CN107557309A - 微生物发酵生产单细胞蛋白和单细胞油脂的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物发酵生产单细胞蛋白和单细胞油脂的方法。具体而言，本发明提供一种微生物发酵方法，所述方法包括：(1)在无菌的有机酸发酵液中接入微生物种子液；和(2)在好氧条件下进行发酵，发酵期间流加无菌的有机酸发酵液。本发明还包括采用所述微生物发酵方法生产单细胞蛋白和单细胞油脂。采用本发明，能以非常低的原料成本进行微生物发酵，生产单细胞蛋白和单细胞油脂。
Description
技术领域
本发明属于生物技术和微生物学领域，更具体地，本发明涉及微生物发酵生产单细胞蛋白和单细胞油脂的方法。
背景技术
单细胞油脂，也叫微生物油脂，是微生物在一定条件下利用碳水化合物、碳氢化合物和普通油脂为碳源，辅以氮源、无机盐生产的油脂和另一些有商业价值的脂质。微生物生产油脂具有油脂含量高、生产周期短、不受季节影响、不占用耕地等优点，而且可产生高营养油脂或某些特定脂肪酸组成油脂，如EPA、DHA、类可可脂等。
单细胞油脂除可代替动植物油脂生产食用油脂，特别是保健类功能性油脂外，还可以作为生产生物柴油的油源。生物柴油由各种动、植物油脂经酯化或转酯化工艺而得，而大部分微生物油的脂肪酸组成和一般植物油相近，以C16和C18系脂肪酸，如油酸、棕榈酸、亚油酸和硬脂酸为主,因此单细胞油脂可替代植物油脂生产生物柴油。
单细胞蛋白，也叫微生物蛋白，它是用许多工农业废料及石油废料人工培养的微生物菌体。因而，单细胞蛋白不是一种纯蛋白质，而是由蛋白质、脂肪、碳水化合物、核酸及不是蛋白质的含氮化合物、维生素和无机化合物等混合物组成的细胞质团。单细胞蛋白是一类凝缩的蛋白类产品，含粗蛋白50％-85％，其中氨基酸组分齐全，可利用率高，还含维生素、无机盐、脂肪和糖类等，其营养价值优于鱼粉和大豆粉。20世纪80年代中期，全世界的单细胞蛋白年产量已达2.0×106t，广泛用于食品加工和饲料中。单细胞蛋白不仅能制成“人造肉”，供人们直接食用，还常作为食品添加剂，用以补充蛋白质或维生素、矿物质等。由于某些单细胞蛋白具有抗氧化能力，使食物不容易变质，因而常用于婴儿粉及汤料、作料中。干酵母的含热量低，常作为减肥食品的添加剂。此外，单细胞蛋白还能提高食品的某些物理性能，如意大利烘饼中加入活性酵母，可以提高饼的延薄性能。酵母的浓缩蛋白具有显著的鲜味，已广泛用作食品的增鲜剂。单细胞蛋白作为饲料蛋白，也在世界范围内得到了广泛应用。
单细胞蛋白具有以下优点：第一，生产效率高，比动植物高成千上万倍，这主要是因为微生物的生长繁殖速率快。第二，生产原料来源广，一般有以下几类：①农业废物、废水，如秸秆、蔗渣、甜菜渣、木屑等含纤维素的废料及农林产品的加工废水；②工业废物、废水，如食品、发酵工业中排出的含糖有机废水、亚硫酸纸浆废液等；③石油、天然气及相关产品，如原油、柴油、甲烷、乙醇等。第三，可以工业化生产，它不仅需要的劳动力少，不受地区、季节和气候的限制，而且产量高，质量好。
尽管单细胞油脂和单细胞蛋白具有上述优点，特别是能利用来源广泛的生产原料，但是在单细胞油脂和单细胞蛋白的生产成本中，原料成本仍占总生产成本的60％以上，其中，碳源的成本最高。因此，寻找单细胞油脂和单细胞蛋白的低成本原料，成为该领域发展的亟待解决的问题。
发明内容
本发明第一方面提供一种微生物发酵方法，所述方法包括：
(1)在无菌的有机酸发酵液中接入微生物种子液；和
(2)在好氧条件下进行发酵，发酵期间流加无菌的有机酸发酵液。
在一个或多个实施方案中，所述有机酸发酵液中所含的有机酸为甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸中的一种或任意多种的组合。
在一个或多个实施方案中，所述有机酸发酵液中有机酸的含量为1～5％，优选2～4％。
在一个或多个实施方案中，所述有机发酵液的pH在6.5～8.0的范围内，例如6.5～7.5、6.5～7.0或6.5～6.8。
在一个或多个实施方案中，所述发酵液还含有酵母膏、氮源如硫酸铵、硫酸镁和钾盐如磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾。
在一个或多个实施方案中，酵母膏的含量为0.05～2.5g/L，氮源如硫酸铵的含量为0.05～2.5g/L，硫酸镁的含量为0.05～2.5g/L，钾盐的含量为0.05～5.0g/L。
在一个或多个实施方案中，所述的有机酸发酵液来自以合成气为原料产生的有机酸发酵液。
在一个或多个实施方案中，在以下条件下进行步骤(2)所述的发酵：
接种量：1～30％，例如5～25％、5～20％或5～15％；
发酵温度：25～40℃，例如25～35℃或28～32℃；
通气量：0.5～2.0vvm，例如0.8～1.8vvm、1.0～1.8vvm或1.2～1.8vvm；和
pH：6.5～7.5，如6.8～7.2。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)的发酵是分批发酵、补料分批发酵或连续发酵。
在一个或多个实施方案中，步骤(2)所述发酵是补料分批发酵；
在一个或多个实施方案中，步骤(2)所述发酵是补料分批发酵，补料方式是连续流加、不连续流加或多周期流加。
在一个或多个实施方案中，补料的方式使得发酵罐中的有机酸含量控制在0～0.5％的范围内，例如控制在0.05～0.5％，或者0.1～0.4％，或者0.1～0.3％，或者0.2～0.5％，或者0.2～0.4％的范围内。
在一个或多个实施方案中，所述微生物为酵母，紫色非硫光合细菌，霉菌，或它们的两种或多种的组合。
在一个或多个实施方案中，所述酵母选自：浅白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)，弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)，斯达氏油脂酵母(Lipomycesstarkeyi)，茁芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)，产油油脂酵母(Lipomyceslipofer)，胶粘红酵母(Rhodotorula giutinis)，类酵母红冬孢(Rhodosporidiumtoruloides)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，产朊假丝酵母(Candida utilis)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，园拟酵母(Torula utilis)，球拟酵母(Torulopsis utilis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，或它们的两种或多种的组合。
在一个或多个实施方案中，所述紫色非硫光合细菌选自：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，类球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)，嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophilus)，荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)，红螺菌(Rhodospirillum)，或它们的两种或多种的组合。
