CN103068965A - 在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。

Description

在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和其组合物、制备方法及用途

涉及以电子方式提交的序列表

将与本申请一起提交的以电子方式提交的序列表(“sequencelisting_ascii.txt”，77,186字节，2010年12月23日创建)的内容通过述及整体并入本文。

相关申请的交叉引用

本申请主张2009年12月28日提交的美国申请案第61/290,443号的申请日的权利，此处将其以整体引用的方式并入本文。

发明背景

技术领域

本申请涉及在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。

背景技术

脂肪酸基于碳链长度和饱和特性分类。根据存在于链中的碳的数目将脂肪酸称为短链、中链或长链脂肪酸，当碳原子间不存在双键时称为饱和脂肪酸，而当存在双键时称为不饱和脂肪酸。当仅存在一个双键时不饱和长链脂肪酸是单不饱和的，而当存在多于一个双键时是多不饱和的。

多不饱和脂肪酸(PUFA)基于所述脂肪酸甲基末端的第一个双键的位置分类：Ω-3(n-3)脂肪酸在第三个碳处包含第一个双键，而Ω-6(n-6)脂肪酸在第六个碳处包含第一个双键。例如，二十二碳六烯酸(“DHA”)是Ω-3长链多不饱和脂肪酸(LC-PUFA)，具有22个碳的链长和6个双键，通常标为“22:6n-3”。其他Ω-3LC-PUFA包括标为“20:5n-3”的二十碳五烯酸(“EPA”)和标为“22:5n-3”的Ω-3二十二碳五烯酸(“DPA n-3”)。DHA和EPA已被称为“必需”脂肪酸。Ω-6LC-PUFA包括标为“20:4n-6”的花生四烯酸(“ARA”)和标为“22:5n-6”的Ω-6二十二碳五烯酸(“DPA n-6”)。

Ω-3脂肪酸是生物学上重要的分子，由于其存在于细胞膜而影响细胞生理学，调节生物活性化合物的生成和基因表达，且充当生物合成底物。Roche，H.M.，Proc.Nutr.Soc.58：397-401(1999)。例如，DHA占人大脑皮层中脂质的约15%-20%、并占视网膜中脂质的约30%-60%，其集中于睾丸和精子中，且是乳汁中的重要成分。Jean-Pascal Bergé和Gilles Barnathan，“来自海洋生物脂质的脂肪酸：分子生物多样性，作为生物标记的作用，生物活性化合物和经济方面”(Fatty Acids from Lipids of Marine Organisms：MolecularBiodiversity，Roles as Biomarkers，Biologically Active Compounds，andEconomical Aspects)，《海洋生物技术》(Marine Biotechnology)I 49(T.Scheper编，2005)。DHA占大脑中Ω-3脂肪酸的多达97%和视网膜中Ω-3脂肪酸的多达93%。此外，DHA对胎儿和婴儿发育以及维持成人中的认知功能是必需的。同上。包括DHA和EPA在内的Ω-3脂肪酸还具有抗炎特性。参见例如同上以及Simopoulos，A.P.，J.Am.Coll.Nutr.21：495-595(2002)。特别的是，EPA与花生四烯酸竞争通过环氧合酶和脂氧合酶进行的二十烷类如前列腺素和白三烯的合成。同上。由于Ω-3脂肪酸不在人体内从头合成，这些脂肪酸必须获得自营养源。

破囊壶菌(thraustochytrids)是破囊壶菌目(Thraustochytriales)微生物，其被认为是脂质生产的替代来源。例如，已经报道了破囊壶菌菌种的菌株以占该生物体所产生总脂肪酸的高百分比生成Ω-3脂肪酸。参见例如美国专利第5,130,242号；Huang，J.等，J.Am.Oil.Chem.Soc.78：605-610(2001)；和Huang，J.等，Mar.Biotechnol.5：450-457(2003)，以整体引用的方式并入本文。破囊壶菌还被认为是生产生物燃料的脂质来源。参见例如美国公开第2009/0064567号和WO 2008/067605，以整体引用的方式并入本文。

虽然破囊壶菌代谢葡萄糖和/或果糖，它们是蔗糖的两个糖成分，但是其似乎无法天然代谢蔗糖。参见，例如，Aki等，JAOCS 80:789-794(2003)；Yokochi等，Appl.Microbiol.Biotechnol.49:72-76(1998)；Honda等，Mycol.Res.4:439-448(1998)；Singh,World J.of Microbiology 12:76-81(1996)；Goldstein,American J.of Botany 50:271-279(1963)；和美国专利第5,340,742号。由此，破囊壶菌培养，包括商业和工业培养，目前需要葡萄糖浆作为碳源和能源，而不是更廉价的含有蔗糖的碳水化合物来源。

对于产生能够在替代碳源如蔗糖上生长的破囊壶菌以在商业和工业应用中使用的需求一直存在。

发明概述

本发明涉及一种生产破囊壶菌细胞培养物的方法，包括：(a)以包含编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，并(b)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，蔗糖酶是转化酶。在一些实施方案中，蔗糖酶可操作地与信号肽连接。在一些实施方案中，编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属(Schizochytrium)中表达；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述方法进一步包括以包含编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；和经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属(Thraustochytrium)的。在一些实施方案中，本发明涉及通过所述方法生产的破囊壶菌细胞培养物。

本发明也涉及包含含有编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，蔗糖酶是转化酶。在一些实施方案中，蔗糖酶可操作地与信号肽连接。在一些实施方案中，编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的多核苷酸序列。在一些实施方案中，所述细胞进一步包含编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；和经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属的。

本发明也涉及一种破囊壶菌培养物，其包含：(a)本文所述的任何一种破囊壶菌细胞，和(b)包含蔗糖作为碳源的细胞培养基。

本发明也涉及一种生产破囊壶菌生物质的方法，该方法包括：(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养，并(b)从所述培养基收获生物质。

本发明也涉及一种生产微生物油的方法，该方法包括：(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养以生成生物质，并(b)从所述生物质提取油。

本发明也涉及一种生产用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物的方法，该方法包括：(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养，(b)从所述培养基收获生物质，并(c)从所述生物质制备食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。在一些实施方案中，所述方法进一步包括从生物质提取油并从所述油制备食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。在一些实施方案中，所述食品是婴儿配方食品。在一些实施方案中，所述婴儿配方食品适合早产儿。在一些实施方案中，所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养饮品或其组合。在一些实施方案中，所述食品是用于动物或人食物的添加剂。在一些实施方案中，所述食品是营养补充剂。在一些实施方案中，所述食品是动物饲料。在一些实施方案中，所述动物饲料是水产养殖饲料。在一些实施方案中，所述动物饲料是家畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、牲畜饲料或其组合。

本发明也涉及一种生产生物燃料的方法，该方法包括：(a)将本文所述的任何一种破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养以生成生物质，(b)从所述生物质提取油，并(c)通过对油进行酯交换(transesterifying)，裂化油，经由热解聚加工油，将油加入石油精炼过程，或其组合生产生物燃料。在一些实施方案中，通过对油进行酯交换生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是生物柴油。在一些实施方案中，通过裂化油生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是喷气生物燃料。在一些实施方案中，通过经由热解聚加工油生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是可再生柴油。在一些实施方案中，通过将油加入石油精炼过程生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是共处理的可再生柴油(co-processed renewable diesel)。

附图简述

图1显示了裂殖壶菌属的密码子选择表。

图2显示了pSchiz-EPCT(+)-s1Suc2_CL0076的质粒图谱，也称为pCL0076(SEQ ID NO:2)。

图3显示了来自在蔗糖-SSFM上生长的用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888的培养物的细胞沉淀的干重(g/L)。将转化体称为1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24和4-31。“对照”是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞。

图4显示了来自在蔗糖-SSFM上生长的用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888的培养物的细胞沉淀中的脂肪含量(以占干生物质的重量%表示)。将转化体称为1-1、1-3、1-24、3-1、3-2、3-5、3-21、4-1、4-24和4-31。“对照”是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC20888细胞。

图5显示了在蔗糖-SSFM上生长的用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888的培养物随着时间(天)测量的细胞沉淀的干重(g/L)。将转化体称为1-3和3-5。“对照”是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞。

图6显示了来自在蔗糖-SSFM上生长的两种转化体的培养物的细胞沉淀中的脂肪含量(以占干生物质的重量%表示)。将转化体称为1-3和3-5。“对照”是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞。

图7显示了来自用pCL0076转化并在蔗糖-SSFM上生长2天或7天后收获的裂殖壶菌属菌株B76-32的培养物的细胞沉淀的干重(g/L)。2118*是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞的亚分离株。B76-32**是指在葡萄糖-SSFM上生长的B76-32亲本株。

图8显示了来自用pCL0076转化并在蔗糖-SSFM上生长2天或7天后收获的裂殖壶菌属菌株B76-32的培养物的细胞沉淀的脂肪含量。每个样品的最右边的一列显示以占干生物质的重量%表示的脂肪含量。每个样品的最左边的一列显示由酰基和18个或更少的碳(浅灰色)或20个或更多的碳(中度灰色)组成的总脂肪的%。2118*是指在葡萄糖-SSFM上生长的野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞的亚分离株。B76-32**是指在葡萄糖-SSFM上生长的B76-32亲本株。

图9A显示了转化酶蛋白的Western印迹，而图9B显示了相应的考马斯染色的SDS-PAGE凝胶。如Western印迹顶部所示，酿酒酵母(S.cerevisiae)转化酶对照和pCL0076转化体1-3的3天培养物的上清分别以5μg、2.5μg、1.25μg、和0.625μg的量上样。

