CN106282030A - 裂殖壶菌菌体残渣的利用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种微生物发酵技术领域的裂殖壶菌菌体残渣的利用方法。本发明通过对经酶法破壁处理并经三相分离技术提取油脂后的裂殖壶菌菌体进行再利用，将其直接应用到裂殖壶菌发酵培养基中，充当部分发酵氮源。本发明的方法处理简便，可节约培养基中原有发酵氮源酵母粉的用量，且对裂殖壶菌的发酵生长及DHA产量无影响。本发明的方法简单易行，效果明显，在实现裂殖壶菌菌体残渣再利用的同时，还节约了裂殖壶菌发酵产DHA的发酵成本，实现了裂殖壶菌发酵产DHA产业的可持续性发展，实现了该产业的技术升级，同时也实现了对环境的保护。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，涉及一种裂殖壶菌菌体残渣的利用方法。
背景技术
二十二碳六烯酸(DHA)属于n-3系列的多不饱和脂肪酸，其是人体自身不能合成但又不可缺少的重要营养素。DHA具有促进脑部及视力发育，提高智力，改善记忆力和视力的作用。
DHA的来源路径主要有两种，一种来源路径为传统深海鱼油的提取纯化，而深海鱼油资源随季节变化供应受限，产量远不能满足市场需求，且近年来，随着海洋环境遭到严重污染，致使其安全性无法得到保障。基于深海鱼油的以上弊端，人们已经逐渐将注意力转移到一些低等海洋微生物，如破囊壶菌(Thraustochytrium)、裂殖壶菌(Schizochytrium)、寇氏隐甲藻(Crythecodinium cohnii)等都能在体内合成DHA。由于海洋微生物具有生长繁殖速度快、油脂含量高、且易于进行大规模培养等特点，成为发酵工业上规模化生产DHA的首选方式。
现目前，微生物法获取DHA油脂的主要来源是利用裂殖壶菌发酵生产，通过对裂殖壶菌菌体的大量积累，然后对其进行机械破壁或者酶解破壁处理后，获得富含DHA的油脂。因为裂殖壶菌体内所含油脂仅占菌体总质量的30-60％，从而在获取大量DHA油脂的同时，致使裂殖壶菌菌体残渣得到大量的堆积。
裂殖壶菌菌体残渣中含有丰富的营养物质，包括少量的碳源、丰富的有机氮源以及其他微量元素等。菌体残渣的堆积，一方面不利于DHA发酵产业的可持续性发展，且对环境造成一定的污染。为此，研究者进行了有关裂殖壶菌菌体残渣的应用研究，如中国专利CN102965396A公开了一种含正己烷的裂殖壶菌菌体残渣的应用，通过对正己烷萃取后的裂殖壶菌菌体残渣与稻草共发酵产沼气，从而实现菌体残渣的再利用。但该应用附加值较低，对DHA发酵产业本身技术的升级贡献较小。另外，裂殖壶菌菌体残渣与稻草共发酵产生沼气后，剩余的残渣混合物仍存在堆积的问题，对环境仍有一定程度的污染。尽管现有技术CN200910063369.6公开了一种重复利用高山被孢霉菌粕制备花生四烯酸的方法，但是高山被孢霉为丝状真菌，生长周期长，利用高山被孢霉菌粕充当培养基中发酵氮源的处理过程极为复杂。首先，发酵完成后的高山被孢霉菌体需要进行过滤收集菌体，随后，又需要对其进行膨化、粉碎处理，菌体经粉碎后，还需要进行酶解处理后才能用于发酵培养，该技术工艺复杂、处理繁琐，成本过高，且对于提取花生四烯酸油脂后菌体中残余的非极性溶剂问题未进行表述，从而致使该技术不适用于工业化(例如100L发酵规模)应用。基于裂殖壶菌与高山被孢霉菌生物特性的本质区别、及后续发酵工艺的显著差异，CN200910063369.6所示的技术方案难以为裂殖壶菌菌渣的再利用提供技术参照。
发明内容
针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是提供一种裂殖壶菌菌体残渣的利用方法，能够充分利用裂殖壶菌菌体残渣中的多种营养物质，尽可能实现裂殖壶菌菌体残渣应用的高附加值。本发明通过对经过酶法破壁处理并经三相分离技术提取油脂后的菌体进行再利用，将其直接应用到裂殖壶菌发酵培养基中，充当部分发酵氮源，用于裂殖壶菌的发酵培养。在本发明中，裂殖壶菌为球状真菌，生长速度快，发酵周期短。裂殖壶菌在被应用于充当发酵氮源的处理过程及工艺极为简单，仅需要经过酶解破壁，再利用三相分离技术提取出DHA油脂后，剩余的裂殖壶菌菌体残渣即可直接用于发酵培养基中。
本发明是通过以下技术方案实现的：
第一方面，本发明提供一种裂殖壶菌菌体残渣作为裂殖壶菌发酵培养基组成成分的用途。
优选地，所述组成成分具体指作为氮源成分。
优选地，所述裂殖壶菌菌体残渣具体为DHA油脂经提取后产生的裂殖壶菌残留物。
更具体地，所述裂殖壶菌菌体残渣是裂殖壶菌菌体经酶解破壁、再利用三相分离技术提取出DHA油脂后产生的裂殖壶菌残留物。
第二方面，本发明提供一种含有裂殖壶菌菌体残渣的裂殖壶菌发酵培养基，含裂殖壶菌菌体残渣液的体积浓度为5-20％；其中，所述裂殖壶菌菌体残渣液中裂殖壶菌菌体残渣的质量浓度为30-50％。上述参数的限定不会改变发酵体系的粘度和整体性质，且对裂殖壶菌的发酵结果无不良影响，因此，含裂殖壶菌菌体残渣液的体积浓度为5-20％；其中，所述裂殖壶菌菌体残渣液中裂殖壶菌菌体残渣的质量浓度为30-50％。