在一个或多个实施方案中，所述霉菌选自：土霉菌(Asoergullus terreus)，紫瘫麦角菌(Clavicepspurpurea)，高粱褶抱黑粉菌(Tolyposporium)，高山被孢霉(Mortierella alpina)，深黄被孢霉(Mortierrella isabellina)，或它们的两种或多种的组合。
在一个或多个实施方案中，所述微生物种子液采用以下方法制备：
(1a)在含有无菌的有机酸发酵液的摇瓶中接种微生物，进行发酵；和
(1b)将步骤(1a)获得的摇瓶种子液接种到种子发酵罐中，在无菌的有机酸发酵液中进行发酵；
其中，所述有机酸发酵液中所含的有机酸为甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸中的一种或任意多种的组合；优选地，所述有机酸发酵液中有机酸的含量为1～5％，优选2～4％；优选地，所述有机发酵液的pH在6.5～8.0的范围内，例如6.5～7.5、6.5～7.0或6.5～6.8；和优选地，所述的有机酸发酵液来自以合成气为原料产生的有机酸发酵液。
在一个或多个实施方案中，步骤(1a)的发酵温度为25～40℃，例如25～35℃或28～32℃；接种量为1～30％，例如5～25％、5～20％或5～15％；发酵时间为10～30小时，例如12～25小时或12～20小时。
在一个或多个实施方案中，步骤(1b)的发酵温度为25～40℃，例如25～35℃或28～32℃；接种量为1～30％，例如5～25％、5～20％或5～15％；发酵时间为10～36小时，例如12～22小时，12～28小时，或者18～28小时；通气量为0.5～1.5vvm，例如0.8～1.2vvm；发酵时的pH为6.5～7.5，如6.8～7.2。
本发明第二方面提供一种单细胞蛋白制备方法，所述方法包括采用本文所述的方法进行微生物发酵的步骤；
其中，所述微生物选自：酵母，紫色非硫光合细菌，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述酵母选自：产朊假丝酵母(Candida utilis)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，园拟酵母(Torula utilis)，球拟酵母(Torulopsis utilis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述紫色非硫光合细菌选自：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，类球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)，嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophilus)，荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsulata)，红螺菌(Rhodospirillum)，或它们的两种或多种的组合。
本发明第三方面提供一种单细胞油脂制备方法，所述方法包括采用本文所述的方法进行微生物发酵的步骤；
其中，所述微生物选自：酵母，霉菌，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述酵母选自：浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)，弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，茁芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)，产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)，胶粘红酵母(Rhodotorula giutinis)，类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述霉菌选自：土霉菌(Asoergullus terreus)，紫瘫麦角菌(Clavicepspurpurea)，高粱褶抱黑粉菌(Tolyposporium)，高山被孢霉(Mortierella alpina)，深黄被孢霉(Mortierrella isabellina)，或它们的两种或多种的组合。
在一个或多个实施方案中，本文所述无菌的有机酸发酵液以微孔膜过滤的方式灭菌获得。
具体实施方式
本文提供一种微生物发酵方法，本发明的微生物发酵方法采用无菌的有机酸发酵液进行发酵。
本文中，有机酸发酵液中所含的有机酸可以是甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸中的一种或任意多种的组合。因此，例如，本发明的有机酸发酵液可以是甲酸发酵液，乙酸发酵液，丙酸发酵液，乳酸发酵液，丁酸发酵液，或它们的两种或多种的组合。在某些实施方案中，适用于本发明的有机酸发酵液是以合成气为原料的有机酸发酵液〔Peng Hu等，Anaerobic CO2 Fixation by theAcetogenic Bacterium Moorella thermoacetica，AIChE Journal，2013年9月，第59卷，第9期；Peng Hu等，Integrated bioprocess for conversion of gaseoussubstrates to liquids，PNAS，2016年4月5日，113(14)：3773-8〕。本文将其全部内容以引用的方式纳入本文。
通常，本发明有机酸发酵液中有机酸的含量为1～5％，例如可以是1～4％、2～4％、1～3％、2～3％、2～5％、3～5％不等。当使用两种或两种以上有机酸时，有机酸的总含量在上述范围之内。
发酵液中还可含有酵母膏、氮源、硫酸镁以及钾盐等。氮源可以是例如硫酸铵。钾盐可以是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或其任意混合物。例如，在某些实施方案中，发酵液中酵母膏的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；氮源如硫酸铵的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；硫酸镁的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；钾盐的含量为0.05～5.0g/L，如0.1～5.0g/L、0.1～4.0g/L、0.3～3.0g/L、0.3～2.0g/L、0.5～4.0g/L、0.5～3.0g/L等。在某些实施方案中，发酵液含有的钾盐为：磷酸氢二钾0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等，和/或，磷酸二氢钾0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等。
通常，有机酸发酵液的pH在6.5～8.0的范围内，例如6.5～7.5或6.5～7.0。