图10A显示了由作为蔗糖浓度的函数的反应速率说明的转化酶活性测定。图10B显示了用于计算K_m和V_max的标准Lineweaver-Burk图。

图11显示了在裂殖壶菌属分泌蛋白上检出的N-聚糖结构，如通过全甲基化的N-聚糖的NSI-总离子映射(NSI-total ion mapping)所测定的。

图12显示了通过全甲基化N-聚糖的NSI-总离子映射获得的聚糖种类表。

图13显示了pCL0120(SEQ ID NO:5)的质粒图谱。

图14显示了密码子优化的核酸序列(SEQ ID NO:4)，其编码融合的来自裂殖壶菌属的SEC1信号肽与来自黑曲霉(Aspergillus niger)的成熟Suc1转化酶(GenBank登录号S33920)。

图15显示了pCL0137_EPCT(+)-s1Suc1的质粒图谱，也称为pCL0137。

发明详述

本发明涉及在蔗糖上生长的重组破囊壶菌和包含所述重组破囊壶菌的细胞培养物，以及使用所述重组破囊壶菌生产细胞培养物、生物质、微生物油、组合物和生物燃料的方法。

破囊壶菌

根据本发明，术语“破囊壶菌”是指破囊壶菌目(Thraustochytriales)的任何成员，其包括破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)。破囊壶菌当前的分类学地位可以简述如下：

界：管毛生物界(Stramenopila)(Chromista)

门：网粘菌(Labyrinthulomycota)(不等毛门(Heterokonta))

纲：网粘菌纲(Labyrinthulomycetes)(Labyrinthulae)

目：网粘菌目(Labyrinthulales)

科：网粘菌科(Labyrinthulaceae)

目：破囊壶菌目(Thraustochytriales)

科：破囊壶菌科(Thraustochytriaceae)

对于本发明的目的而言，作为破囊壶菌描述的菌株包括如下生物体：目：破囊壶菌目；科：破囊壶菌科；属：破囊壶菌属(种：菌种，arudimentale，aureum，benthicola，globosum，kinnei，motivum，multirudimentale，pachydermum，proliferum，roseum，striatum)、吾肯氏壶菌属(Ulkenia)(种：菌种，amoeboidea，kerguelensis，minuta，profunda，radiata，sailens，sarkariana，schizochytrops，visurgensis，yorkensis)、裂殖壶菌属(种：菌种，aggregatum，limnaceum，mangrovei，minutum，octosporum)，Japonochytrium属(种：菌种、marinum)、Aplanochytrium属(种：菌种、haliotidis，kerguelensis，profunda，stocchinoi)、Althornia属(种：菌种、crouchii)、或Elina属(种：菌种、marisalba，sinorifica)。出于本发明的目的，吾肯氏壶菌属中描述的物种将被看作是破囊壶菌属的成员。Aurantiochytrium、Oblongichytrium、Botryochytrium、Parietichytrium和Sicyoidochytrium是本发明包括的额外的属。

破囊壶菌属的菌株包括但不限于，保藏菌株PTA-10212、PTA-10213、PTA-10214、PTA-10215、PTA-9695、PTA-9696、PTA-9697、PTA-9698、PTA-10208、PTA-10209、PTA-10210、PTA-10211、破囊壶菌属菌种(23B)(ATCC 20891)；Thraustochytrium striatum(Schneider)(ATCC 24473)；Thraustochytrium aureum(Goldstein)(ATCC 34304)；Thraustochytrium roseum(Goldstein)(ATCC 28210)；和Japonochytrium属菌种(L1)(ATCC 28207)。裂殖壶菌属包括但不限于Schizochytrium aggregatum、Schizochytriumlimacinum、裂殖壶菌属菌种(S31)(ATCC 20888)、裂殖壶菌属菌种(S8)(ATCC20889)、裂殖壶菌属菌种(LC-RM)(ATCC 18915)、裂殖壶菌属菌种(SR 21)，保藏菌株ATCC 28209和保藏的Schizochytrium limacinum菌株IFO 32693。

在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞是Sicyoidochytrium或破囊壶菌属细胞。在一些实施方案中，破囊壶菌的属选自裂殖壶菌属菌种、Schizochytrium aggregatum、Schizochytrium limacinum、Schizochytriumminutum、破囊壶菌属菌种、Thraustochytrium striatum、Thraustochytriumaureum、Thraustochytrium roseum、Japonochytrium属菌种及其衍生株。

如本发明所使用的，术语“转化”是指能够将核酸分子(即，重组核酸分子)插入本发明的破囊壶菌细胞的任何方法。在微生物体系中，术语“转化”用来描述由于微生物获得外源核酸所致的一种遗传性改变而且基本上与术语“转染”同义。用于将核酸分子引入破囊壶菌细胞的合适的转化技术，包括但不限于粒子轰击、电穿孔、显微注射，脂转染、吸附、感染和原生质体融合。

虽然短语“核酸分子”主要是指物理的核酸分子而短语“核酸序列”或“多核苷酸序列”主要是指核酸分子中的核苷酸序列，但所述短语可以互换使用，尤其是能够编码蛋白的核酸分子、多核苷酸序列、或核酸序列。在一些实施方案中，利用重组DNA技术(例如，聚合酶链反应(PCR)扩增或克隆)或化学合成产生本文所述的分离的核酸分子。根据本发明，“分离的”核酸分子是已自其天然环境移出的核酸分子(即已经过人为操作)，其天然环境是该核酸分子在自然界中存在于其中的基因组或染色体。如此，“分离的”并不一定反映核酸分子已被纯化的程度，但表示该分子不包括该核酸分子在自然界中存在于其中的整个基因组或整个染色体。分离的核酸分子可以包括DNA、RNA(例如mDNA)，或DNA或RNA的衍生物(例如cDNA)。分离的核酸分子包括天然核酸分子及其同源物，包括但不限于，天然的等位基因变体和修饰的核酸分子，其中已经将核苷酸以如下方式插入、删除、取代和/或倒置，该方式使得这样的修饰在所编码的肽或蛋白的序列、功能和/或生物活性上提供期望的效果。

术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及其中单独的组分多肽通过共价或非共价手段连接的多重多肽复合物。术语“多肽”包括两个或更多个氨基酸长度的肽，通常具有超过5，10或20个氨基酸。在一些实施方案中，本文所述的多肽是异源多肽。本文使用的术语“异源”是指多肽(或多核苷酸)序列，例如，其不在本发明的破囊壶菌细胞中天然存在。

裂殖壶菌属天然使用己糖和甘油而非蔗糖作为碳源。检查裂殖壶菌属的基因组数据库没有揭示蔗糖分解代谢的初始步骤所需的基因，这支持了通常的发现，即破囊壶菌代谢葡萄糖和/或果糖，它们是蔗糖的两个糖组分，但天然地不代谢蔗糖。参见，例如，Aki等，JAOCS 80:789-794(2003)；Yokochi等，Appl.Microbiol.Biotechnol.49:72-76(1998)；Honda等,Mycol.Res.4:439-448(1998)；Singh,World J.of Microbiology 12:76-81(1996)；Goldstein,American J.of Botany 50:271-279(1963)；和美国专利第5,340,742号。

本发明涉及用包含编码与蔗糖代谢相关的异源多肽的多核苷酸序列的核酸分子转化的破囊壶菌细胞。在一些实施方案中，所述多肽是异源多肽。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种或多种异源蔗糖酶、异源蔗糖转运蛋白、或其组合的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含核酸分子，所述核酸分子包含编码分泌的蔗糖酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含核酸分子，所述核酸分子包含编码胞质蔗糖酶的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含核酸分子，所述核酸分子包含编码蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种或多种异源蔗糖酶和一种异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种异源胞质转化酶和一种异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种异源分泌性转化酶和一种异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含一种或多种核酸分子，所述核酸分子包含一种或多种编码一种异源胞质转化酶、一种异源分泌性转化酶和一种异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。在一些实施方案中，多核苷酸序列经密码子优化以使在破囊壶菌细胞中的翻译效率最大化。在一些实施方案中，将编码蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合的多核苷酸序列整合到破囊壶菌细胞的基因组中。在一些实施方案中，将编码蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合的多核苷酸序列稳定整合到破囊壶菌细胞的基因组中。蔗糖酶是催化糖苷键的水解以产生两个较小的糖的、称为糖苷水解酶(也称为糖苷酶)的酶家族的一部分。正如本文所述，“蔗糖酶”是催化蔗糖(又称saccharose或食用糖)水解为果糖和葡萄糖的酶。在某些实施方案中，蔗糖酶是转化酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶、果聚糖酶、sacridase、β-果糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、果糖水解酶、蔗糖酶(saccharase)、菊糖酶、蔗糖α-葡糖水解酶、α-D-葡糖苷酶、或其组合。在一些实施方案中，蔗糖酶是来自酿酒酵母的转化酶SUC2；来自发酵单胞菌属(Zymomonas)的转化酶SacC；来自毕赤酵母属(Pichia)的转化酶INV1；来自德巴利酵母属(Debaryomyces)的转化酶INV；来自曲霉属(Aspergillus)的蔗糖酶Suc1；来自其他真菌、原生动物、藻类、植物或真核生物来源的蔗糖酶；或其任何组合。在某些实施方案中，蔗糖酶来自原核生物来源，如棒状杆菌型细菌(coryneform bacteria)或大肠杆菌。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞中表达的蔗糖酶包含不同于在所述蔗糖酶所源自的生物体中表达时的糖基化模式。在一些实施方案中，在破囊壶菌细胞中表达的蔗糖酶是包含高-甘露寡糖的糖蛋白。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞还包含编码糖化纤维素原料(例如甘蔗)所需的酶的多核苷酸序列。参见，例如，美国2009/0064567，其以整体引用的方式并入本文。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞还包含编码果糖激酶、葡糖激酶、己糖激酶、或其组合的多核苷酸序列。