优先地，根据裂殖壶菌发酵培养基中最佳碳氮比及裂殖壶菌菌体残渣中和酵母粉中有机氮的含量，当向培养基中添加质量浓度为30-50％的裂殖壶菌菌体残渣液5-20％时，相应的，此时，培养基中酵母粉浓度则降为原先浓度的20-60％。
优选地，所述裂殖壶菌发酵培养基的组分包括：葡萄糖40.0-80.0g/L，酵母粉x g/L，MgSO4·7H2O 0.2-1.0g/L，KH2PO4 0.5-2.0g/L，(NH4)2SO4 0-5.0g/L，NaNO3 1.0-5.0g/L，Na2SO4 2.0-10.0g/L，壶菌菌体残渣液在裂殖壶菌发酵培养基所占的体积百分数为5-20％(v/v)；
其中，x＝(5.0-15.0)*(20-60)％。
第三方面，本发明提供一种用所述裂殖壶菌发酵培养基进行裂殖壶菌发酵的方法，将裂殖壶菌的种子液接种于所述发酵培养基，发酵培养，即可。
优选地，所述种子液的接种量为所述发酵培养基体积的5-10％。
进一步优选地，所述种子液的接种量为所述发酵培养基体积的8％。经过一系列接种量的优化实验，当种子液接种量为8％时，此时发酵培养过程中的延迟期最短，发酵周期也因此变为最短，且发酵结束后获取的DHA含量及产量均为最高，因此做此优选方案。
优选地，所述种子液是将裂殖壶菌接种于种子培养基中培养所得；其中，所述种子培养基包括组分如下：
葡萄糖20.0-40.0g/L，酵母粉5.0-10.0g/L，牛肉膏0-3.0g/L，蛋白胨2-8.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2-1.0g/L，KH2PO4 0.2-1.0g/L，海水晶5.0-20.0g/L
与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
本发明的优点在于处理简便，简单易行。通过裂殖壶菌菌体残渣的再利用，可节约培养基中原有发酵氮源酵母粉的用量，且对裂殖壶菌的发酵生长及DHA产量无影响，从而在实现裂殖壶菌菌体残渣的再利用的同时，也节约了裂殖壶菌发酵产DHA的发酵成本，实现了裂殖壶菌发酵产DHA产业的可持续性发展，实现了该产业的技术升级，也实现了对环境的保护。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
本发明方法的具体实现步骤为：
(1)将低温冻存的裂殖壶菌种活化培养成裂殖壶菌种子液；
活化培养所采用的种子培养基可以采用现有技术提供的各种组分，其优选的组分(g/L)为：葡萄糖20.0-40.0，酵母粉5.0-10.0，牛肉膏0-3.0蛋白胨2-8.0，MgSO4·7H2O0.2-1.0，KH2PO4 0.2-1.0，海水晶5.0-20.0。
(2)将所述裂殖壶菌种子液按照体积百分比5％-10％(优选8％)接入发酵培养基进行培养；
发酵培养基可以采用现有技术提供的各种组分，发酵培养基优选的组分(g/L)为：葡萄糖40.0-80.0，酵母粉5.0-15.0，MgSO4·7H2O 0.2-1.0，KH2PO4 0.5-2.0，(NH4)2SO4 0-5.0，NaNO3 1.0-5.0，Na2SO4 2.0-10.0。
(3)结束发酵后，对裂殖壶菌菌体进行富集处理。
(4)对富集后的裂殖壶菌菌体进行破壁处理，裂殖壶菌菌体破壁的方法可以是酶法破壁，用于裂殖壶菌破壁的酶可以是碱性蛋白酶、纤维素酶及果胶酶的一种或者几种。
(5)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，可以得到DHA的含量。
(6)DHA油脂提取完成后，将剩下的裂殖壶菌菌体残渣用自来水进行稀释，充当营养物质，且裂殖壶菌菌体残渣液中水的含量不得高于50-70％(质量含量)，使剩余菌体残渣的质量浓度为30％-50％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，用于裂殖壶菌的培养。剩余菌体残渣，可以充当发酵氮源，直接用于下一批次的裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的5％-20％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的20％-60％。
(7)添加有裂殖壶菌菌体残渣的发酵培养基培养裂殖壶菌后，裂殖壶菌经过菌体的富集、破壁及提取DHA油脂后，剩下的裂殖壶菌菌体残渣可继续循环使用，充当下一批裂殖壶菌发酵培养基中的营养物质。
其中，步骤(3)、(4)均可以采用现有技术的方案，在此不再赘述。