可采用本领域周知的方法对用于本发明的有机酸发酵液进行灭菌。在某些实施方案中，以微孔膜过滤的方式灭菌。
通常，发酵之初，可先将微生物接入种子培养基中进行发酵，以制备种子液。种子培养基通常为本文所述的各种有机酸发酵液。在某些实施方案中，用于种子液发酵的有机酸发酵液的pH在6.5～7.0之间，例如在6.5～6.8之间。发酵通常在25～40℃下进行，例如在25～35℃、28～32℃等温度下进行。发酵时间通常在10～30小时，例如12～25小时，或者12～20小时不等。接种量通常为1～30％，例如5～25％，或者5～20％，或者5～15％等。发酵可在摇瓶中进行，摇床转速通常在100～500rpm，例如100～300rpm，150～300rpm。
获得种子液之后，可将其加到种子发酵罐中进行发酵。种子发酵罐中的发酵培养基可为本文所述的各种有机酸发酵液。在某些实施方案中，该有机酸发酵液的pH在6.5～7.0之间，例如在6.5～6.8之间。发酵通常在25～40℃下进行，例如在25～35℃、28～32℃等温度下进行。发酵时间通常在10～36小时，例如12～22小时，或者12～28小时，或者18～28小时不等。接种量通常为1～30％，例如5～25％，或者5～20％，或者5～15％等。搅拌速度通常在100～500rpm，例如100～300rpm，150～300rpm。通气量可在0.5～1.5vvm之间，例如在0.8～1.2vvm之间。发酵时的pH通常可控制在例如6.5～7.5之间，如控制在6.8～7.2之间。
之后可将种子发酵罐中的发酵液加到发酵罐中，进行主发酵。主发酵所用的发酵液为本文所述的有机酸发酵液。在某些实施方案中，该有机酸发酵液的pH在6.5～7.0之间，例如在6.5～6.8之间。发酵通常在25～40℃下进行，例如在25～35℃、28～32℃等温度下进行。接种量通常为1～30％，例如5～25％，或者5～20％，或者5～15％等。搅拌速度通常在100～500rpm，例如100～300rpm，150～300rpm，200～350rpm等。通气量可在0.5～2.0vvm之间，例如在0.8～1.8vvm之间，在1.0～1.8vvm之间，在1.2～1.8vvm之间。发酵时的pH通常可控制在例如6.5～7.5之间，如控制在6.8～7.2之间。
在某些实施方案中，发酵是分批发酵。在其它实施方案中，发酵是补料分批发酵或连续发酵。优选的是，发酵是补料分批发酵。通常，在补料分批发酵中，补料方式可以是连续流加、不连续流加或多周期流加。补料的成分可以是单一组分流加或多组分流加。例如，补料的成分可以仅是有机酸成分，或者可根据发酵液中各成分的消耗情况而配制含有包括有机酸在内的多种成分的补料液。在某些实施方案中，补料的方式使得发酵罐中的有机酸含量控制在0～0.5％的范围内，例如控制在0.05～0.5％，或者0.1～0.4％，或者0.1～0.3％，或者0.2～0.5％，或者0.2～0.4％的范围内。通常，有机酸的初始浓度为2～4％，当发酵液中有机酸的浓度小于0.5％时开始流加有机酸或含有机酸的发酵液，并控制发酵液中有机酸的终浓度在前文所述的0～0.5％之间。在某些实施方案中，当发酵液中有机酸的浓度低于0.45％，例如低于0.4％、低于0.3％、低于0.2％或低于0.1％时开始流加有机酸或有机酸发酵液。在某些实施方案中，流加的有机酸或有机酸发酵液是无菌的，优选是通过微孔膜过滤的方式灭菌。
通常，若发酵液体积超过发酵罐容积的80％，可在流加的同时放料，以控制发酵液体积在发酵罐容积的80％以内。
因此，在某些实施方案中，本发明的微生物发酵方法包括：
(1)在无菌的有机酸发酵液中接入微生物种子液；和
(2)在好氧条件下进行发酵，发酵期间流加含有机酸的补料。
适合采用本发明方法进行发酵的微生物包括但不限于酵母，紫色非硫光合细菌，霉菌，或它们的两种或多种的组合。
在某些实施方案中，适合于本发明的酵母可选自：浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)，弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，茁芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)，产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)，胶粘红酵母(Rhodotorula giutinis)，类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，产朊假丝酵母(Candida utilis)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，园拟酵母(Torula utilis)，球拟酵母(Torulopsis utilis)，酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，或它们的两种或多种的组合。
在某些实施方案中，适用于本发明的霉菌可选自：土霉菌(Asoergullusterreus)，紫瘫麦角菌(Clavicepspurpurea)，高粱褶抱黑粉菌(Tolyposporium)，高山被孢霉(Mortierella alpina)，深黄被孢霉(Mortierrella isabellina)，或它们的两种或多种的组合。
在某些实施方案中，适用于本发明的紫色非硫光合细菌可选自：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonas palustris)，类球红假单胞菌(Rhodobactersphaeroides)，嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophilus)，荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonas capsulata)，红螺菌(Rhodospirillum)，或它们的两种或多种的组合。
根据所使用的不同微生物，可采用本发明的发酵方法制备单细胞油脂或单细胞蛋白。
例如，当采用本发明的方法发酵产朊假丝酵母(Candida utilis)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，园拟酵母(Torula utilis)，球拟酵母(Torulopsisutilis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)，或它们的两种或多种的组合；或者发酵所述紫色非硫光合细菌时，所得发酵产物可制备成蛋白质制品。通常，直接将发酵产物干燥，即可获得所需的蛋白质制品。由此获得的蛋白质制品可用作饲料的成分，也可用作食品添加剂。
