在80wt％以上。相反，若在发酵过程中将发酵液的C/N重量比控制在80-160的范围内，例如90-160、90-120、90-110、90-140、120-160、120-140等，则可将发酵所得微生物中的单细胞油脂的含量控制在40wt％以上，例如40-60wt％。
本文中，“单细胞蛋白”也称为微生物蛋白，是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团，含粗蛋白50％-85％。“单细胞油脂”也称为微生物油脂，是微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源，辅以氮源、无机盐生产的油脂和另一些有商业价值的脂质。
本文通过在发酵过程中连续流加有机酸盐和氮源，并根据当前的流加速度调整之后的流加速度，从而控制发酵液中的C/N重量比。
具体而言，在发酵过程中流加有机酸盐时，同时可每隔一段时间测定一次发酵液中的有机酸盐的含量，并基于该含量计算流加速度。有机酸盐的流加速度是实现控制发酵液中有机酸和有机酸盐的含量为0-0.1wt％时的速度。可采用常规的方法测试发酵液中有机酸盐的含量，例如，可利用离线HPLC进行测定。
在某些实施方案中，设定有机酸盐流加的初始速度为0，则有机酸盐流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000×(0.05％-最近一次测得的有机酸盐含量)。通常，测定有机酸盐含量的时间间隔不超过2小时，例如每隔30min、每隔1h或每隔2h测试一次。
流加氮源时，可每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定氮源流加的初始速度为0，则氮源流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+10000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)。通过此流速控制，可将发酵液的C/N比控制在15以内。或者，设定氮源流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+25000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)，以将C/N重量比控制在4-12的范围内。
在其它实施方案中，设定氮源流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+500000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+750000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)，以将C/N重量比控制在90-160的范围内。
通常，测定发酵液中铵离子含量的时间间隔不超过2小时，例如每隔30min、每隔1h或每隔2h测试一次。
可采用常规的手段测定发酵液中铵离子的含量。例如，可利用离线铵离子电极进行测定。
适用于本文的有机酸盐可选自：甲酸盐，乙酸盐，丙酸盐，乳酸盐，丁酸盐，或它们的两种或多种的组合；可以是有机酸的钠盐、钾盐或铵盐。在某些实施方案中，本文使用乙酸钠作为有机酸盐。通常，有机酸盐以溶液的形式提供。含有机酸盐的溶液可以是发酵液，例如是来自以合成气为原料的发酵液。通常，含有机酸盐的溶液中，有机酸盐的含量可以在1-20wt％的范围内，例如1-12wt％或2-10wt％。
适用于本发明的氮源可选自：氨水，铵盐，或其混合物。铵盐可以是例如硫酸铵。对所添加的氨水中氨的含量以及铵盐溶液中铵盐的浓度无特殊限制，只要其添加的量满足上述要求即可。
在发酵过程中，为获得较佳的发酵效果，通常可将发酵液的pH控制在6.0-8.0的范围内，优选6.5～7.5，更优选6.8～7.0。在本文的某些实施方案中，通过在发酵过程中连续流加有机酸，从而将发酵液的pH控制在上述范围内。有机酸的流加速度是实现控制发酵液的pH值在6.0-8.0范围内的速度。
例如，在某些实施方案中，每隔一段时间测定一次发酵液中的pH，设定有机酸流加的初始速度为0，则有机酸流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10×(最近一次测得的pH-6.9)。通常，测试pH的时间间隔不超过10分钟，例如每隔30s、每隔1min或每隔2min测试一次。可采用常规的手段测试发酵液的pH值。例如，可利用在线pH电极进行测定。
适用于本文的有机酸可选自：甲酸，乙酸，丙酸，乳酸，丁酸，或它们的两种或多种的组合。通常，有机酸以含有机酸的溶液的形式提供。该含有机酸的溶液是发酵液，例如来自以合成气为原料的发酵液。通常，含有机酸的溶液中，有机酸的含量为1-70wt％，例如，1-50wt％。
应理解的是，有机酸的添加主要用于调节发酵液的pH值，但有机酸可能也会影响到发酵液的C/N重量比。因此，在使用有机酸调节pH值时，在根据前文所述测定有机酸盐和氮源的流加速度时，也需考虑所添加的有机酸的量，以将发酵液总体的C/N重量比控制在本文所述的范围内。
在某些实施方案中，有机酸、有机酸盐和氮源可单独连续流加，也可以预先混合其中的两个或多个后再连续流加。应理解的是，流加的溶液都是经无菌处理的溶液，例如可以微孔膜过滤的方式灭菌，或高温蒸汽的方式灭菌。
本文通常利用亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)进行发酵，当然也可利用其它既能生产单细胞蛋白也能生产单细胞油脂的微生物进行发酵。因此，本文的方法可适用于既能生产单细胞蛋白也能生产单细胞油脂的微生物的发酵。
本文中，发酵通常在好氧条件下进行。发酵通常在含有有机酸和/或有机酸盐的溶液中进行。该溶液可以是发酵液或培养基。例如，可以是常规的发酵培养基，例如亚罗解脂酵母的常规发酵培养基，如含有乙酸钠、硫酸铵、磷酸二氢钾、酵母膏和硫酸镁等成分，pH值为6.5±0.2。或者，该溶液也可以是含来自以合成气为原料发酵获得的发酵液。该溶液中，有机酸和/或有机酸盐的总浓度通常在1-4wt％的范围内。
对发酵的温度、搅拌速度和通气量等参数无特殊限制，可根据不同微生物而采用该微生物常用的发酵参数。
从发酵液中分离得到的微生物，可采用本领域常规的方法提取其中的单细胞蛋白和/或单细胞油脂。例如，可离心发酵液，获得沉淀物，加入乙醚-石油醚进行提取，然后加入纯水震荡分相，获得有机相。有机相提取剩下的就都是单细胞蛋白。因此，在某些实施方案中，本文还包括从发酵液中分离出微生物细胞，提取细胞内的油脂和单细胞蛋白的步骤。