在一些实施方案中，用于在破囊壶菌细胞中产生蔗糖酶、蔗糖转运蛋白、或其组合的表达系统包含源自破囊壶菌序列的调节元件。在一些实施方案中，用于在破囊壶菌细胞中产生蔗糖酶、蔗糖转运蛋白、或其组合的表达系统包含源自非破囊壶菌序列的调节元件，包括源自非破囊壶菌藻类序列的序列。在一些实施方案中，表达系统包含编码蔗糖酶、蔗糖转运蛋白、或其二者的组合的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列与任意启动子序列、任意终止子序列、和/或任意在破囊壶菌细胞中有功能的其他调节序列可操作地连接。在某些实施方案中，表达系统包含编码胞质表达的蔗糖酶和蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。可以使用诱导型或组成型活性的调节序列。调节序列包括但不限于美国申请公开号2010/0233760、美国专利第7,001,772号、和美国专利公开号2006/0275904和2006/0286650(将它们通过提述以其整体并入本文)中描述的裂殖壶菌属调节序列，例如：OrfC启动子，OrfC终止子，EF1短启动子，EF1长启动子，Sec1启动子，60S短启动子，60S长启动子，乙酰乳酸合酶启动子，乙酰乳酸合酶终止子，α-微管蛋白启动子，来自聚酮合酶(PKS)系统的启动子，脂肪酸去饱和酶启动子，肌动蛋白启动子，肌动蛋白终止子，延伸因子1α(ef1α)启动子，ef1α终止子，甘油醛3-磷酸脱氢酶(gapdh)启动子，gapdh终止子，及其组合。

在一些实施方案中，蔗糖酶通过用蔗糖酶基因转化的重组破囊壶菌分泌至发酵培养基中。在一些实施方案中，蔗糖酶是包含信号肽的分泌蛋白。在一些实施方案中，信号肽与外源蔗糖酶天然相关联的(即，信号肽是外源蔗糖酶的天然信号序列)。在一些实施方案中，信号肽不与外源蔗糖酶天然相关联，而是异源信号肽，例如来自网粘菌门微生物的信号肽。在一些实施方案中，信号肽来自破囊壶菌。在一些实施方案中，信号肽来自裂殖壶菌属或破囊壶菌属。在一些实施方案中，信号肽是裂殖壶菌属Sec1信号肽(如SEQID NO:3)。“信号肽”包括全长肽及其功能片段、融合肽、和天然产生的信号肽的同源物。信号肽的同源物与天然存在的信号肽的不同之处在于至少一个或少数几个，但不限于一个或少数几个，氨基酸已被删除(例如蛋白的截短版本，如肽或片段)、插入、倒置、取代和/或衍生化(例如，通过糖基化、磷酸化、乙酰化、酰化(例如，豆蔻酰化和棕榈酰化)、异戊烯化、酰胺化、和/或加入糖基磷脂酰肌醇)。在一些实施方案中，信号肽的同源物至少在破囊壶菌中保留作为信号肽的活性，虽然活性可以是提高的、降低的、或使其依赖于某些刺激。在一些实施方案中，信号肽序列包括但不限于，美国申请公开号2010/0233760中描述的裂殖壶菌属序列，如：Na/Pi转运蛋白信号肽，缩短的Na/Pi转运蛋白信号肽，α-1,6-甘露糖基转移酶(ALG12)信号肽，结合免疫球蛋白(BiP)信号肽，α-1,3-葡糖苷酶(GLS2)信号肽，α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样信号肽，α-1,3-1,6-甘露糖苷酶样#1信号肽，α-1,2-甘露糖苷酶样信号肽，β-木糖苷酶样信号肽，胡萝卜素合酶信号肽，和Sec1信号肽。

在一些实施方案中，蔗糖酶与蔗糖转运蛋白一起进行胞质表达。在一些实施方案中，蔗糖酶是膜结合的，例如，蔗糖酶-异麦芽糖酶，其具有N-端跨膜结构域(信号锚)。在某些实施方案中，蔗糖酶定位到质膜的外部。在一些实施方案中，蔗糖酶融合到跨膜结构域。

在一些实施方案中，使用表达盒在破囊壶菌细胞中表达蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合。表达盒的设计和构建使用本领域熟练技术人员已知的标准分子生物学技术。参见，例如，Sambrook等，2001,Molecular Cloning:ALaboratory Manual,第三版。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包含含有遗传元件的表达盒，所述遗传元件例如以使它们在破囊壶菌细胞中具有功能的方式可操作连接的至少下述元件：启动子；包含蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合的编码区；和终止子区。在一些实施方案中，表达盒进一步包含编码信号肽或与蔗糖酶或蔗糖转运蛋白可操作连接的膜结构域的多核苷酸序列。本文所述的术语“膜结构域”是指使多肽靶向膜和/或允许多肽保持与膜相关联的多肽内的任何结构域，而且包括但不限于，跨膜结构域(例如单次或多次跨膜区)、完整单境域(integral monotopic domain)、信号锚定序列、ER信号序列、N-端或内部或C-端终止转移信号、糖基磷脂酰肌醇锚，及其组合。膜结构域可以位于多肽中的任何位置，包括N-端、C-端或多肽的中间。膜结构域可以与永久或暂时将多肽附着于膜相关。在一些实施方案中，重组载体包含表达盒。重组载体包括但不限于，质粒、噬菌体和病毒。在一些实施方案中，重组载体是线性化载体。在一些实施方案中，重组载体是表达载体。本文所用的短语“表达载体”是指适于生产编码产物(例如，蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合)的载体。在一些实施方案中，将编码蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合的多核苷酸序列插入到重组载体以产生重组核酸分子。在一些实施方案中，将编码蔗糖酶、蔗糖转运蛋白或其组合的多核苷酸序列以将核酸序列与载体中的调节序列可操作地连接的方式插入载体，其使得所述核酸序列在重组微生物中能够转录和翻译。在一些实施方案中，选择标记使得能够选择已将本发明的重组核酸分子成功引入的重组微生物。选择标记包括但不限于美国申请公开号2010/0233760和美国专利第7001772号中描述的选择标记，如裂殖壶菌属乙酰乳酸合酶或细菌ble。在一些实施方案中，选择标记是营养缺陷型标记、显性选择标记(如，例如，降解抗生素活性的酶)，或转化选择中涉及的另一种蛋白。

在一些实施方案中，遗传修饰破囊壶菌细胞以引入或删除涉及与转运和/或合成碳水化合物相关的生物合成途径的基因，包括涉及糖基化的那些。例如，可以通过缺失内源糖基化基因和/或插入人或动物的糖基化基因以允许更接近地模仿人的糖基化模式来修饰破囊壶菌细胞。酵母中的糖基化修饰示例于，例如，美国专利第7,029,872号和美国申请公开号2004/0171826，2004/0230042，2006/0257399，2006/0029604和2006/0040353。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞包括其中使用RNA病毒元件来增加或调节基因表达的细胞。

在一些实施方案中，本发明的任何方法的多核苷酸序列编码异源多肽，所述异源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与同蔗糖代谢相关的多肽的氨基酸序列是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或是完全相同的，所述同蔗糖代谢相关的多肽包括但不限于，与蔗糖酶或蔗糖转运蛋白相关的多肽(如，例如，转化酶、蔗糖酶-异麦芽糖酶、果聚糖酶、sacridase、β-果糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、果糖水解酶、saccharase、菊糖酶、蔗糖α-葡糖水解酶、α-D-葡糖苷酶)。在一些实施方案中，本发明的任何方法的多核苷酸序列编码异源多肽，所述异源多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与下述是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或是完全相同的：来自酿酒酵母的转化酶SUC2；来自发酵单胞菌属的转化酶SacC；来自毕赤酵母属的转化酶INV1；来自德巴利酵母属的转化酶INV；来自曲霉属的蔗糖酶Suc1；来自其他真菌、原生动物、藻类、植物或真核生物来源的蔗糖酶；或来自原核生物来源，如棒状杆菌型细菌或大肠杆菌的蔗糖酶。在一些实施方案中，本发明的任何方法的核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与下述多肽是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或是完全相同的：由登录号L47346或X69165编码的氨基酸序列；或登录号P00724或S33920的氨基酸序列。在一些实施方案中，本发明的任何方法的核苷酸序列编码多肽，所述多肽包含氨基酸序列，所述氨基酸序列与由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4编码的氨基酸序列是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或完全相同的。在一些实施方案中，本发明的任何方法的核苷酸序列与下述是至少90%，至少91%，至少92%，至少93%，至少94%，至少95%，至少96%，至少97%，至少98%，至少99%相同的或是完全相同的：登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达；或SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的多核苷酸序列。