或者，当采用本发明的方法发酵浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)，弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，茁芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)，产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)，胶粘红酵母(Rhodotorula giutinis)，类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，或它们的两种或多种的组合；或发酵所述霉菌时，可从发酵产物中分离充单细胞油脂。可采用本领域周知的方法分离获得单细胞油脂。例如，在某些实施方案中，将发酵液样品离心，所得沉淀加水洗后离心，所得沉淀加入数倍发酵液体积的抽提溶剂，如体积比为1：2的乙醚-石油醚，室温抽提，然后加入纯水震荡分相，移取有机相，即可获得所需的单细胞油脂。
因此，在某些实施方案中，本发明提供一种单细胞蛋白的制备方法，所述方法包括：
(1)在无菌的有机酸发酵液中接入微生物种子液；和
(2)在好氧条件下进行发酵，发酵期间流加含有机酸的补料；
其中，所述微生物选自：酵母，紫色非硫光合细菌，或它们的两种或多种的组合；所述酵母选自：产朊假丝酵母(Candida utilis)，热带假丝酵母(Candidatropicalis)，园拟酵母(Torula utilis)，球拟酵母(Torulopsis utilis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，或它们的两种或多种的组合。
在制备单细胞蛋白的某些实施方案中，有机酸发酵液中所含的有机酸可以是甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸中的一种或任意多种的组合。在某些实施方案中，所述有机酸发酵液是以合成气为原料的有机酸发酵液。
在制备单细胞蛋白的某些实施方案中，所述有机酸发酵液中有机酸的含量为1～5％，例如可以是1～4％、2～4％、1～3％、2～3％、2～5％、3～5％不等。当使用两种或两种以上有机酸时，有机酸的总含量在上述范围之内。
发酵液中还可含有酵母膏、氮源、硫酸镁以及钾盐等。氮源可以是例如硫酸铵。钾盐可以是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或其任意混合物。例如，在某些实施方案中，发酵液中酵母膏的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；氮源如硫酸铵的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；硫酸镁的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；钾盐的含量为0.05～5.0g/L，如0.1～5.0g/L、0.1～4.0g/L、0.3～3.0g/L、0.3～2.0g/L、0.5～4.0g/L、0.5～3.0g/L等。在某些实施方案中，发酵液含有的钾盐为：磷酸氢二钾0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等，和/或，磷酸二氢钾0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等。
在制备单细胞蛋白的某些实施方案中，有机酸发酵液的pH在6.5～8.0的范围内，例如6.5～7.5或6.5～7.0。
在制备单细胞蛋白的某些实施方案中，有机酸发酵液的pH在6.5～7.0之间，例如在6.5～6.8之间。
在制备单细胞蛋白的某些实施方案中，发酵在25～40℃下进行，例如在25～35℃、28～32℃等温度下进行。接种量通常为1～30％，例如5～25％，或者5～20％，或者5～15％等。搅拌速度通常在100～500rpm，例如100～300rpm，150～300rpm，200～350rpm等。通气量可在0.5～2.0vvm之间，例如在0.8～1.8vvm之间，在1.0～1.8vvm之间，在1.2～1.8vvm之间。发酵时的pH通常可控制在例如6.5～7.5之间，如控制在6.8～7.2之间。
在制备单细胞蛋白的某些实施方案中，发酵是分批发酵。在其它实施方案中，发酵是补料分批发酵或连续发酵。优选的是，发酵是补料分批发酵。通常，在补料分批发酵中，补料方式可以是连续流加、不连续流加或多周期流加。补料的成分可以是单一组分流加或多组分流加。例如，补料的成分可以仅是有机酸成分，或者可根据发酵液中各成分的消耗情况而配制含有包括有机酸在内的多种成分的补料液。在某些实施方案中，补料的方式使得发酵罐中的有机酸含量控制在0～0.5％的范围内，例如控制在0.05～0.5％，或者0.1～0.4％，或者0.1～0.3％，或者0.2～0.5％，或者0.2～0.4％的范围内。通常，有机酸的初始浓度为2～4％，当发酵液中有机酸的浓度小于0.5％时开始流加有机酸或含有机酸的发酵液，并控制发酵液中有机酸的终浓度在前文所述的0～0.5％之间。在某些实施方案中，当发酵液中有机酸的浓度低于0.45％，例如低于0.4％、低于0.3％、低于0.2％或低于0.1％时开始流加有机酸或有机酸发酵液。在某些实施方案中，流加的有机酸或有机酸发酵液是无菌的，优选是通过微孔膜过滤的方式灭菌。
通常，若发酵液体积超过发酵罐容积的80％，可在流加的同时放料，以控制发酵液体积在发酵罐容积的80％以内。
通常，发酵之初，可如前文所述制备种子液，并将种子液加到种子发酵罐中进行发酵。
在其它实施方案中，本发明提供一种单细胞油脂的制备方法，所述方法包括：
(1)在无菌的有机酸发酵液中接入微生物种子液；和
(2)在好氧条件下进行发酵，发酵期间流加含有机酸的补料；
其中，所述微生物选自：酵母，霉菌，或它们的两种或多种的组合；所述酵母选自：浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)，弯隐球酵母(Cryptococcusalbidun)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，茁芽丝孢酵母(Trichospironpullulans)，产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)，胶粘红酵母(Rhodotorulagiutinis)，类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)，亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)，或它们的两种或多种的组合。
在制备单细胞油脂的某些实施方案中，有机酸发酵液中所含的有机酸可以是甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸中的一种或任意多种的组合。在某些实施方案中，所述有机酸发酵液是以合成气为原料的有机酸发酵液。
在制备单细胞油脂的某些实施方案中，所述有机酸发酵液中有机酸的含量为1～5％，例如可以是1～4％、2～4％、1～3％、2～3％、2～5％、3～5％不等。当使用两种或两种以上有机酸时，有机酸的总含量在上述范围之内。