在本文的某些方面还提供一种提高发酵微生物中单细胞蛋白相对于油脂的含量的方法，所述方法包括发酵所述微生物的步骤，其中，在发酵过程中，将发酵液的C/N重量比控制在15以内的步骤。可采用本文前述的技术手段将发酵过程中发酵液的C/N重量比控制在15以内。
再者，本文也包括一种提高发酵微生物中油脂相对于单细胞蛋白的含量的方法，所述方法包括发酵所述微生物的步骤，其中，在发酵过程中，将发酵液的C/N重量比控制在80-160的范围内的步骤。同样地，可采用本文前述的技术手段将发酵过程中发酵液的C/N重量比控制在80-160的范围内。
在某些方面，本文包括将产单细胞蛋白和单细胞油脂的微生物中单细胞蛋白的含量提高至80wt％以上的方法，所述方法包括发酵所述微生物的步骤，其中，在发酵过程中，将发酵液的C/N重量比控制在15以内的步骤。可采用本文前述的技术手段将发酵过程中发酵液的C/N重量比控制在15以内。
在另外一些方面，本文包括将单细胞蛋白和单细胞油脂的微生物中单细胞油脂的含量提高到40-60wt％的方法，所述方法包括发酵所述微生物的步骤，其中，在发酵过程中，将发酵液的C/N重量比控制在80-160的范围内的步骤。可采用本文前述的技术手段将发酵过程中发酵液的C/N重量比控制在80-160的范围内。
应理解的是，本文提及的单细胞蛋白(如80wt％以上)和单细胞油脂(如40-60wt％)的重量百分比是以两者之和为计算基准。
在另外一些方面，本文还提供一种控制发酵液中C/N重量比的方法，其中，所述方法包括在发酵过程中流加有机酸、有机酸盐和氮源的步骤，其中：
(1)每隔一段时间测定一次发酵液中的pH，设定有机酸流加的初始速度为0，则有机酸流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10×(最近一次测得的pH-6.9)；
(2)每隔一段时间测定一次发酵液中的有机酸盐的含量，设定有机酸盐流加的初始速度为0，则有机酸盐流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000×(0.05％-最近一次测得的有机酸盐含量)；和
(3)每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定氮源流加的初始速度为0，则氮源流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+10000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)，或在以下范围内：实施该测定前的流加速度+500000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+750000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)，从而将发酵液的C/N比控制在90-160的范围内。
上述控制C/N重量比的方法可用于调节发酵所得微生物中的单细胞蛋白与单细胞油脂的含量。该控制C/N重量比的方法中流加有机酸、有机酸盐和氮源的步骤，第(1)－(3)点所述的测定pH、有机酸盐含量、铵离子含量以及计算流加速度等可如前文任一方面或任一实施方案所述实施。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。实施例中所采用到的方法和材料，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和材料。
实施例1
将亚罗解脂酵母(中国工业微生物菌保藏管理中心CICC)菌液(Yarrowialipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的800g培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，培养24小时，其中，10L发酵罐的7kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，培养48小时，其中，100L发酵罐的50kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
同时，
1)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸溶液(乙酸含量50％)，以控制100L发酵罐中的pH在6.8-7.0：利用在线pH电极每1min测定一次发酵液中的pH，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10*(pH-6.9)；
2)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸钠溶液(乙酸钠含量10％)，以控制100L发酵罐中的乙酸钠含量在0-0.1％：利用离线HPLC每1h测定一次发酵液中的乙酸钠含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000*(0.05％-乙酸钠含量)；
3)流加用高温蒸汽灭菌的硫酸铵溶液(硫酸铵含量20％)，以控制100L发酵罐中的C/N比在4-6：利用离线铵离子电极每1h测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+25000*(0.004％-铵离子含量)。
单细胞油脂含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得发酵液中的细胞油脂为4.78g/kg。
单细胞蛋白含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得发酵液中的细胞干重为45.02g/kg，细胞干重减去单细胞油脂含量，即为单细胞蛋白含量。
由此可得，该发酵条件下，单细胞蛋白含量89.38％，单细胞油脂含量10.61％。
实施例2
将亚罗解脂酵母菌液(Yarrowia lipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的800g培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，培养24小时，其中，10L发酵罐的7kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，培养48小时，其中，100L发酵罐的50kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
同时，
