CN103740776A - 一种裂殖壶菌发酵培养基 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种裂殖壶菌发酵培养基。通过改良发酵培养基配方，将培养基中的海水晶由其他不含氯的无机盐替代，不仅避免氯离子对发酵设备造成严重腐蚀，且有利于DHA积累。

Description

一种裂殖壶菌发酵培养基
技术领域
本发明涉及微生物发酵领域，具体涉及一种裂殖壶菌发酵培养基。
背景技术
裂殖壶菌(Schizochytrium limacimum)主要从海洋环境中获得，为满足其合适生长条件及大量合成DHA油脂的需求，实现裂殖壶菌大规模发酵生产，选择廉价的海水晶或海水作为培养基组分。授权公告号CN 101519676B的专利公开了发酵培养基的组分，海水晶的量0.8-1.5g/100ml；授权公告号CN 1264967C的专利公开了裂殖壶菌OUC88的培养基组分，含有20-80%的海水；海水晶或者海水作为发酵培养基组分之一，其含氯离子无机盐的浓度一般为5.0-25.0g/L，远高于一般发酵罐材质可以耐受的浓度（其中T304不锈钢，其耐受氯离子浓度＜0.2g/L；T316不锈钢，其耐受氯离子浓度＜1.0g/L），设备长期运行过程中腐蚀较严重，缩短了设备使用寿命，因而要求发酵罐及其管道的材质质量高，从而增加了发酵过程中固定资产投入及折旧费用。因此，如何进一步优化裂殖壶菌发酵培养基组分，降低生产成本，节约资源，是裂殖壶菌发酵生产DHA工业应用亟待解决的问题。
发明内容
为了克服以上问题，本发明提供了一种用于生产富含DHA油脂的裂殖壶菌发酵培养基制备方法，所采用的技术方案是：
（1）摇瓶种子培养：向摇瓶种子培养基中接入裂殖壶菌，接种量为1-10%（V/V），在摇床转速180rpm、培养温度25.0℃的条件下进行摇瓶培养；
（2）种子扩大培养：将（1）中摇瓶培养48小时的种子液接入5-50L种子培养罐中，接种量为4%（V/V），在转速180rpm，通气比1.2vvm，培养温度25.0℃的条件下进行种子扩大培养；
（3）发酵罐放大培养：将（2）中种子扩大培养罐培养48小时的种子液接入100-1000L发酵生产罐中进行培养，发酵培养基组分：葡萄糖100.0g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO30-8.0g/L，Na2SO45.0-12.0g/L；或者发酵培养基组分：葡萄糖100.0g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，K2SO42.0-5.0g/L，Na2SO45.0-12.0g/L，KNO30-5.0g/L，NaNO34.0-12.0g/L，(NH4)2SO40-3.0g/L，接种量为4%（V/V），通气比0.5-1.5vvm，通过控制搅拌转速调节溶氧水平，其中，发酵1-3天控制溶氧值15-25%，发酵4-7天控制溶氧值5-20%，从发酵第3天开始流加500.0g/L的葡萄糖溶液，控制发酵罐中葡萄糖浓度维持在20.0g/L，发酵6-8天后，离心或过滤收集湿菌体；在培养基替换前，裂殖壶菌适合的钠离子浓度在0.07-0.26mol/L的范围内，总电导率在20.00-43.00ms/cm的范围内，替换培养基中的无机盐浓度根据以上参数进行换算。
（4）菌体油脂的提取：将（3）中收集的湿菌体在50-80℃下进行干燥，经粉碎机粉碎后，采用正己烷萃取，回收正己烷，得富含DHA的油脂，气相色谱分析油脂组分。
本发明的优点在于发酵培养基组分中的海水晶完全被其他无机盐替代，克服了海水晶中氯离子对设备的腐蚀，显著降低了发酵设备的固定资产投入和运行过程中的折旧成本；无机盐主要包括K2SO4，Na2SO4，KNO3，NaNO3，(NH4)2SO4，经多次试验验证，该优化发酵培养基组分对裂殖壶菌的生长及DHA油脂的合成有一定的促进作用，可能是由于SO4 2-可促进了蛋白质的合成，NO3 -和NH4 -有利于遗传物质的合成，从而促进了菌体的生长。
以上用于生产富含DHA油脂的裂殖壶菌发酵培养基，通过满足发酵培养基组分中钠离子浓度或总的电导率，可实现更大规模的发酵生产。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
（1）在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基（葡萄糖50.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，蛋白胨3.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42.0g/L），接种量4%，在培养温度25℃，摇床转速180rpm条件下培养2天；
（2）在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以4%的接种量接入发酵培养基；
发酵培养基组分：
Ⅰ.葡萄糖100.0g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO34.0g/L，Na2SO412.0g/L；
Ⅱ.葡萄糖100.0g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO312.0g/L，Na2SO45.0g/L；
Ⅲ.葡萄糖100.0g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO39.0g/L，Na2SO48.0g/L；
CK：葡萄糖100.0g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO34.0g/L，海水晶10.0g/L，其他培养条件同上；
（3）培养基初始pH为6.0，摇床转速180rpm，在26℃的条件下培养7天。培养结束后，6000g离心10min将菌体与发酵液分离，80℃高温干燥6h后，测其生物量及DHA产量；
发酵结果如表1所示。
表1.NaNO3和Na2SO4对DHA油脂合成的影响
培养基成分 生物量（g/L） DHA产量（g/L）
Ⅰ 35.8±0.15 5.31±0.05
Ⅱ 39.2±0.23 5.72±0.07
Ⅲ 38.5±0.10 5.17±0.04
CK 33.4±0.16 4.85±0.05
将发酵培养基组分中的海水晶用NaNO3和Na2SO4替换，不仅促进了裂殖壶菌的生长，同时促进了DHA的积累。