发酵液中还可含有酵母膏、氮源、硫酸镁以及钾盐等。氮源可以是例如硫酸铵。钾盐可以是磷酸氢二钾、磷酸二氢钾或其任意混合物。例如，在某些实施方案中，发酵液中酵母膏的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；氮源如硫酸铵的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；硫酸镁的含量为0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等；钾盐的含量为0.05～5.0g/L，如0.1～5.0g/L、0.1～4.0g/L、0.3～3.0g/L、0.3～2.0g/L、0.5～4.0g/L、0.5～3.0g/L等。在某些实施方案中，发酵液含有的钾盐为：磷酸氢二钾0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等，和/或，磷酸二氢钾0.05～2.5g/L，如0.1～2.5g/L、0.1～2.0g/L、0.3～2.0g/L、0.3～1.5g/L、0.5～1.5g/L、0.5～2.0g/L等。
制备单细胞油脂的某些实施方案中，有机酸发酵液的pH在6.5～8.0的范围内，例如6.5～7.5或6.5～7.0。
在制备单细胞油脂的某些实施方案中，有机酸发酵液的pH在6.5～7.0之间，例如在6.5～6.8之间。
在制备单细胞油脂的某些实施方案中，发酵在25～40℃下进行，例如在25～35℃、28～32℃等温度下进行。接种量通常为1～30％，例如5～25％，或者5～20％，或者5～15％等。搅拌速度通常在100～500rpm，例如100～300rpm，150～300rpm，200～350rpm等。通气量可在0.5～2.0vvm之间，例如在0.8～1.8vvm之间，在1.0～1.8vvm之间，在1.2～1.8vvm之间。发酵时的pH通常可控制在例如6.5～7.5之间，如控制在6.8～7.2之间。
在制备单细胞油脂的某些实施方案中，发酵是分批发酵。在其它实施方案中，发酵是补料分批发酵或连续发酵。优选的是，发酵是补料分批发酵。通常，在补料分批发酵中，补料方式可以是连续流加、不连续流加或多周期流加。补料的成分可以是单一组分流加或多组分流加。例如，补料的成分可以仅是有机酸成分，或者可根据发酵液中各成分的消耗情况而配制含有包括有机酸在内的多种成分的补料液。在某些实施方案中，补料的方式使得发酵罐中的有机酸含量控制在0～0.5％的范围内，例如控制在0.05～0.5％，或者0.1～0.4％，或者0.1～0.3％，或者0.2～0.5％，或者0.2～0.4％的范围内。通常，有机酸的初始浓度为2～4％，当发酵液中有机酸的浓度小于0.5％时开始流加有机酸或含有机酸的发酵液，并控制发酵液中有机酸的终浓度在前文所述的0～0.5％之间。在某些实施方案中，当发酵液中有机酸的浓度低于0.45％，例如低于0.4％、低于0.3％、低于0.2％或低于0.1％时开始流加有机酸或有机酸发酵液。在某些实施方案中，流加的有机酸或有机酸发酵液是无菌的，优选是通过微孔膜过滤的方式灭菌。
通常，若发酵液体积超过发酵罐容积的80％，可在流加的同时放料，以控制发酵液体积在发酵罐容积的80％以内。
通常，发酵之初，可如前文所述制备种子液，并将种子液加到种子发酵罐中进行发酵。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不限制本发明的范围。实施例中所用到的方法、试剂、仪器等，除非另有说明，否则为本领域常规的方法、试剂和仪器。此外，文中所述的各技术手段的优选范围或优选的技术手段，相互之间可任意组合。
实施例1
将亚罗解脂酵母菌液(Yarrowia lipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量2.5％)800g，pH值6.8。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，pH控制在7.0，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量2.5％)7kg，pH值6.8。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，pH控制在7.0，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量2.5％)50kg，pH值6.8。同时流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量2.5％)以控制100L发酵罐中的乙酸含量在0.1-0.2％，当液位超过80L时，流加的同时放料以控制液位在80L。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得细胞干重为5.02g/kg。
细胞油脂的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得细胞油脂为1.86g/kg。
细胞油脂成分的测定：每个细胞油脂样品(大约0.25mg)中加入溶于甲醇中的1mL 2％(wt/vol)的硫酸，在60℃下孵育2小时，然后加入1mL正己烷，涡旋振荡10min，取800uL正己烷相入玻璃管，进行气相色谱分析。
气相色谱分析条件：安捷伦450气相色谱，配有火焰离子化检测器和毛细管柱HPINNOWAX(30m x 0.25mm)。烘箱条件如下：120℃(1min)，在15min中逐渐增高至230℃，在230℃下保持5min。分流比为20：1。通过与Sigma-Aldrich公司的FAME标准品进行比较而对脂肪酸进行鉴别和定量。
结果发现，本实施例获得的油脂成分主要含有六种脂肪酸甲酯：棕榈酸甲酯(C16：0)，甲基棕榈烯酸(C16：1)，硬脂酸甲酯(C18：0)，油酸甲酯(C18：1)，亚油酸甲酯(C18：2)，亚麻酸甲酯(C18：3)。
细胞油脂的各脂肪酸甲酯含量为(占细胞油脂的百分比)：棕榈酸甲酯(C16：0)17.3％，甲基棕榈烯酸(C16：1)5.4％，硬脂酸甲酯(C18：0)9.8％，油酸甲酯(C18：1)42.2％，亚油酸甲酯(C18：2)17.3％，亚麻酸甲酯(C18：3)7.6％。
实施例2
将高山被孢霉菌液(Mortierella alpina)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度32℃，摇床转速250rpm，培养24小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乳酸发酵液(乳酸含量3％)800g，pH值6.5。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度32℃，搅拌转速150rpm，通气1vvm，pH控制在6.8，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乳酸发酵液(乳酸含量3％)7kg，pH值6.5。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度32℃，搅拌转速250rpm，通气1.5vvm，pH控制在6.8，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乳酸发酵液(乳酸含量3％)50kg，pH值6.5。同时流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乳酸发酵液(乳酸含量3％)以控制100L发酵罐中的乳酸含量在0.2-0.3％，当液位超过80L时，流加的同时放料以控制液位在80L。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以3000rpm的转速离心5min，所得沉淀加水洗一次，再以3000rpm的转速离心5min，所得沉淀直接85℃过夜烘干后称重，测得细胞干重为5.48g/kg。