本发明的方法适用于各种裂殖壶菌菌体残渣，为了更加清楚的对发明内容进行解释说明，下述实施例使用了专利CN104450809A(专利申请号为CN201410667537.3，发明名称为一种促进裂殖壶菌油脂中DHA合成的方法)中披露的裂殖壶菌，该专利中披露了如下菌株“裂殖壶菌(Schizochytrium sp)S056,于2013年9月29日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 2013459”,下述实施例阐述本发明裂殖壶菌菌体残渣的利用方法；但需要说明的是，本发明的实施对象是裂殖壶菌菌体残渣，利用的是裂殖壶菌菌体的蛋白构成属性、将其充当氮源，所以菌株的具体种类并不局限于CN104450809A中所述的具体菌株。
实施例1-4分别提供了本发明技术方案在三角瓶摇床级别上的具体实现步骤。
实施例1
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；
种子培养基组分(g/L)：葡萄糖20.0，酵母粉5.0，牛肉膏3.0，蛋白胨2.0，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO4 1.0，海水晶5.0。
(2)将DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壶菌菌体残渣进行稀释，充当营养物质，剩余菌体残渣稀释的质量浓度为30％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，充当发酵氮源，用于裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的20％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的20％。
发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉1.0，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO4 2.0，NaNO3 5.0，Na2SO4 2.0，质量浓度为30％的裂殖壶菌菌体残渣稀释液20％；
CK(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉5.0，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO4 2.0，NaNO3 5.0，Na2SO4 2.0；
每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；
(3)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以10％的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；
(4)连续培养3天后结束发酵，结束发酵后，对发酵液进行5000g离心，收集湿菌体并置于恒温水浴锅中，在温度为80℃，菌液pH为10条件下，用碱性蛋白酶进行破壁处理，并用磁力搅拌器持续搅拌，处理时间约5小时，直至菌体破壁完全。
(5)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，得到DHA的含量。发酵结果如下所示：
表1菌体残渣再利用组和对照组发酵结果对比
由表1结果可知，与对照组相比，发酵培养基中添加的裂殖壶菌菌体残渣可以很好地替代部分酵母粉，且对发酵结果无任何影响。
实施例2
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；
种子培养基组分(g/L)：葡萄糖30.0，酵母粉7.0，牛肉膏2.0，蛋白胨5.0，MgSO4·7H2O 0.6，KH2PO4 0.6，海水晶10.0。
(2)将DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壶菌菌体残渣进行稀释，充当营养物质，剩余菌体残渣稀释的质量浓度为40％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，充当发酵氮源，用于裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的10％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的40％。
发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉4.0，MgSO4·7H2O 0.6，KH2PO4 1.2，(NH4)2SO4 3.0，NaNO3 3.0，Na2SO4 6.0，质量浓度为40％的裂殖壶菌菌体残渣稀释液10％；
CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉10.0，MgSO4·7H2O 0.6，KH2PO4 1.2，(NH4)2SO43.0，NaNO3 3.0，Na2SO4 6.0；
每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；
(3)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以8％的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；
(4)连续培养3天后结束发酵，结束发酵后，对发酵液进行5000g离心，收集湿菌体并置于恒温水浴锅中，在温度为60℃，菌液pH为5-7条件下，用纤维素酶进行破壁处理，并用磁力搅拌器持续搅拌，处理时间约5小时，直至菌体破壁完全。
(5)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，得到DHA的含量。发酵结果如下所示：
表2菌体残渣再利用组和对照组发酵结果对比
由表2结果可知，裂殖壶菌菌体残渣的添加应用，可以很好地充当发酵有机氮源被裂殖壶菌利用，且对DHA的最终产量基本无影响。
实施例3
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；
种子培养基组分(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉10.0，蛋白胨8.0，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.2，海水晶20.0。
(2)将DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壶菌菌体残渣进行稀释，充当营养物质，剩余菌体残渣稀释的质量浓度为50％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，充当发酵氮源，用于裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的5％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的60％。
发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉9.0，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.5，(NH4)2SO4 5.0，NaNO3 1.0，Na2SO4 10.0，质量浓度为50％的裂殖壶菌菌体残渣稀释液5％；
CK(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉15.0，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.5，(NH4)2SO4 5.0，NaNO3 1.0，Na2SO4 10.0；
每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；
(3)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以10％的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；
(4)连续培养3天后结束发酵，结束发酵后，对发酵液进行5000g离心，收集湿菌体并置于恒温水浴锅中，在温度为50℃，菌液pH为5条件下，用果胶酶进行破壁处理，并用磁力搅拌器持续搅拌，处理时间约5小时，直至菌体破壁完全。
(5)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，得到DHA的含量。发酵结果如下所示：
表3菌体残渣再利用组和对照组发酵结果对比
| 发酵碳源 | 生物量(g/L) | 油脂含量(％) | DHA含量(％) | DHA产量(g/L) |
| 对照组 | 35.4±1.3 | 48.4±1.2 | 38.3±0.9 | 6.56±0.74 |
| 菌体残渣再利用组 | 36.2±0.7 | 48.1±0.9 | 38.5±0.3 | 6.70±0.35 |
由表3结果可知，通过向发酵培养基中添加裂殖壶菌菌体残渣，裂殖壶菌经发酵培养后，与对照组相比，发酵结果基本一致。
实施例4
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；