1)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸溶液(乙酸含量50％)，以控制100L发酵罐中的pH在6.8-7.0：利用在线pH电极每1min测定一次发酵液中的pH，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10*(pH-6.9)；
2)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸钠溶液(乙酸钠含量10％)，以控制100L发酵罐中的乙酸钠含量在0-0.1％：利用离线HPLC每1h测定一次发酵液中的乙酸钠含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000*(0.05％-乙酸钠含量)；
3)流加用高温蒸汽灭菌的硫酸铵溶液(硫酸铵含量20％)，以控制100L发酵罐中的C/N比在10-12：利用离线铵离子电极每1h测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+50000*(0.002％-铵离子含量)。
单细胞油脂含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得发酵液中的细胞油脂为5.65g/kg。
单细胞蛋白含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得发酵液中的细胞干重为45.48g/kg，细胞干重减去单细胞油脂含量，即为单细胞蛋白含量。
由此可得，该发酵条件下，单细胞蛋白含量87.58％，单细胞油脂含量12.42％。
实施例3
将亚罗解脂酵母菌液(Yarrowia lipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的800g培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，培养24小时，其中，10L发酵罐的7kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，培养48小时，其中，100L发酵罐的50kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
同时，
1)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸溶液(乙酸含量50％)，以控制100L发酵罐中的pH在6.8-7.0：利用在线pH电极每1min测定一次发酵液中的pH，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10*(pH-6.9)；
2)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸钠溶液(乙酸钠含量10％)，以控制100L发酵罐中的乙酸钠含量在0-0.1％：利用离线HPLC每1h测定一次发酵液中的乙酸钠含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000*(0.05％-乙酸钠含量)；
3)流加用高温蒸汽灭菌的硫酸铵溶液(硫酸铵含量20％)，以控制100L发酵罐中的C/N比在45-55：利用离线铵离子电极每1h测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+250000*(0.0004％-铵离子含量)。
单细胞油脂含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得发酵液中的细胞油脂为16.92g/kg。
单细胞蛋白含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得发酵液中的细胞干重为47.38g/kg，细胞干重减去单细胞油脂含量，即为单细胞蛋白含量。
由此可得，该发酵条件下，单细胞蛋白含量64.28％，单细胞油脂含量35.71％。
实施例4
将亚罗解脂酵母菌液(Yarrowia lipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的800g培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，培养24小时，其中，10L发酵罐的7kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，培养48小时，其中，100L发酵罐的50kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
同时，
1)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸溶液(乙酸含量50％)，以控制100L发酵罐中的pH在6.8-7.0：利用在线pH电极每1min测定一次发酵液中的pH，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10*(pH-6.9)；
2)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸钠溶液(乙酸钠含量10％)，以控制100L发酵罐中的乙酸钠含量在0-0.1％：利用离线HPLC每1h测定一次发酵液中的乙酸钠含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000*(0.05％-乙酸钠含量)；
3)流加用高温蒸汽灭菌的硫酸铵溶液(硫酸铵含量20％)，以控制100L发酵罐中的C/N比在90-110：利用离线铵离子电极每1h测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+500000*(0.0002％-铵离子含量)。
单细胞油脂含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得发酵液中的细胞油脂为23.19g/kg。
单细胞蛋白含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得发酵液中的细胞干重为45.97g/kg，细胞干重减去单细胞油脂含量，即为单细胞蛋白含量。
由此可得，该发酵条件下，单细胞蛋白含量49.55％，单细胞油脂含量50.45％。
实施例5
将亚罗解脂酵母菌液(Yarrowia lipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的800g培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，培养24小时，其中，10L发酵罐的7kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，培养48小时，其中，100L发酵罐的50kg培养基组成为：乙酸钠20g/L，硫酸铵2g/L，磷酸二氢钾2g/L，酵母膏1g/L，硫酸镁2g/L，pH值6.5，高温蒸汽灭菌。