细胞油脂的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得细胞油脂为1.65g/kg。
实施例3
将浅白色隐球酵母菌液(Cryptococcus albidus)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度28℃，摇床转速150rpm，培养20小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和乳酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，乳酸含量1.5％)800g，pH值6.7。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度28℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，pH控制在7.2，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和乳酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，乳酸含量1.5％)7kg，pH值6.7。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度28℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，pH控制在7.2，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和乳酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，乳酸含量1.5％)50kg，pH值6.7。同时流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和乳酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，乳酸含量1.5％)以控制100L发酵罐中的乙酸和乳酸总含量在0.1-0.3％，当液位超过80L时，流加的同时放料以控制液位在80L。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得细胞干重为5.12g/kg。
细胞油脂的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得细胞油脂为2.05g/kg。
实施例4
将深黄被孢霉菌液(Mortierrella isabellina)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速220rpm，培养18小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和丁酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，丁酸含量1％)800g，pH值6.6。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速180rpm，通气1vvm，pH控制在7.0，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和丁酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，丁酸含量1％)7kg，pH值6.6。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速280rpm，通气1.5vvm，pH控制在7.0，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和丁酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，丁酸含量1％)50kg，pH值6.6。同时流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和丁酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，丁酸含量1％)以控制100L发酵罐中的乙酸和丁酸总含量在0-0.2％，当液位超过80L时，流加的同时放料以控制液位在80L。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以3000rpm的转速离心5min，所得沉淀加水洗一次，再以3000rpm的转速离心5min，所得沉淀直接85℃过夜烘干后称重，测得细胞干重为4.79g/kg。
细胞油脂的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rm的转速离心2min，所得沉淀加入4倍发酵液体积的乙醚-石油醚(体积比1:2)，室温抽提2h，然后加入纯水震荡分相，移取有机相用氮气吹至恒重后称重，测得细胞油脂为1.25g/kg。
实施例5
将酿酒酵母菌液(Saccharomyces cerevisiae)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速200rpm，培养16小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量2.5％)800g，pH值6.8。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，pH控制在7.0，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量2.5％)7kg，pH值6.8。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，pH控制在7.0，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量2.5％)50kg，pH值6.8。同时流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸发酵液(乙酸含量2.5％)以控制100L发酵罐中的乙酸含量在0.1-0.2％，当液位超过80L时，流加的同时放料以控制液位在80L。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得细胞干重。测得酵母发酵液细胞干重为5.41g/kg。
实施例6