种子培养基组分(g/L)：葡萄糖35.0，酵母粉8.0，牛肉膏1.5，蛋白胨6.0，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO4 0.8，海水晶15.0。
(2)将DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壶菌菌体残渣进行稀释，充当营养物质，剩余菌体残渣稀释的质量浓度为35％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，充当发酵氮源，用于裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的15％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的50％。
发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖70.0，酵母粉6.0，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO4 1.5，(NH4)2SO4 4.0，NaNO3 2.0，Na2SO4 8.0，质量浓度为35％的裂殖壶菌菌体残渣稀释液15％；
CK(g/L)：葡萄糖70.0，酵母粉12.0，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO4 1.5，(NH4)2SO4 4.0，NaNO3 2.0，Na2SO4 8.0；
每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌25min，冷却备用；
(3)在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以10％的接种量接入发酵培养基，26℃恒温培养3天，转速200rpm；
(4)连续培养3天后结束发酵，结束发酵后，对发酵液进行5000g离心，收集湿菌体并置于恒温水浴锅中，在温度为65℃，菌液pH为8条件下，用碱性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的混合酶系进行破壁处理，并用磁力搅拌器持续搅拌，处理时间约5小时，直至菌体破壁完全。
(5)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，得到DHA的含量。发酵结果如下所示：
表4菌体残渣再利用组和对照组发酵结果对比
| 发酵碳源 | 生物量(g/L) | 油脂含量(％) | DHA含量(％) | DHA产量(g/L) |
| 对照组 | 32.1±0.4 | 47.6±0.9 | 37.8±0.1 | 5.78±0.28 |
| 菌体残渣再利用组 | 33.4±0.7 | 48.1±1.2 | 36.9±0.6 | 5.93±0.67 |
由表4结果可知，与对照组相比，裂殖壶菌菌体残渣可以很好地被裂殖壶菌再利用，且最终DHA产量未受影响。
实施例5-6分别提供了本发明技术方案在100L中试培养级别上的具体实现步骤。
实施例5
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；
将裂殖壶菌种子液按照10％的接种量，接入种子罐中，在通气量为1.0vvm，搅拌转速为200rpm，培养温度为25℃的条件下，培养24h，即可转接至100L发酵培养基中。
种子培养基组分(g/L)：葡萄糖20.0，酵母粉5.0，牛肉膏3.0，蛋白胨2.0，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO41.0，海水晶5.0。
(2)100L发酵罐中装液量为70％，将DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壶菌菌体残渣进行稀释，充当营养物质，剩余菌体残渣稀释的质量浓度为30％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，充当发酵氮源，用于裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的20％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的20％。
发酵罐接种量为10％，转速200rpm，通气量为1.0-1.5vvm，26℃恒温培养2天。
发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉1.0，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO42.0，NaNO35.0，Na2SO42.0，质量浓度为30％的裂殖壶菌菌体残渣稀释液20％；