破囊壶菌培养物、生物质和微生物油

本发明也涉及包含如本文所述的本发明任何破囊壶菌细胞和包含蔗糖作为碳源的细胞培养基的破囊壶菌细胞培养物。

本发明也涉及生产破囊壶菌细胞培养物的方法，包括用包含编码如本文所述的与蔗糖代谢相关的多肽的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，选择转化的破囊壶菌细胞，并在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞，其中生产出破囊壶菌细胞培养物。本发明也涉及通过所述方法生产的破囊壶菌细胞培养物。

在一些实施方案中，蔗糖是细胞培养基中的主要碳源。在一些实施方案中，蔗糖是细胞培养基中的唯一碳源。蔗糖的来源包括但不限于甘蔗、甜菜、和其他植物。纯化或部分纯化的蔗糖的组合物可以是主要是蔗糖，即纯化/精制蔗糖、蔗糖粗提物、或蔗糖、葡萄糖和果糖的混合物(如糖蜜)。

在一些实施方案中，培养基包含糖蜜、糖浆、或来自任何产蔗糖蔬菜的汁(如甘蔗汁或甜菜汁)、或其组合。在一些实施方案中，培养基包含含纤维素的原料，例如甘蔗渣。在一些实施方案中，细胞培养基包含蔗糖。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞分泌异源蔗糖酶到培养基中。

用于破囊壶菌细胞的培养条件包括，但不仅限于，允许蛋白生产和/或重组的有效的培养基、生物反应器、温度、pH、和氧条件。有效的培养基是指通常培养破囊壶菌细胞的任何培养基。这样的培养基通常包含具有可同化的碳、氮、磷源，以及适当的盐、无机物、金属，和其他营养物质，如维生素的含水培养基。氮源包括但不限于蛋白胨、酵母膏、聚胨、麦芽膏、肉膏、酪蛋白氨基酸、玉米浆、有机氮源、谷氨酸钠、尿素、无机氮源、乙酸铵、硫酸铵、氯化铵、硝酸铵和硫酸钠。适合破囊壶菌的非限制性培养条件描述于，例如，美国专利第5,340,742号。接种、培养、和回收微生物群的多种发酵参数还描述于，例如，美国专利第5,130,242号。液体或固体培养基可含有天然或人工海水。本发明的破囊壶菌细胞可以在发酵生物反应器、摇瓶、试管、微滴定皿、和培养皿中培养。

发酵体积可以是用于破囊壶菌生长的任意体积，包括商业和工业体积。在一些实施方案中，发酵体积(培养体积)为至少2L、至少10L、至少50L、至少100L、至少200L、至少500L、至少1000L、至少10,000L、至少20,000L、至少50,000L，至少100,000L、至少150,000L、至少200,000L、或至少250,000L、至少300,000L、至少350,000L、至少400,000L、或至少500,000L。在一些实施方案中，发酵体积为2L-2,000,000L、2L-1,000,000L、2L-500,000L、2L-200,000L、2L-100,000L、2L-50,000L、2L-25,000L、2L-20,000L、2L-15,000L、2L-10,000L、2L-5,000L、2L-1,000L、2L-500L、或2L-100L。

本发明还涉及生产破囊壶菌生物质的方法，该方法包括将本发明的破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养，并从所述培养基收获生物质。破囊壶菌生物质是通过用于分离破囊壶菌生物质的任何常规方法，例如美国专利第5,130,242号和美国申请公开号2002/0001833中所述(将其以整体引用的方式并入本文)，获得的收获的细胞生物质。收获的生物质可以含有破囊壶菌细胞以及破囊壶菌细胞碎片。

本发明也涉及生产微生物油的方法，该方法包括将本发明的破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养以生成生物质，并从所述生物质提取油。所述油可从新鲜收获的生物质提取或可以从以前收获的已经在防止腐败的条件下保存的生物质提取。可采用已知的方法培养本发明的破囊壶菌，以从培养物中分离生物质，从生物质提取微生物油，并分析从该生物质提取的油的脂肪酸分布。参见，例如，美国专利第5,130,242号。

微生物油可以是衍生自任何破囊壶菌的任何油，包括，例如：从破囊壶菌生物质提取而没有进一步加工的粗制油；通过用进一步加工，如精炼、漂白、和/或除臭处理粗制油获得的精制油；通过稀释粗制或精制油获得的稀释油；或者例如通过用更多纯化方法处理粗制或精制油以增加油中脂肪酸浓度而获得的富集油。

在一些实施方案中，可以使用标准技术从破囊壶菌分离粗制油，不进行进一步精练或纯化。例如，可以使用溶剂提取，例如但不限于，己烷提取或异丙醇提取分离粗制油。在一些实施方案中，可以使用物理和/或机械提取方法分离粗制油，例如但不限于通过使用均质器或压制提取。

在一些实施方案中，粗制油可以进行进一步加工，例如精炼、去溶剂化、除臭、冬化(winterization)、冷滤、和/或漂白。这种“加工的”油包括已经过溶剂提取和一种或多种进一步加工的微生物油。在一些实施方案中，尽可能少地加工油。“尽可能少地加工的”油包括已经过溶剂提取和过滤的微生物油。在特定实施方案中，尽量少地加工的油进一步经防冻处理。

在一些实施方案中，与

方法(Westfalia Separator IndustryGmbH,Germany)相似的方法用于提取破囊壶菌产生的微生物油。方法是一种基于水的物理油提取方法，其中含油原料可以直接用于提取油而不使用任何常规的溶剂提取方法。在此方法中，可以使用水溶性有机溶剂作为加工助剂，并通过采用重力或离心力的密度分离从原料液中分离油。WO96/05278披露了这种提取方法并将其以整体引用的方式并入本文中。

提取了油之后，可通过本领域已知的任何合适手段从非脂质成分回收或分离油。在一些实施方案中，使用低成本的物理和/或机械技术来将含脂质组合物与非脂质组合物分离。例如，如果通过用于提取油的提取方法产生了多个相或级分，其中一个或多个相或级分含有脂质，用于回收含脂质的相或级分的方法可涉及从非脂质相或级分物理去除含脂质的相或级分，或反之亦然。在一些实施方案中，使用

型方法来提取微生物产生的脂质，然后将富含脂质的轻相与富含蛋白质的重相物理地分离(例如通过在密度分离后，撇去在富含蛋白质的重相上部的富含脂质的相)。

由本发明的破囊壶菌生产的微生物油可以通过将破囊壶菌细胞暴露于一定条件而从自溶或经诱导的裂解回收，所述条件包括，但不限于，一定的pH值、一定的温度、酶的存在、洗涤剂的存在、物理破坏、或其组合。在一些实施方案中，破囊壶菌细胞的裂解或自溶是通过使用机械力进行的。在本发明的进一步实施方案中，破囊壶菌细胞的裂解或自溶后，接着将脂质与非脂质成分机械分离。

可用于诱导破囊壶菌细胞裂解的合适的酶包括，但不限于，商业上可获得的酶或酶混合物，例如蛋白酶K或

在一些实施方案中，产油破囊壶菌在洗涤剂存在下经历诱导的裂解，所述洗涤剂例如离子(阳离子或阴离子)洗涤剂、非离子洗涤剂、两性离子洗涤剂、或其组合。在本发明的进一步实施方案中，可以使用物理破坏方法诱导产油破囊壶菌的裂解，所述方法例如机械研磨、液体均质化、在超声处理中使用高频声波、冻融循环方法、压制、挤压、或碾磨。油的提取可以通过破囊壶菌细胞在罐中的裂解在发酵结束时在发酵罐中进行。

在一些实施方案中，在蔗糖上生长的本发明的破囊壶菌细胞生产的细胞培养物、生物质和微生物油与在葡萄糖和/或果糖上生长的相应的未经转化的破囊壶菌细胞生产的细胞培养物、生物质和微生物油具有相同或基本上相似的特征(例如，细胞密度、细胞干重、脂肪酸生产能力、和脂肪酸分布)。在一些实施方案中，在蔗糖上生长后从本发明的破囊壶菌培养物产生的生物质的细胞干重高于在相同条件下从在葡萄糖和/或果糖上的相应未经转化的破囊壶菌细胞的培养物的生长获得的细胞干重。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌在蔗糖上生长后的脂肪酸总量作为占生物质的细胞干重的百分比高于在相同条件下从在葡萄糖和/或果糖上的相应未经转化的破囊壶菌细胞的生长获得的量。

生产组合物的方法

本发明也涉及制备用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物的方法，该方法包括将本发明的破囊壶菌细胞在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养以产生生物质，收获生物质，并从所述生物质制备用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。

破囊壶菌生物质可在用于组合物前通过如下方法干燥，所述方法包括但不限于，冷冻干燥、空气干燥、喷雾干燥、隧道干燥、真空干燥(冻干)或类似方法。或者，可将经收获和清洗的生物质直接用于组合物而不进行干燥。参见，例如，美国专利第5,130,242和6,812,009号，其以整体引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，制备用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物的方法，进一步包括从生物质提取油。微生物油可以用作起始材料以更有效地生成富含脂肪酸，如DHA或EPA的产物。例如，可对微生物油进行本领域已知的多种纯化技术，如蒸馏或尿素包合，以生成具有更高浓度DHA、EPA、或其他脂肪酸的更高效力的产物。微生物油也可用于化学反应以生成从所述油中的脂肪酸衍生的化合物，例如DHA、EPA、或其他脂肪酸的酯和盐。