将荚膜红假单胞菌菌液(Rhodopseudomonas capsulata)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度32℃，摇床转速250rpm，培养24小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乳酸发酵液(乳酸含量3％)800g，pH值6.5。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度32℃，搅拌转速150rpm，通气1vvm，pH控制在6.8，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乳酸发酵液(乳酸含量3％)7kg，pH值6.5。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度32℃，搅拌转速250rpm，通气1.5vvm，pH控制在6.8，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乳酸发酵液(乳酸含量3％)50kg，pH值6.5。同时流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乳酸发酵液(乳酸含量3％)以控制100L发酵罐中的乳酸含量在0.2-0.3％，当液位超过80L时，流加的同时放料以控制液位在80L。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以3000rpm的转速离心5min，所得沉淀加水洗一次，再以3000rpm的转速离心5min，所得沉淀直接85℃过夜烘干后称重，测得细胞干重。测得光合细菌发酵液细胞干重为6.05g/kg。
实施例7
将亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度28℃，摇床转速150rpm，培养20小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和乳酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，乳酸含量1.5％)800g，pH值6.7。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度28℃，搅拌转速200rpm，通气1vvm，pH控制在7.2，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和乳酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，乳酸含量1.5％)7kg，pH值6.7。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度28℃，搅拌转速300rpm，通气1.5vvm，pH控制在7.2，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和乳酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，乳酸含量1.5％)50kg，pH值6.7。同时流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和乳酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，乳酸含量1.5％)以控制100L发酵罐中的乙酸和乳酸总含量在0.1-0.3％，当液位超过80L时，流加的同时放料以控制液位在80L。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀加水洗一次，再以4000rpm的转速离心2min，所得沉淀直接80℃过夜烘干后称重，测得细胞干重。测得酵母发酵液细胞干重为5.62g/kg。
实施例8
将类球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)按照10％的接种量接入5L种子摇瓶中进行培养，温度30℃，摇床转速220rpm，培养18小时，其中，5L种子摇瓶的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和丁酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，丁酸含量1％)800g，pH值6.6。
再按照10％的接种量转入10L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速180rpm，通气1vvm，pH控制在7.0，培养24小时，其中，10L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和丁酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，丁酸含量1％)7kg，pH值6.6。
然后按照10％的接种量转入100L发酵罐中培养，温度30℃，搅拌转速280rpm，通气1.5vvm，pH控制在7.0，其中，100L发酵罐的培养基组成为：用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和丁酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，丁酸含量1％)50kg，pH值6.6。同时流加用0.22um孔径陶瓷膜过滤除菌的乙酸和丁酸混合发酵液(乙酸含量1.2％，丁酸含量1％)以控制100L发酵罐中的乙酸和丁酸总含量在0-0.2％，当液位超过80L时，流加的同时放料以控制液位在80L。
细胞干重的测定：将发酵液样品称重后，以3000rpm的转速离心5min，所得沉淀加水洗一次，再以3000rpm的转速离心5min，所得沉淀直接85℃过夜烘干后称重，测得细胞干重。测得酵母发酵液细胞干重为4.85g/kg。
Claims (10)
1.一种微生物发酵方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)在无菌的有机酸发酵液中接入微生物种子液；和
(2)在好氧条件下进行发酵，发酵期间流加无菌的有机酸发酵液。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述有机酸发酵液中所含的有机酸为甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸中的一种或任意多种的组合；
优选地所述有机酸发酵液中有机酸的含量为1～5％，优选2～4％；
优选地，所述有机发酵液的pH在6.5～8.0的范围内，例如6.5～7.5、6.5～7.0或6.5～6.8；
优选地，所述发酵液还含有酵母膏、氮源如硫酸铵、硫酸镁和钾盐如磷酸氢二钾和/或磷酸二氢钾，其中，酵母膏的含量为0.05～2.5g/L，氮源如硫酸铵的含量为0.05～2.5g/L，硫酸镁的含量为0.05～2.5g/L，钾盐的含量为0.05～5.0g/L；和
优选地，所述有机酸发酵液来自以合成气为原料产生的有机酸发酵液。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在以下条件下进行步骤(2)所述的发酵：
接种量：1～30％，例如5～25％、5～20％或5～15％；
发酵温度：25～40℃，例如25～35℃或28～32℃；
通气量：0.5～2.0vvm，例如0.8～1.8vvm、1.0～1.8vvm或1.2～1.8vvm；和
pH：6.5～7.5，如6.8～7.2。