CK(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉5.0，MgSO4·7H2O 0.2，KH2PO42.0，NaNO35.0，Na2SO42.0；
(3)连续培养2天后结束发酵，结束发酵后，对发酵液进行5000g离心，收集湿菌体并置于恒温水浴中，在温度为80℃，菌液pH为10条件下，用碱性蛋白酶进行破壁处理，并用磁力搅拌器持续搅拌，处理时间约5小时，直至菌体破壁完全。
(4)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，得到DHA的含量。发酵结果如下所示：
表5 100L中试罐中菌体残渣再利用组和对照组发酵结果对比
| 发酵碳源 | 生物量(g/L) | 油脂含量(％) | DHA含量(％) | DHA产量(g/L) |
| 对照组 | 28.4±0.6 | 43.2±0.5 | 36.9±0.1 | 4.53±0.23 |
| 菌体残渣再利用组 | 27.9±0.2 | 44.1±0.3 | 36.4±0.7 | 4.48±0.37 |
由表5结果可知，在100L中试发酵罐中，通过对经过酶解处理的裂殖壶菌菌体残渣的再利用，对裂殖壶菌的发酵生长无不良影响。
实施例6
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；
将裂殖壶菌种子液按照10％的接种量，接入种子罐中，在通气量为1.0vvm，搅拌转速为200rpm，培养温度为25℃的条件下，培养24h，即可转接至100L发酵培养基中。
种子培养基组分(g/L)：葡萄糖30.0，酵母粉7.0，牛肉膏2.0，蛋白胨5.0，MgSO4·7H2O 0.6，KH2PO4 0.6，海水晶10.0。
(2)100L发酵罐中装液量为70％，将DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壶菌菌体残渣进行稀释，充当营养物质，剩余菌体残渣稀释的质量浓度为40％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，充当发酵氮源，用于裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的10％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的40％。
发酵罐接种量为10％，转速200rpm，通气量为1.0-1.5vvm，26℃恒温培养2天。
发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉4.0，MgSO4·7H2O 0.6，KH2PO4 1.2，(NH4)2SO4 3.0，NaNO3 3.0，Na2SO4 6.0，质量浓度为40％的裂殖壶菌菌体残渣稀释液10％；
CK(g/L)：葡萄糖60.0，酵母粉10.0，MgSO4·7H2O 0.6，KH2PO4 1.2，(NH4)2SO43.0，NaNO3 3.0，Na2SO4 6.0；
(3)连续培养2天后结束发酵，结束发酵后，对发酵液进行5000g离心，收集湿菌体并置于恒温水浴中，在温度为60℃，菌液pH为5-7条件下，用纤维素酶进行破壁处理，并用磁力搅拌器持续搅拌，处理时间约5小时，直至菌体破壁完全。
(4)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，得到DHA的含量。发酵结果如下所示：
表6 100L中试罐中菌体残渣再利用组和对照组发酵结果对比
| 发酵碳源 | 生物量(g/L) | 油脂含量(％) | DHA含量(％) | DHA产量(g/L) |
| 对照组 | 32.1±0.6 | 42.6±0.4 | 37.2±0.1 | 5.09±0.24 |
| 菌体残渣再利用组 | 31.5±1.3 | 43.8±0.8 | 36.4±0.8 | 5.02±0.43 |
由表6结果可知，在100L中试罐水平，裂殖壶菌菌体残渣的添加应用，依然可以很好地充当发酵有机氮源被裂殖壶菌利用，且对DHA的最终产量基本无影响。
实施例7-8分别提供了本发明技术方案在10吨生产培养级别上的具体实现步骤。
实施例7
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；
将裂殖壶菌种子液按照10％的接种量，依次接入一级、二级种子罐中。其中，一级和二级种子罐培养条件均为：通气量为1.0vvm，搅拌转速为200rpm，培养温度为25℃，培养24h，二级种培养完成后即可转接至10吨发酵罐中。
种子培养基组分(g/L)：葡萄糖40.0，酵母粉10.0，蛋白胨8.0，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.2，海水晶20.0。