同时，
1)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸溶液(乙酸含量50％)，以控制100L发酵罐中的pH在6.8-7.0：利用在线pH电极每1min测定一次发酵液中的pH，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10*(pH-6.9)；
2)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸钠溶液(乙酸钠含量10％)，以控制100L发酵罐中的乙酸钠含量在0-0.1％：利用离线HPLC每1h测定一次发酵液中的乙酸钠含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000*(0.05％-乙酸钠含量)；
3)流加用高温蒸汽灭菌的硫酸铵溶液(硫酸铵含量20％)，以控制100L发酵罐中的C/N比在140-160：利用离线铵离子电极每1h测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+750000*(0.00013％-铵离子含量)。
单细胞油脂含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得发酵液中的细胞油脂为25.01g/kg。
单细胞蛋白含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得发酵液中的细胞干重为47.28g/kg，细胞干重减去单细胞油脂含量，即为单细胞蛋白含量。
由此可得，该发酵条件下，单细胞蛋白含量47.11％，单细胞油脂含量52.89％。
实施例6
将亚罗解脂酵母菌液(Yarrowia lipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸钠发酵液(乙酸钠含量2.5％)800g，pH值6.8。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸钠发酵液(乙酸钠含量2.5％)7kg，pH值6.8。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，培养48小时，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸钠发酵液(乙酸钠含量2.5％)50kg，pH值6.8。
同时，
1)流加用高温蒸汽灭菌的乙酸溶液(乙酸含量50％)，以控制100L发酵罐中的pH在6.8-7.0：利用在线pH电极每1min测定一次发酵液中的pH，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10*(pH-6.9)；
2)流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸钠发酵液(乙酸钠含量2.5％)，以控制100L发酵罐中的乙酸钠含量在0-0.1％：利用离线HPLC每1h测定一次发酵液中的乙酸钠含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000*(0.05％-乙酸钠含量)；
3)流加用高温蒸汽灭菌的硫酸铵溶液(硫酸铵含量20％)，以控制100L发酵罐中的C/N比在90-110：利用离线铵离子电极每1h测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+500000*(0.0002％-铵离子含量)。
单细胞油脂含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得发酵液中的细胞油脂为40.86g/kg。
单细胞蛋白含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得发酵液中的细胞干重为75.02g/kg，细胞干重减去单细胞油脂含量，即为单细胞蛋白含量。
由此可得，该发酵条件下，单细胞蛋白含量45.54％，单细胞油脂含量54.46％。
实施例7
将亚罗解脂酵母菌液(Yarrowia lipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸钠发酵液(乙酸钠含量2.5％)800g，pH值6.8。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸钠发酵液(乙酸钠含量2.5％)7kg，pH值6.8。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，培养48小时，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸钠发酵液(乙酸钠含量2.5％)50kg，pH值6.8。
同时，
1)流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量4％)，以控制100L发酵罐中的pH在6.8-7.0：利用在线pH电极每1min测定一次发酵液中的pH，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10*(pH-6.9)；
2)流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸钠发酵液(乙酸钠含量2.5％)，以控制100L发酵罐中的乙酸钠含量在0-0.1％：利用离线HPLC每1h测定一次发酵液中的乙酸钠含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000*(0.05％-乙酸钠含量)；
3)流加氨水溶液(氨含量25％)，以控制100L发酵罐中的C/N比在90-110：利用离线铵离子电极每1h测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+500000*(0.0002％-铵离子含量)。
单细胞油脂含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得发酵液中的细胞油脂为10.45g/kg。
单细胞蛋白含量的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得发酵液中的细胞干重为23.48g/kg，细胞干重减去单细胞油脂含量，即为单细胞蛋白含量。