4.如权利要求1－3中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)的发酵是分批发酵、补料分批发酵或连续发酵；
优选地，步骤(2)所述发酵是补料分批发酵；
优选地，步骤(2)所述发酵是补料分批发酵，补料方式是连续流加、不连续流加或多周期流加；优选地，补料的方式使得发酵罐中的有机酸含量控制在0～0.5％的范围内，例如控制在0.05～0.5％，或者0.1～0.4％，或者0.1～0.3％，或者0.2～0.5％，或者0.2～0.4％的范围内。
5.如权利要求1－4中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物为酵母，紫色非硫光合细菌，霉菌，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述酵母选自：浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)，弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，茁芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)，产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)，胶粘红酵母(Rhodotorula giutinis)，类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，产朊假丝酵母(Candida utilis)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，园拟酵母(Torula utilis)，球拟酵母(Torulopsisutilis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，亚罗解脂酵母(Yarrowialipolytica)，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述紫色非硫光合细菌选自：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，类球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)，嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophilus)，荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsulata)，红螺菌(Rhodospirillum)，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述霉菌选自：土霉菌(Asoergullus terreus)，紫瘫麦角菌(Clavicepspurpurea)，高粱褶抱黑粉菌(Tolyposporium)，高山被孢霉(Mortierella alpina)，深黄被孢霉(Mortierrella isabellina)，或它们的两种或多种的组合。
6.如权利要求1－5中任一项所述的方法，其特征在于，所述微生物种子液采用以下方法制备：
(1a)在含有无菌的有机酸发酵液的摇瓶中接种微生物，进行发酵；和
(1b)将步骤(1a)获得的摇瓶种子液接种到种子发酵罐中，在无菌的有机酸发酵液中进行发酵；
其中，所述有机酸发酵液中所含的有机酸为甲酸、乙酸、丙酸、乳酸和丁酸中的一种或任意多种的组合；优选地，所述有机酸发酵液中有机酸的含量为1～5％，优选2～4％；优选地，所述有机发酵液的pH在6.5～8.0的范围内，例如6.5～7.5、6.5～7.0或6.5～6.8；和优选地，所述的有机酸发酵液来自以合成气为原料产生的有机酸发酵液。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，
步骤(1a)的发酵温度为25～40℃，例如25～35℃或28～32℃；接种量为1～30％，例如5～25％、5～20％或5～15％；发酵时间为10～30小时，例如12～25小时或12～20小时；和/或
步骤(1b)的发酵温度为25～40℃，例如25～35℃或28～32℃；接种量为1～30％，例如5～25％、5～20％或5～15％；发酵时间为10～36小时，例如12～22小时，12～28小时，或者18～28小时；通气量为0.5～1.5vvm，例如0.8～1.2vvm；发酵时的pH为6.5～7.5，如6.8～7.2。
8.一种单细胞蛋白制备方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1－7中任一项所述的方法进行微生物发酵的步骤；
其中，所述微生物选自：酵母，紫色非硫光合细菌，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述酵母选自：产朊假丝酵母(Candida utilis)，热带假丝酵母(Candida tropicalis)，园拟酵母(Torula utilis)，球拟酵母(Torulopsis utilis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述紫色非硫光合细菌选自：沼泽红假单胞菌(Rhodopseudomonaspalustris)，类球红假单胞菌(Rhodobacter sphaeroides)，嗜酸红假单胞菌(Rhodopseudomonas acidophilus)，荚膜红假单胞菌(Rhodopseudomonascapsulata)，红螺菌(Rhodospirillum)，或它们的两种或多种的组合。
9.一种单细胞油脂制备方法，其特征在于，所述方法包括采用权利要求1－7中任一项所述的方法进行微生物发酵的步骤；
其中，所述微生物选自：酵母，霉菌，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述酵母选自：浅白色隐球酵母(Cryptococcus albidus)，弯隐球酵母(Cryptococcus albidun)，斯达氏油脂酵母(Lipomyces starkeyi)，茁芽丝孢酵母(Trichospiron pullulans)，产油油脂酵母(Lipomyces lipofer)，胶粘红酵母(Rhodotorula giutinis)，类酵母红冬孢(Rhodosporidium toruloides)，亚罗解脂酵母(Yarrowia lipolytica)，或它们的两种或多种的组合；
优选地，所述霉菌选自：土霉菌(Asoergullus terreus)，紫瘫麦角菌(Clavicepspurpurea)，高粱褶抱黑粉菌(Tolyposporium)，高山被孢霉(Mortierella alpina)，深黄被孢霉(Mortierrella isabellina)，或它们的两种或多种的组合。
10.如权利要求1－9中任一项所述的方法，其特征在于，所述无菌的有机酸发酵液以微孔膜过滤的方式灭菌获得。
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