(2)10吨发酵罐中装液量为70％，将DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壶菌菌体残渣进行稀释，充当营养物质，剩余菌体残渣稀释的质量浓度为50％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，充当发酵氮源，用于裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的5％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的60％。
发酵罐接种量为10％，转速80rpm，通气量为0.8-1.2vvm，26℃恒温培养2天。
发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉9.0，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.5，(NH4)2SO4 5.0，NaNO3 1.0，Na2SO4 10.0，质量浓度为50％的裂殖壶菌菌体残渣稀释液5％；
CK(g/L)：葡萄糖80.0，酵母粉15.0，MgSO4·7H2O 1.0，KH2PO4 0.5，(NH4)2SO4 5.0，NaNO3 1.0，Na2SO4 10.0；
(3)连续培养2天后结束发酵，结束发酵后，对发酵液进行5000g离心，收集湿菌体并置于恒温水浴中，在温度为50℃，菌液pH为5条件下，用果胶酶进行破壁处理，并用磁力搅拌器持续搅拌，处理时间约5小时，直至菌体破壁完全。
(4)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，得到DHA的含量。发酵结果如下所示：
表7 10吨发酵罐中菌体残渣再利用组和对照组发酵结果对比
由表7结果可知，通过在10吨发酵罐上对经过酶解处理后的裂殖壶菌菌体残渣进行利用，最终发酵结果与对照组无差异，说明该发明可很好地应用于实际生产中。
实施例8
(1)在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基。接入低温冻存的裂殖壶菌种，在培养温度25℃，摇床转速200rpm条件下培养2天，将低温冻存的裂殖壶菌种活化成裂殖壶菌种子液；
将裂殖壶菌种子液按照10％的接种量，依次接入一级、二级种子罐中。其中，一级和二级种子罐培养条件均为：通气量为1.0vvm，搅拌转速为200rpm，培养温度为25℃，培养24h，二级种培养完成后即可转接至10吨发酵罐中。
种子培养基组分(g/L)：葡萄糖35.0，酵母粉8.0，牛肉膏1.5，蛋白胨6.0，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO4 0.8，海水晶15.0。
(2)10吨发酵罐中装液量为70％，将DHA油脂提取完成后剩下的裂殖壶菌菌体残渣进行稀释，充当营养物质，剩余菌体残渣稀释的质量浓度为35％，并直接添加至下一批用于培养裂殖壶菌的发酵培养基中，充当发酵氮源，用于裂殖壶菌发酵培养基中，且添加量为发酵液体积的15％。同时，发酵培养基中原先的发酵氮源酵母粉浓度降至先前浓度的50％。
发酵罐接种量为10％，转速80rpm，通气量为0.8-1.2vvm，26℃恒温培养2天。
发酵培养基组分(g/L)：葡萄糖70.0，酵母粉6.0，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO4 1.5，(NH4)2SO4 4.0，NaNO3 2.0，Na2SO4 8.0，质量浓度为35％的裂殖壶菌菌体残渣稀释液15％；
CK(g/L)：葡萄糖70.0，酵母粉12.0，MgSO4·7H2O 0.8，KH2PO4 1.5，(NH4)2SO4 4.0，NaNO3 2.0，Na2SO4 8.0；
(3)连续培养2天后结束发酵，结束发酵后，对发酵液进行5000g离心，收集湿菌体并置于恒温水浴中，在温度为65℃，菌液pH为8条件下，用碱性蛋白酶、纤维素酶和果胶酶的混合酶系进行破壁处理，并用磁力搅拌器持续搅拌，处理时间约5小时，直至菌体破壁完全。
(4)对破壁处理后的裂殖壶菌菌体进行DHA油脂的提取，提取DHA油脂的方法可以是三相分离技术，得到富含二十二碳六烯酸的油脂进行甲酯化后的气相检测分析，得到DHA的含量。发酵结果如下所示：
表8 10吨发酵罐中菌体残渣再利用组和对照组发酵结果对比
| 发酵碳源 | 生物量(g/L) | 油脂含量(％) | DHA含量(％) | DHA产量(g/L) |
| 对照组 | 34.4±0.2 | 45.6±0.7 | 37.3±0.9 | 5.85±0.29 |