实施例2
（1）在250mL三角瓶中加入50mL种子培养基（葡萄糖50.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，蛋白胨3.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42.0g/L），接种量4%，在培养温度25℃，摇床转速180rpm条件下培养2天；
（2）在250mL三角瓶中加入50mL发酵培养基，将裂殖壶菌以4%的接种量接入发酵培养基；
发酵培养基组分：
Ⅰ.葡萄糖100.0g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO37.0g/L，K2SO42.0g/L，Na2SO48.0g/L，KNO33.0g/L；电导率27.22ms；
Ⅱ.葡萄糖100.0g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO36.0g/L，K2SO43.0g/L，Na2SO45.0g/L，(NH4)2SO41.0g/L；电导率27.47ms；
Ⅲ.葡萄糖100g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO34.0g/L，K2SO45.0g/L，Na2SO412.0g/L，KNO35.0g/L，(NH4)2SO43.0g/L；电导率28.53ms；
CK.葡萄糖100g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO34.0g/L，海水晶10.0g/L，电导率为26.50ms；
每种不同的培养基配制3个平行样，121℃，灭菌30min，冷却备用；
（3）每瓶接入2mL培养好的种子液，在26℃，180rpm条件下培养6天，6000g离心10min收集菌体，80℃高温干燥6h后，测其生物量及DHA产量；发酵结果如表2所示。
表2不同无机盐对菌体生长和DHA油脂合成的影响
培养基成分 生物量（g/L） DHA产量（g/L）
Ⅰ 36.7±0.13 5.24±0.07
Ⅱ 35.9±0.21 5.18±0.03
Ⅲ 38.2±0.22 5.35±0.06
CK 32.5±0.19 4.79±0.05
结果显示，裂殖壶菌是嗜盐菌，必须在有一定的盐离子存在下才得以更好地生长，用其他无机盐替换海水晶，对菌体生长和DHA合成有一定的促进作用。
实施例3
（1）配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，蛋白胨3.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42.0g/L；初始pH值为6.0，121℃，灭菌30min，冷却备用；
（2）配制发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO312.0g/L，Na2SO45.0g/L；初始pH值为6.0，121℃，灭菌30min，冷却备用；
（3）取10mL-20℃冰箱冻存的裂殖壶菌菌种甘油管，接种至含有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以180rpm转速培养48小时，再取120mL培养液按4%接种量接入装有3L种子培养基的5L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速180rpm，通气比1.2vvm的条件下，培养48小时；
（4）将2.4L二级种子液接入含80L如上所述发酵培养液的100L发酵罐中。维持发酵温度25℃，前3天控制溶氧值维持在20%左右，发酵第3天开始补加500.0g/L的葡萄糖溶液，使得发酵罐内葡萄糖浓度维持在20.0g/L之间，并通过调节转速控制溶氧值维持在10%左右，至发酵第6天停止流加。第7天结束发酵，6000g离心10min收集菌体，菌体干燥、粉碎破壁与油脂提取后取样检测，此时菌体干重达53.8g/L，DHA产量8.21g/L。
实施例4
（1）配制种子培养基：葡萄糖50.0g/L，酵母抽提物5.0g/L，蛋白胨3.0g/L，MgSO42.0g/L，KH2PO42.0g/L；初始pH值为6.0，121℃，灭菌30min，冷却备用；
（2）配制发酵培养基：葡萄糖100g/L，酵母抽提物15.0g/L，MgSO41.0g/L，KH2PO43.0g/L，NaNO34.0g/L，K2SO45.0g/L，Na2SO412.0g/L，KNO35.0g/L，(NH4)2SO43.0g/L；初始pH值为6.0，121℃，灭菌30min，冷却备用；
（3）取10mL-20℃冰箱冻存的裂殖壶菌菌种甘油管，接种至含有200mL上述种子培养基的500mL三角瓶中，在25℃的摇床中以180rpm转速培养48小时，再取120mL培养液按4%接种量接入装有3L种子培养基的5L发酵罐中，在培养温度25℃，搅拌转速180rpm，通气比1.2vvm的条件下，培养48小时；
（4）将2.4L二级种子液接入含60L如上所述种子培养基的100L发酵罐中，在25℃培养条件下，控制溶解氧浓度维持在20%，培养48小时；
（5）将25L三级种子液接入含750L如上述发酵培养的1000L发酵罐中，维持发酵温度25℃，前3天控制溶氧值维持在25%左右，发酵第3天开始补加500.0g/L的葡萄糖溶液，使得发酵罐内葡萄糖浓度维持在20.0g/L之间，并通过调节转速控制溶氧值维持在15%左右，至发酵第6天停止流加。第8天结束发酵，6000g离心10min收集菌体，菌体干燥、粉碎破壁与油脂提取后取样检测，此时菌体干重达50.7g/L，DHA产量7.52g/L。

Claims (3)

1.一种裂殖壶菌发酵培养基，其特征在于，用不含氯的其他无机盐组合物替代海水晶，发酵培养基组分中的钠离子浓度相等或者总电导率相等。
2.如权利要求1所述培养基，其特征在于，用于替代海水晶的无机盐组合物为NaNO30-8.0g/L、Na2SO45.0-12.0g/L。
3.如权利要求1所述培养基，其特征在于，用于替代海水晶的无机盐组合物为K2SO42.0-5.0g/L、Na2SO45.0-12.0g/L、KNO30-5.0g/L、NaNO30-8.0g/L、(NH4)2SO40-3.0g/L。
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