可以基于破囊壶菌的理想属性选择如本文所述经转化以在蔗糖上生长的任何破囊壶菌用于制备任何描述的组合物，所述属性例如但不限于，破囊壶菌细胞培养物的细胞密度、与破囊壶菌生物质的干细胞相关的脂肪酸百分比和类型、与破囊壶菌的生物质和/或微生物油相关的脂肪酸分布、或其组合。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比单不饱和脂肪酸更高百分比的多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比ω-6脂肪酸更高百分比的ω-3脂肪酸。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比其他ω-3脂肪酸更高百分比的DHA。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质包含比其他多不饱和脂肪酸更高百分比的DHA。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比其他ω-3脂肪酸更高百分比的EPA。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油包含比其他多不饱和脂肪酸更高百分比的EPA。

组合物可包括一种或多种赋形剂。如本文使用的“赋形剂”指用于组合物中以为该组合物提供理想特征的成分或成分的混合物，该组合物包括食物以及药物、化妆品和工业组合物。当赋形剂加入药物组合物时可描述为“药学上可接受”的赋形剂，意味着所述赋形剂是在合理的医学判断范围内适于接触人和动物组织而在与合理的益处/风险比相称的所需接触时间内无过度毒性、刺激、变态反应或其他有问题的并发症的化合物、物质、组合物、盐和/或剂量形式。在一些实施方案中，术语“药学上可接受”指联邦或州政府的监管机构批准或者美国药典(U.S.Pharmacopeia)或其他普遍认可的国际药典中列出用于动物，更具体是人。可使用多种不同的赋形剂。在一些实施方案中，所述赋形剂可以是但不限于碱剂、稳定剂、抗氧化剂、粘着剂、分离剂、涂层剂、外相成分、控释成分、溶剂、表面活性剂、湿润剂、缓冲剂、填充剂、软化剂、或其组合。除了本文所讨论之外，赋形剂可包括但不限于Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第21版.(2005)中所列。

在一些实施方案中，所述组合物是食品。食品是供动物或人消耗的任何食物，且包括固体和液体组合物。食品可以是动物或人的食物的添加剂。食物包括但不限于普通食物；液体产品，包括牛奶、饮料、治疗性饮品和营养饮品；功能性食品；补充剂；营养制品(nutraceutical)；婴儿配方食品，包括供早产儿用的配方食品；供怀孕或哺乳的妇女用的食品；成人食品；老年食品；和动物食品。

在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油可以作为以下一种或多种中的添加剂直接使用或包括在内：油、起酥油、涂抹物、其他脂肪成分、饮料、调味料、乳制品或豆制品(如牛奶、酸乳、奶酪和冰淇凌)、焙烤物、营养品，例如作为营养补充剂(以胶囊或片剂形式)、维生素补充剂、膳食补充剂、粉末饮品、成品或半成品粉末食品、及其组合。

可以包括微生物油的食物组合物的部分列表包括但不限于豆制品(牛奶、冰淇凌、酸乳、饮品、奶油、涂抹物、增白剂)；汤和汤粉；生面团、糊状物和烘焙食物，包括例如精致烘培制品(fine bakery ware)、早餐谷物(breakfast cereal)、蛋糕(cake)、芝士蛋糕(cheesecake)、馅饼(pie)、纸杯蛋糕(cupcake)、曲奇(cookie)、条状食物(bar)、面包(bread)、卷(roll)、饼干(biscuit)、松饼(muffin)、发面点心(pastries)、司康(scone)、油煎面包块(crouton)、薄脆饼干(cracker)、甜食(sweet goods)、小食糕点(snack cake)、馅饼、格兰诺拉麦片/小食条(granola/snack bar)和烤吐司(toaster pastry)；糖果；硬糖果；巧克力和其他糖果；口香糖；液体食品，例如牛奶、能量饮料、婴儿配方食品、碳酸饮料、茶、流质食物、果汁、果汁饮料、蔬菜饮料；复合维生素糖浆、餐食替代物、药膳和糖浆；粉末冲泡饮料混合物；意大利面；加工鱼制品；加工肉制品；加工禽制品；肉汁和调味料；调味品(蕃茄酱、蛋黄酱等)；植物油涂抹料；乳制品；酸乳；黄油；冷冻乳制品；冰淇淋；速冻甜食；冻酸奶；半固体食品如婴儿食品；布丁和明胶甜品；加工和未加工奶酪；煎饼混合料；食物条，包括能量条；华夫饼混合料；沙拉酱汁；鸡蛋替代混合料(replacementegg mix)；坚果和坚果涂抹物；咸味休闲食品如薯片、和其他片或脆片、玉米片、墨西哥玉米片、膨化休闲食品、爆米花、椒盐卷饼、薯条和坚果；特色小吃如蘸料(dip)、干果小吃、肉类零食、猪肉皮、健康食物条和米糕/玉米饼。

在一些实施方案中，微生物油可用于补充婴儿配方食品。可以用单独的或与源自产生花生四烯酸(ARA)的微生物的物理精制油组合的本发明的微生物油来补充婴儿配方食品。产生ARA的微生物是例如高山被孢霉(Mortierella alpina)或舒克里被孢霉(Mortierella sect.schmuckeri)。或者，婴儿配方食品可补充以微生物油与富含ARA的油，包括

(MartekBiosciences,Columbia,MD)的组合。

在一些实施方案中，所述组合物是动物饲料。“动物”指属于动物界的任何非人生物，并且包括但不限于水生动物和陆生动物。术语“动物饲料”或“动物食物”指用于非人动物的任何食物，无论是鱼；经济鱼类；观赏鱼；鱼苗(fishlarvae)；双壳类；软体动物；甲壳动物；贝类；虾；幼虾；卤虫(artemia)；轮虫；鳃足虫；滤食动物；两栖动物；爬行动物；哺乳动物；家畜；耕畜；动物园动物；运动类动物；种畜；比赛类动物；表演类动物；活化石动物(heirloom animals)；稀有或濒危动物；伴侣动物；宠物如狗、猫、豚鼠、兔、大鼠、小鼠或马；灵长类动物如猴(例如，卷尾猴、恒河猴、非洲绿猴、赤猴、食蟹猴和长尾猴)、猿、猩猩、狒狒、长臂猿和黑猩猩；犬科动物如狗和狼；猫科动物如猫、狮子和虎；马科动物如马、驴子和斑马；食用动物如奶牛、牛、猪和绵羊；有蹄动物如鹿和长颈鹿；啮齿动物如小鼠、大鼠、仓鼠和豚鼠；等等。动物饲料包括但不限于水产养殖饲料、家畜饲料，包括宠物饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、畜牲饲料或其组合。

在一些实施方案中，所述组合物是人食用其肉或制品的任何动物的饲料或饲料补充剂，如从其衍生肉、蛋或乳汁供人食用的任何动物。喂养这些动物时，可将营养物如LC-PUFA掺入该动物的肉、乳汁、蛋或其他产品以增加它们的这些营养素的含量。

在一些实施方案中，所述组合物是喷雾干燥的物质，可将其粉碎以形成适当大小的颗粒以供浮游动物、卤虫、轮虫和滤食动物食用。在一些实施方案中，以所述组合物喂食的浮游动物、卤虫或轮虫继而被鱼苗、鱼、贝类、双壳类或甲壳动物吃掉。

在一些实施方案中，所述组合物是药物组合物。合适的药物组合物包括但不限于抗炎组合物、冠心病治疗药物、动脉硬化治疗药物、化疗剂、活性赋形剂、骨质疏松药物、抗抑郁药、抗惊厥药、抗幽门螺杆菌药物、神经退行性疾病治疗药物、退行性肝病治疗药物、抗生素、降胆固醇组合物和降甘油三酯组合物。在一些实施方案中，所述组合物是医疗食品。医疗食品包括在医师指导下服用或外部施用的组合物中的食物和用于某状况的特定饮食控制的食物，对于该状况基于公认的科学原理通过医学评估确定独特营养需求。

在一些实施方案中，所述微生物油可制成剂量形式。剂量形式可包括但不限于片剂、胶囊、扁囊剂、丹剂、丸剂、散剂和颗粒剂、和胃肠外剂量形式，胃肠外剂量形式包括但不限于溶液剂、悬剂、乳剂和干粉，其含有有效量的所述微生物油。本领域也已知这些制剂还可包含药学上可接受稀释剂、填充剂、崩解剂、粘合剂、润滑剂、表面活性剂、疏水性运载体、水溶性运载体、乳化剂、缓冲剂、湿润剂、保湿剂、增溶剂、防腐剂等。施用形式可包括但不限于片剂、糖衣丸、胶囊、小胶囊和丸剂，其含有所述微生物油和一种或多种药学上可接受的适当载体。

对于口服施用，所述微生物油可与本领域熟知的药学上可接受载体组合。这些载体使所述微生物油能够制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆料、悬剂等，以供由待治疗的受试者口服摄入。在一些实施方案中，所述剂量形式是片剂、丸剂或小胶囊。可通过加入固体赋形剂，任选研磨所得混合物，并且如需要在加入适当辅剂后加工颗粒混合物，从而获得片剂或糖衣丸的芯来获得用于口服使用的药物组合物。合适的赋形剂包括但不限于填充剂如糖，包括但不限于乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；纤维素制备物例如但不限于玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉、土豆淀粉、明胶、黄芪胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。如需要，可加入崩解剂，例如但不限于交联聚乙烯吡咯烷酮、琼脂、或藻酸或其盐如藻酸钠。能口服使用的药物制备物包括但不限于由明胶制成的推入配合(push-fit)胶囊，以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨醇制成的密封软胶囊。