| 菌体残渣再利用组 | 35.3±0.8 | 45.3±1.0 | 36.8±0.4 | 5.88±0.72 |
由表8结果可知，在10吨规模的发酵罐中，与对照组相比，裂殖壶菌菌体残渣可以很好地被裂殖壶菌再利用，且最终DHA产量未受影响。本发明真正意义上实现了裂殖壶菌菌体残渣的再利用，并节约了发酵成本，利于环境保护。
综上所述，本发明通过对酶法处理后的裂殖壶菌菌体残渣进行再利用，将其充当发酵培养基中的部分发酵氮源，并替换部分酵母粉，可以很好地用于裂殖壶菌的发酵培养，且对DHA的最终产量没有影响，从而很好地实现了菌体残渣的再利用，也节约了发酵成本，该发明也体现了可持性发展的理念，对环境的保护起到促进作用。
本发明能够充分利用裂殖壶菌菌体残渣中的多种营养物质，尽可能实现裂殖壶菌菌体残渣应用的高附加值。本发明通过对经过酶法破壁处理并经三相分离技术提取油脂后的菌体进行再利用，将其直接应用到裂殖壶菌发酵培养基中，充当部分发酵氮源，用于裂殖壶菌的发酵培养。在本发明中，裂殖壶菌为球状真菌，生长速度快，发酵周期短。裂殖壶菌在被应用于充当发酵氮源的处理过程及工艺极为简单，仅需要经过酶解破壁，再利用三相分离技术提取出DHA油脂后，剩余的裂殖壶菌菌体残渣即可直接用于发酵培养基中。本发明方法适用于各种裂殖壶菌的菌体残渣，如已公开专利CN104450809A中所述菌种，等等，本发明具有广泛的应用前景和实用价值。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (10)
1.一种裂殖壶菌菌体残渣作为裂殖壶菌发酵培养基组成成分的用途。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述组成成分具体指氮源成分。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于，所述裂殖壶菌菌体残渣具体为DHA油脂经提取后产生的裂殖壶菌残留物。
4.一种含有裂殖壶菌菌体残渣的裂殖壶菌发酵培养基，其特征在于，含裂殖壶菌菌体残渣液的体积浓度为5-20％；其中，所述裂殖壶菌菌体残渣液中裂殖壶菌菌体残渣的质量浓度为30-50％。
5.根据权利要求4所述的含有裂殖壶菌菌体残渣的裂殖壶菌发酵培养基，其特征在于，所述裂殖壶菌菌体残渣中的水的质量含量为50-70％。
6.根据权利要求4所述的含有裂殖壶菌菌体残渣的裂殖壶菌发酵培养基，其特征在于，所述裂殖壶菌发酵培养基的组分包括：葡萄糖40.0-80.0g/L，酵母粉x g/L，MgSO4·7H2O0.2-1.0g/L，KH2PO4 0.5-2.0g/L，(NH4)2SO4 0-5.0g/L，NaNO3 1.0-5.0g/L，Na2SO42.0-10.0g/L，裂殖壶菌菌体残渣液在培养基中所占的体积百分数为5-20％；
其中，x＝(5.0-15.0)*(20-60)％。
7.一种用权利要求4至6任一项所述的裂殖壶菌发酵培养基进行裂殖壶菌发酵的方法，其特征在于，将裂殖壶菌的种子液接种于所述发酵培养基中，发酵培养，即可。
8.根据权利要求7所述的裂殖壶菌发酵培养基进行裂殖壶菌发酵的方法，其特征在于，所述种子液的接种量为所述发酵培养基体积的5-10％。
9.根据权利要求8所述的裂殖壶菌发酵培养基进行裂殖壶菌发酵的方法，其特征在于，所述种子液的接种量为所述发酵培养基体积的8％。
10.根据权利要求7所述的裂殖壶菌发酵培养基进行裂殖壶菌发酵的方法，其特征在于，所述种子液是将裂殖壶菌接种于种子培养基中培养所得；
其中，所述种子培养基包括组分如下：葡萄糖20.0-40.0g/L，酵母粉5.0-10.0g/L，牛肉膏0-3.0g/L，蛋白胨2-8.0g/L，MgSO4·7H2O 0.2-1.0g/L，KH2PO4 0.2-1.0g/L，海水晶5.0-20.0g/L。
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Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN108559615A (zh) * | 2018-05-04 | 2018-09-21 | 南京工业大学 | 一种dha发酵的废水/藻渣综合利用的方法 |
| CN111378699A (zh) * | 2019-12-31 | 2020-07-07 | 嘉必优生物技术（武汉）股份有限公司 | 一种裂殖壶菌发酵产dha的方法 |
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| CN103740775A (zh) * | 2013-06-05 | 2014-04-23 | 湖北欣和生物科技有限公司 | 循环利用裂殖壶菌发酵清液生产dha油脂的方法 |
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