由此可得，该发酵条件下，单细胞蛋白含量55.49％，单细胞油脂含量44.51％。
Claims (10)
1.一种调节单细胞蛋白或油脂比例的发酵方法，其特征在于，所述方法包括在发酵过程中控制发酵液中的C/N重量比为≤15，如1-15、2-12，或将该C/N重量比控制在80-160的范围内，如90-120或90-110的步骤；
优选地，所述发酵方法为发酵亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)的方法。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，
所述方法包括：在好氧条件下，连续流加有机酸、有机酸盐和氮源，从而控制发酵中的C/N重量比；
优选地，所述有机酸选自：甲酸，乙酸，丙酸，乳酸，丁酸和它们的两种或多种的组合；
优选地，所述有机酸盐选自：甲酸盐，乙酸盐，丙酸盐，乳酸盐，丁酸盐和它们的两种或多种的组合；优选地，所述有机酸盐为有机酸的钠盐、钾盐或铵盐；和
优选地，所述氮源选自：氨水，铵盐和其混合物。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
发酵过程中，将发酵液的pH控制在6.0-8.0的范围内，优选6.5～7.5，更优选6.8～7.0；
优选地，连续流加无菌的含有机酸的溶液，流加的速度是实现控制发酵液的pH值在6.0-8.0范围内的速度；优选地，每隔一段时间测定一次发酵液中的pH，设定含有机酸的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10×(最近一次测得的pH-6.9)。
4.如权利要求1－3中任一项所述的方法，其特征在于，
在发酵过程中，连续流加无菌的含有机酸盐的溶液，流加的速度是实现控制发酵液中有机酸和有机酸盐的含量为0-0.1wt％时的速度；
优选地，每隔一段时间测定一次发酵液中的有机酸盐的含量，设定含有机酸盐的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000×(0.05％-最近一次测得的有机酸盐含量)。
5.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，
发酵过程中，连续流加含有氮源的溶液，以将发酵液中的C/N重量比控制在≤15或80-160的范围内；
优选地，每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定含氮源的溶液流加的初始速度为0，则该溶液流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+10000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)；优选在以下范围内：实施该测定前的流加速度+25000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)，以将C/N重量比控制在4-12的范围内；
或者，每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定流加的初始速度为0，则流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+500000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+750000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)，以将C/N重量比控制在90-160的范围内。
6.如权利要求3－5中任一项所述的方法，其特征在于，
测定pH的时间间隔不超过10分钟，例如每隔30s、1min或2min测试一次；
测定有机酸盐含量的时间间隔不超过2小时，例如每隔30min或1h或2h测试一次；和
测定铵离子含量的时间间隔不超过2小时，例如每隔30min或1h或2h测试一次。
7.如权利要求3－6中任一项所述的方法，其特征在于，
所述无菌的含有机酸的溶液是发酵液，优选是来自以合成气为原料的发酵液；优选地，所述无菌的含有机酸的溶液中，有机酸的含量为1-70wt％，例如，1-50wt％；和/或
所述无菌的含有机酸盐的溶液是发酵液，优选是来自以合成气为原料的发酵液；优选地，所述无菌的含有机酸盐的溶液中，有机酸盐的含量为1-20wt％，例如1-12wt％或2-10wt％。
8.如权利要求1－7中任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：在无菌的含有机酸和/或有机酸盐的溶液中接入微生物种子液进行发酵的步骤，和/或从发酵液中分离出微生物细胞，提取细胞内的油脂和单细胞蛋白的步骤；
其中，所述无菌的含有机酸和/或有机酸盐的溶液是发酵液或培养基，优选为以合成气为原料获得的发酵液；优选地，所述无菌的含有机酸和/或有机酸盐的溶液中，有机酸和/或有机酸盐的总浓度为1-4wt％。
9.一种控制发酵液中C/N重量比的方法，其中，所述方法包括在发酵过程中流加有机酸、有机酸盐和氮源的步骤，其中：
(1)每隔一段时间测定一次发酵液中的pH，设定有机酸流加的初始速度为0，则有机酸流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1min速度+10×(最近一次测得的pH-6.9)；
(2)每隔一段时间测定一次发酵液中的有机酸盐的含量，设定有机酸盐流加的初始速度为0，则有机酸盐流加的当前速度(mL/min)＝流加的前1h速度+2000×(0.05％-最近一次测得的有机酸盐含量)；和
(3)每隔一段时间测定一次发酵液中的铵离子含量，设定氮源流加的初始速度为0，则氮源流加的当前速度(mL/min)在以下范围内：实施该测定前的流加速度+10000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+50000×(0.002％-最近一次测得的铵离子含量)，或在以下范围内：实施该测定前的流加速度+500000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)到实施该测定前的流加速度+750000×(0.0002％-最近一次测得的铵离子含量)，从而将发酵液的C/N比控制在90-160的范围内。
10.权利要求9所述的方法在调节发酵所得的产单细胞蛋白和单细胞油脂的微生物中的单细胞蛋白与单细胞油脂的含量中的应用。
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