在一些实施方案中，所述组合物是化妆品。化妆品包括但不限于乳剂、乳霜、洗液、面膜、肥皂、洗发水、洗涤剂、面霜、护发素、彩妆用品、沐浴剂和分散液。化妆剂可以是医用或非医用的。

在一些实施方案中，所述组合物是工业组合物。在一些实施方案中，所述组合物是一种或多种制品的原材料。制品包括但不限于聚合物；照相感光材料；洗涤剂；工业用油；或工业洗涤剂。例如，美国专利第7,259,006号描述了使用含DHA的脂肪和油用于生成山嵛酸和用山嵛酸生产照相感光材料。

生产生物燃料的方法

本发明也涉及从本发明的重组破囊壶菌生产生物燃料的方法。

本文使用的“生物燃料”指产自或使用本发明的破囊壶菌的生物质或微生物油的任何燃料，包括但不限于，生物柴油、可再生柴油、共处理的可再生柴油、喷气生物燃料、取暖用油和燃料添加剂。本领域已知的任何方法可用于从本发明的破囊壶菌的生物质和微生物油生成生物燃料，包括但不限于WO 2005/035693、美国申请公开号2005/0112735、2007/027633、WO2006/127512、美国申请公开号2007/0099278、美国申请公开号2007/0089356、WO 2008/067605、美国申请公开号2009/0035842、和美国申请公开号2009/0064567(其以整体引用的方式并入本文)描述的任何方法。本文描述的任何生物燃料可以与化石燃料混合。例如，生物柴油可以与化石柴油以1%-99%的比例混合。在一些实施方案中，即使本发明的破囊壶菌的微生物油没有经过常规加工，也将它作为生产生物燃料的起始点使用。可以避免的常规加工的例子包括精制(例如，物理精制、硅精制或苛性精制)、去溶剂化、除臭、冬化、冷滤和/或漂白。因此，在某些实施方案中，油没有经过精制、去溶剂化、除臭、冬化、冷滤、漂白或其组合。

在一些实施方案中，生产生物燃料的方法包括在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养本发明的破囊壶菌以产生生物质，从生物质提取油，并通过对油进行酯交换，裂化油，经由热解聚加工油，将油加入传统的石油精炼过程中，或其组合生产生物燃料。

在一些实施方案中，通过对油进行酯交换生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是生物柴油。生物柴油的各种形式是已知的并且包括但不限于WO 07/061903、美国专利第7,172,635号、欧洲专利第1227143号、WO02/38709、WO 02/38707、和美国申请公开号2007/0113467中描述的生物柴油。油中甘油三酯的酯交换产生长链脂肪酸酯，即烷基酯，并可以通过本领域已知的任何方法进行以生产生物燃料。在一些实施方案中，烷基醚是甲酯或乙酯。在一些实施方案中，从破囊壶菌生物质提取油和对油进行酯交换可以同时进行。在一些实施方案中，从破囊壶菌生物质提取油和对油进行酯交换分开进行。参见，例如，美国申请公开号2009/0064567。

在一些实施方案中，使用低级烷基醇和酸或碱催化剂进行酯交换。适合本发明使用的醇包括含有1-6个碳原子的任何低级烷基醇(即，C_1-6烷基醇，例如甲基、乙基、异丙基、丁基、戊基、己基醇及其异构体)。在一些实施方案中，醇构成油组合物、醇和催化性碱的混合物的5wt.%-70wt.%，5wt.%-60wt.%，5wt.%-50wt.%，7wt.%-40wt.%，9wt.%-30wt.%，或10wt.%-25wt.%。在一些实施方案中，油组合物和碱可以加入纯的乙醇或纯的甲醇。醇的用量可以随油在醇中的溶解度变化。可以使用本领域已知的适合作为反应剂使用的任何碱，包括式RO-M的碱，其中M是单价阳离子且RO是C_1-6烷基醇的醇盐。适合的碱的例子包括但不限于，元素钠、甲醇钠、乙醇钠、甲醇钾和乙醇钾。在一些实施方案中，碱是乙醇钠。在一些实施方案中，以油中甘油三酯的0.05-2.0摩尔当量，0.05-1.5摩尔当量，0.1-1.4摩尔当量，0.2-1.3摩尔当量，或0.25-1.2摩尔当量的量将碱与油组合物和醇一起加入反应。包含甘油三酯、醇和碱的油在某个温度一起反应一定时间以允许从脂肪酸残基和纯产生酯。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应在20℃-140℃，20℃-120℃，20℃-110℃，20℃-100℃，或20℃-90℃的温度下进行。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应在至少20℃，至少75℃，至少80℃，至少85℃，至少90℃，至少95℃，至少105℃，或至少120℃的温度下进行。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应在20℃，75℃，80℃，85℃，90℃，95℃，105℃或120℃的温度下进行。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应进行从2小时-36小时，从3小时-36小时，从4小时-36小时，从5小时-36小时，或从6小时-36小时的时间。在一些实施方案中，组合物在醇和碱存在下的反应进行0.25，0.5，1，2，4，5，5.5，6，6.5，7，7.5，8，8.5，10，12，16，20，24，28，32或36小时的时间。在一些实施方案中，油组合物、醇和碱的反应可以通过回流组分以产生脂肪酸酯，如PUFA酯来进行。在一些实施方案中，油组合物的反应可以在不导致反应组分的回流的温度下进行。例如，在大于大气压的压力下进行油组合物的反应可以增加反应混合物中存在的溶剂的沸点。在这种情况下，反应可以在溶剂在常压下会沸腾的温度下进行，而不会导致反应组分的回流。在一些实施方案中，反应在5磅每平方英寸(psi)-20psi；7psi-15psi；或9psi-12psi的压力下进行。在一些实施方案中，反应在7，8，9，10，11或12psi的压力下进行。在压力下进行的反应可以在上面列出的反应温度下进行。在一些实施方案中，在压力下进行的反应可在至少20℃-140℃，20℃-120℃，20℃-110℃，20℃-100℃，或20℃-90℃下进行。在一些实施方案中，在压力下进行的反应可以在至少70℃，至少75℃，至少80℃，至少85℃，或至少90℃下进行。在一些实施方案中，在压力下进行的反应可以在70℃，75℃，80℃，85℃，或90℃进行。

用于生产生物燃料，如生物柴油的油中减少的PUFA量可以增加生物燃料的能量密度并且能够减少潜在的氧化或硫酸盐化的位点数量。在一些实施方案中，破囊壶菌生物质或微生物油，或其甘油三酯级分，包含比多不饱和脂肪酸更大百分比的单不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，分级微生物油以去除多不饱和脂肪酸。在一些实施方案中，将油氢化以将多不饱和脂肪酸转化为单不饱和脂肪酸。为了确保更高百分比的微藻油(microalgal oil)衍生的生物柴油能够别燃烧，可以使用部分或全部油氢化的任何方法，如在人造奶油(margarines)制造中的常规一样。在一些实施方案中，使用生产低水平的PUFA的破囊壶菌来生产微生物油。在一些实施方案中，选择产生比多不饱和脂肪酸更大量的单不饱和脂肪酸的本发明的破囊壶菌。在一些实施方案中，生物油中少于50%的不饱和脂肪酸是PUFA。在一些实施方案中，生物油中的不饱和脂肪酸中含有低于40%，低于30%，低于20%，低于10%，或低于5%的PUFA。在一些实施方案中，微生物油包含低于50%，低于40%，低于30%，低于20%，低于10%，或低于5%重量的PUFA。

除了以上所述的酯交换方法，其他减少微生物油粘度的技术也可用于生产生物燃料。这些技术包括但不仅限于，脂肪酶的使用、超临界甲醇催化、和全细胞系统的使用，其涉及在宿主细胞中脂肪酶的胞质过表达，接着透化宿主以允许在细胞质内对甘油三酯的酯交换的催化。在一些实施方案中，本发明的破囊壶菌细胞还包含编码用于催化胞质内甘油三酯酯交换的脂肪酶的多核苷酸序列。参见，例如，美国专利第7,226,771号、美国申请公开号2004/0005604、WO 03/089620、WO 05/086900、美国申请公开号2005/0108789、WO 05/032496、WO 05/108533、美国专利第6,982,155号、WO 06/009676、WO 06/133698、WO 06/037334、WO 07/076163、WO 07/056786、和WO 06/124818，其以整体引用的方式并入本文。

在一些实施方案中，通过裂化油生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是喷气生物燃料。“裂化”在本领域理解为描述通过如在油工业中使用的那些方法降低油中脂肪酸的链长度。在一些实施方案中，油中大量多不饱和脂肪酸的存在将为烃的生产提供更大的灵活性和多样性，因为多不饱和脂肪酸中的多个不饱和位点提供了多个位点以供切割以生成烃。例如，某些喷气燃料需要具有2-8个碳原子的烃。可以通过本领域已知的方法，如裂化，来切割多不饱和脂肪酸以产生不同链长的较短的烃。

在一些实施方案中，通过热解聚生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是可再生柴油。正如本文所使用的，热解聚包括任何使用过热的水生产可再生柴油的方法。

在一些实施方案中，在柴油燃料的生产过程中通过将油加入石油精炼过程生产生物燃料。在一些实施方案中，生物燃料是共处理的可再生柴油。

已经一般描述了本发明，参考本文提供的例子可获得进一步的理解。这些例子仅出于说明目的而不是为了限制本发明。

实施例1

pCL0076表达载体的构建

用BamHI和NdeI消化载体pAB0018(ATCC登录号PTA-9616)产生长838bp和9879bp的两条片段。通过标准电泳技术在琼脂凝胶中分级9879bp的片段，使用商用DNA纯化试剂盒纯化，并连接至序列(SEQ ID NO:1)，其包含编码裂殖壶菌属菌种ATCC号20888的Sec1蛋白的天然分泌信号的多核苷酸序列，接着是编码成熟的酿酒酵母转化酶蛋白(SUC2)的序列，其使用图1中裂殖壶菌属密码子选择表进行了密码子优化(Blue Heron Biotechnology,Bothell,WA完成密码子优化)。将包含编码裂殖壶菌属Sec1信号肽和酿酒酵母SUC2分泌性转化酶蛋白(GenBank登录号P00724)的序列的融合序列插入裂殖壶菌属载体pSchiz，接着通过用BamHI和NdeI消化产生SEQ ID NO:1。

然后使用制造商的方案将连接产物用于转化商业提供的感受态DH5α大肠杆菌细胞菌株(Invitrogen)。使若干所产生的克隆增殖并提取和纯化它们的质粒。然后通过限制性消化和/或PCR筛选这些质粒以确认连接产生了预期的质粒载体。由连接9879bp片段和SEQ ID NO:1产生的一个这样的质粒载体通过Sanger测序进行了验证并命名为pCL0076(SEQ ID NO:2)。参见图2。

实施例2

裂殖壶菌属在蔗糖上的生长

将裂殖壶菌属菌种ATCC 20888和命名为B76-32的经遗传修饰的裂殖壶菌属衍生株的培养物在M2B培养基上培养，所述培养基由10g/L葡萄糖，0.8g/L(NH₄)₂SO₄，5g/L Na₂SO₄，2g/L MgSO₄·7H₂O，0.5g/L KH₂PO₄，0.5g/LKCl，0.1g/L CaCl₂·2H₂O，0.1M MES(pH 6.0)0.1%PB26金属，和0.1%PB26维生素(v/v)组成。PB26维生素由50mg/mL维生素B12，100μg/mL硫胺素和100μg/mL泛酸钙组成。PB26金属调整到pH 4.5并由3g/L FeSO₄·7H₂O，1g/L MnCl₂·₄H₂O，800mg/mL ZnSO₄·7H₂O，20mg/mL CoCl₂·6H₂O，10mg/mLNa₂MoO₄·2H₂O，600mg/mL CuSO₄·5H₂O，和800mg/mL NiSO₄·6H₂O组成。PB26贮液分别过滤灭菌后加入到高压灭菌后的培养液。在混合前，将葡萄糖、KH₂PO₄和CaCl₂·2H₂O与剩余的培养液成分分开各自高压灭菌，以防止盐析出和糖焦化。所有培养基成分均购自Sigma Chemical(St.Louis,MO)。菌株B76-32是根据美国专利号7,211,418和美国公开号2008/0022422和2008/0026434工程化的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888的衍生株。

将裂殖壶菌属菌种ATCC 20888和B76-32的培养物培养到对数期并使用如下所述的伴有酶预处理的电穿孔以载体pCL0076转化。

伴有酶预处理的电穿孔-将细胞在50mL M50-20培养基中(见美国公开号2008/0022422)在30℃以200rpm在摇床上培养2天。将细胞按1:100稀释到M2B培养基(见下文段落)中并培养过夜(16-24h)，以期达到中-对数期生长(1.5-2.5的OD600)。将细胞在50mL锥形管中以约3000×g离心5min。移去上清并将细胞重悬于合适体积的1M甘露醇，pH 5.5，以达到2OD600单位的终浓度。将5mL细胞分装到25mL摇瓶并以10mM CaCl₂(1.0M贮液，过滤灭菌)和0.25mg/mL蛋白酶XIV(10mg/mL贮液，过滤灭菌；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)修正。将摇瓶在30℃和约100rpm的摇床上温育4小时。在显微镜下监测细胞以确定原生质体程度(degree ofprotoplasting)，理想的是单个的细胞。将细胞在圆底管(即14mL FalconTM管，BD Biosciences，San Jose，CA)中以约2500xg离心5分钟。除去上清并轻轻地用5ml冰冷的10%甘油重悬细胞。将细胞在圆底管中以约2500xg重新离心5分钟。除去上清并使用大口径枪头以500μL冰冷的10%甘油轻轻重悬细胞。将90μL细胞分装入预冷的电穿孔小杯(electro-cuvette)(Gene

小杯-0.1cm间隙或0.2cm间隙,Bio-Rad,Hercules,CA)。向小杯中添加1μg至5μg的DNA(以小于或等于10μL体积)，用枪头轻轻混合，并置于冰上5分钟。将细胞在200ohms(电阻)，25μF(电容)，和250V(0.1cm间隙)或500V(0.2cm间隙)下电穿孔。将0.5mL M50-20培养基立即加入小杯。然后将细胞转移到25mL摇瓶中的4.5mL M50-20培养基中并在30℃和约100rpm的摇床上温育2-3小时。将细胞在圆底管中以约2500xg离心5分钟。移除上清并将细胞沉淀重悬于0.5mL M50-20培养基中。将细胞铺板到适当数量(2-5个)的含有适当选择(如需要)的M2B平板上并在30℃温育。

选择转化体以供在M2B+SMM培养基上生长，或直接选择以供通过铺板到MSFM+蔗糖上在蔗糖上生长。对于MSFM+蔗糖选择，1-2周后将菌落以几次传代至重新铺板到新鲜的含蔗糖培养基上。确定转化酶的表达可以用作破囊壶菌菌落在蔗糖作为唯一碳源上生长的选择标记。

对于下面的实验，在27°C温育2-6天后，选择原代转化体以供在含有20g/L琼脂(VWR，West Chester，PA)和10μg/mL SMM(Chem Service，Westchester，PA)的固体M2B培养基上生长。将所有原代转化体手动转移到含SMM的新鲜M2B板中。1周后，将菌落转移到无SMM的MSFM和5g/L蔗糖中。1周后，将最大的菌落转移到新鲜MSFM/蔗糖培养基平板。选择10个在蔗糖上生长的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888转化体进行进一步表征并分别命名为1-1，1-3，1-24，3-1，3-2，3-5，3-21，4-1，4-24和4-31。选择9个在蔗糖上生长的B76-32转化体进行进一步表征并命名为B76-32#2，#12，#19，#26，#30，#39，#42，#56，和#61。

用接种环从平板中移出在蔗糖上生长的菌落(1-1，1-3，1-24，3-1，3-2，3-5，3-21，4-1，4-24，4-31)并转入含有5mL蔗糖培养基的培养管中，并在29°C摇床上培养4天。将2mL这种培养物用于接种250mL烧瓶中的50mL培养基(MSFM或SSFM)并以200rpm在29°C摇床上培养。

将亲本株裂殖壶菌属菌种ATCC 20888的对照瓶以相同方式培养，但使用含葡萄糖的培养基。7天后收获细胞。离心细胞并用50%异丙醇:蒸馏水混合物洗涤。冷冻干燥沉淀的细胞、称重、并进行脂肪酸甲酯(FAME)分析。为了FAME分析，使用标准程序从细胞培养物提取油并以占总脂肪酸甲酯(FAME)的百分比分析脂肪酸组成。参见，例如，美国公布号2010/0239533，以整体引用的方式并入本文。通过重量测定并通过对衍生化的油的气相色谱分析了裂殖壶菌属菌种ATCC 20888或B76-32的CL0076转化体的生长和脂肪含量，如先前在美国公开号2008/0022422(以整体引用的方式并入本文)中描述的。结果显示于表5-8。来自转化体以及亲本株的摇瓶培养物的沉淀的干重和脂肪含量如图3-8所示。

SSFM培养基：50g/L葡萄糖或蔗糖，13.6g/L Na₂SO₄，0.7g/L K₂SO₄，0.36g/L KCl，2.3g/L MgSO₄·7H₂O，0.1M MES(pH 6.0)，1.2g/L(NH₄)₂SO₄，0.13g/L谷氨酸钠，0.056g/L KH₂PO₄，和0.2g/L CaCl₂·2H₂O。维生素从由0.16g/L维生素B12，9.7g/L硫胺素和3.3g/L泛酸钙组成的贮液，以1mL/L加入。痕量金属从由1g/L柠檬酸，5.2g/L FeSO₄·7H₂O，1.5g/L MnCl₂·₄H₂O，1.5g/L ZnSO₄·7H₂O，0.02g/L CoCl₂·6H₂O，0.02g/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.0g/LCuSO₄·5H₂O，和1.0g/L NiSO₄·6H₂O组成的贮液，以2mL/L加入，调整到pH 2.5。

改进的SFM(MSFM)培养基：10g/L葡萄糖或蔗糖，25.0g/L NaCl，1.0g/L KCl，0.2g/L(NH4)2SO4，5g/L，5.0g/L MgSO4·7H₂O，0.1g/L KH₂PO₄，0.3g/L CaCl₂·2H₂O，0.1M HEPES(pH 7.0)，0.1%PB26金属，和0.1%PB26维生素(v/v)。维生素从由0.16g/L维生素B12，9.7g/L硫胺素和3.3g/L泛酸钙组成的贮液，以2mL/L加入。痕量金属从由1g/L柠檬酸，5.2g/LFeSO₄·7H₂O，1.5g/L MnCl₂·4H₂O，1.5g/L ZnSO₄·7H₂O，0.02g/L CoCl₂·6H₂O，0.02g/L Na₂MoO₄·2H₂O，1.0g/L CuSO₄·5H₂O，和1.0g/L NiSO₄·6H₂O组成的贮液，以2mL/L加入，调整到pH 2.5。

表5显示了在含葡萄糖、果糖、蔗糖、或没有添加碳源的MSFM中生长的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888的生长和脂肪水平。

表6显示了在含葡萄糖(对照)的MSFM培养基中生长的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888和在含蔗糖的MSFM培养基中生长的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888转化细胞系的干重和脂肪酸%。

表7显示了在含葡萄糖(对照)的SSFM培养基中生长的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888和在含蔗糖的SSFM培养基中生长的裂殖壶菌属菌种ATCC20888转化细胞系的干重和脂肪酸%。

表8显示了在含葡萄糖(对照)的SSFM培养基中生长的裂殖壶菌属B76-32和在含蔗糖的SSFM培养基中生长的裂殖壶菌B76-32转化细胞系的干重和脂肪酸%。

表5.在含葡萄糖、果糖、蔗糖、或没有添加碳源的MSFM中生长裂殖壶菌属菌种ATCC 20888的生长和脂肪水平

	葡萄糖	果糖	蔗糖	没有添加碳源
					DW(g/L)	2.84	2.65	0.16	0.11
%sFA	66.5	65.3	ND	ND

DW=干重

FA=脂肪酸

表6.在含蔗糖的MSFM培养基中生长的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888转化细胞系。

DW=干重

FA=脂肪酸

表7.在含蔗糖的SSFM培养基中生长的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888转化细胞系。

DW=干重

FA=脂肪酸

表8.在含蔗糖的SSFM培养基中生长的B76-32转化细胞系。

DW=干重

FA=脂肪酸

实施例3

裂殖壶菌属中转化酶的表达

于5000xg离心培养物后，收集在SSFM中生长3天(见美国公开号2008/0022422)的用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888克隆1-3(实施例2)的50mL摇瓶培养物的无细胞上清。使用培养物上清或直接进行SDS-PAGE或使用商业上可获得的装备以允许所有比10kDa重的组分浓缩的渗透膜的浓缩器将其浓缩50-100倍。通过Bradford法(Biorad)测量总蛋白浓度。然后通过按照标准免疫印迹程序(Sambrook等)的免疫印迹分析验证转化酶的表达。简言之，通过在bis-tris凝胶(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)上的SDS-PAGE分离蛋白质(0.625μg-5μg)。然后用考马斯蓝(SimplyBlueSafe Stain，Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)染色蛋白，或转移到聚偏氟乙烯膜上并以从注射了酿酒酵母转化酶纯制备物(Sigma，St.Louis，MO)的兔衍生的转化酶抗血清(Open Biosystems，Huntsville，AL)探查转化酶蛋白的存在。接着使用与碱性磷酸酶(Promega Corporation，Madison，WI)偶联的小鼠抗兔二抗温育该膜。然后根据制造商的说明(KPL，Gaithersburg，MD)使用5-溴-4-氯-3-吲哚-磷酸/四唑氮蓝溶液(BCIP/NBT)处理膜。图9中展示了一个例子。在小图9A和9B中分别展示了抗-转化酶免疫印迹和相应的考马斯蓝染色凝胶。在克隆1-3的培养物上清中看到的四条主带中，只有一条显示出与抗-转化酶抗血清反应。通过肽序列分析确认了该蛋白的身份。

实施例4

裂殖壶菌属中的转化酶活性

通过从蔗糖释放果糖和葡萄糖的速率测量蔗糖酶活性。该测定是通过向发酵液上清加入蔗糖进行的，并且通过HPLC测定葡萄糖/果糖含量。

将用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种B76-32克隆#2(实施例2)在29°C在50mL摇瓶中的MSFM(含蔗糖)上培养直至OD_600nm达到约4。将细胞以4500xg离心15min并测量上清中的转化酶活性。通过加入0.1M蔗糖至不同体积的发酵液并调整终体积至1mL来测定转化酶。将反应物在55°C温育3min。在100°C 10分钟完成反应的终止，然后冷冻，之后通过HPLC定量葡萄糖、果糖和蔗糖。使用Liu等，Food Sci.28:293-296(2007)中描述的方法的修改版本进行HPLC。简言之，使用带有Luna NH₂柱的HPLC分离单糖和二糖并使用RID(折射率检测器)检测。通过与标准品的保留时间的比较进行鉴定。通过外部标准校正进行定量。作为蔗糖浓度的函数的反应速率如图10A所示。从标准的Lineweaver-Burk作图计算出Km(33.4mM)和Vmax(6.8mM葡萄糖/分钟)。见图10B。

实施例5

裂殖壶菌属中转化酶的糖基化

在4-12%的bis-tris胶(Invitrogen)上通过SDS-PAGE分离实施例4的上清蛋白。然后用考马斯蓝(SimplyBlue^TM Safe Stain，Invitrogen，Carlsbad，CA)染色蛋白。从凝胶切出染色的感兴趣蛋白并切成较小块(~1mm³)的薄片并以40mM碳酸氢铵(AmBic)和100%乙腈交替脱色，直到颜色变为透明。将脱色的凝胶在40mM Ambic的10mM DTT中在55℃重新膨胀1小时。以55mM碘乙酰胺(IAM)替换DTT溶液并在黑暗中温育45min。接着温育的是交替用40mMAmBic和100%乙腈洗涤两次。最初将脱水凝胶用胰蛋白酶溶液(在40mM Ambic中的胰蛋白酶)在冰上重新膨胀45min，并且在37℃过夜进行蛋白消化。将上清转移到另一个管。依次使用在5%甲酸中的20%乙腈、在5%甲酸中的50%乙腈、和随后在5%甲酸中的80%乙腈从凝胶中提取肽和糖肽。将样品溶液干燥并合并入一个试管。使提取的胰蛋白酶消化物通过C18筒(Waters Corporation，Milford，MA)，并用5%乙酸洗涤以去除污染物(如盐和SDS)。依次使用在5%的乙酸中的20%异丙醇、在5%的乙酸中的40%异丙醇，和100%异丙醇洗脱肽和糖肽并在高速真空浓缩器中干燥。合并干燥样品，然后用50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)重构，并在100°C加热5分钟以灭活胰蛋白酶。将胰蛋白酶消化物用PNGase F在37℃温育过夜以释放N-聚糖。消化后，使样品通过C18

筒并用5%乙酸洗脱碳水化合物级分并通过冻干干燥。基于Anumula和Taylor (Anumula和Taylor，1992)的方法全甲基化释放的N联寡糖并通过质谱分析。按照ComplexCarbohydrates Research Center(Aoki K等,J.Biol.Chem.282:9127-42(2007)开发的方法进行了质谱分析。通过使用NSI-LTQ/MS_n确定了质量分析。简言之，将全甲基化的聚糖溶解于在50%甲醇中的1mM NaOH并以0.4μL/min的恒定流速直接注入设备(Finnigan^TM LTQ^TM线性离子阱质谱仪，ThermoElectron Corpotation，Waltham，MA)。在阳离子模式进行MS分析。对于总离子映射，自动MS/MS分析(以35碰撞能量)，从500-2000的m/z范围，在与先前窗口重叠2个质量单位的连续2.8质量单位窗口中扫描。

进行总离子映射以检测指示聚糖的碎片离子的存在。提取了从m/z 500到m/z 2000的所有MS/MS数据并且对原始数据进行了手动分析。通过NSI-总离子映射获得的色谱图和物种表如图11和图12所示。通过扫描过滤处理该色谱图，m/z 139的中性丢失，这是一种高甘露糖型聚糖的典型中性丢失。总离子映射揭示了这种样品含有一系列具有长甘露糖链的高甘露糖型聚糖。

实施例6

裂殖壶菌属中黑曲霉转化酶的表达

以HindIII消化载体pAB0018(ATCC登录号PTA-9616)，用绿豆核酸酶处理，纯化，然后再进一步以KpnI消化，产生四种不同大小的片段。通过标准电泳技术在琼脂凝胶中分离了2552bp的片段并用商业DNA纯化试剂盒纯化。然后进行使用PmeI和Kpn的对pAB0018的第二次消化。从该消化产物中分离并纯化了6732bp的片段并与2552bp片段连接。然后使用制造商的方案将所述连接产物用于转化商业提供的感受态DH5α大肠杆菌细胞菌株(Invitrogen)。将来自氨苄青霉素抗性克隆的质粒增殖，纯化，然后通过限制性消化或PCR筛选以确认连接产生了预期的质粒结构。将一个经验证的质粒命名为pCL0120。参见图13和SEQ ID NO:5。

使用图1的裂殖壶菌属密码子选择表，对编码来自真菌黑曲霉(GenBank登录号S33920)的Suc1分泌性转化酶蛋白的成熟形式的多核苷酸序列进行了密码子优化(由Blue Heron Biotechnology，Bothell，WA进行密码子优化）以供在裂殖壶菌属中表达。合成了经密码子优化的序列并将产生的多核苷酸序列与取代内源信号肽作为N-端前导序列的编码裂殖壶菌属Sec 1信号肽(“Sec1ss”)的核苷酸序列融合。所产生的“s1Suc1”核酸序列(SEQ ID NO:4)的编码区如图14所示。按照标准技术使用用于插入和连接的5'和3'限制性位点BamHI和NdeI将经密码子优化的s1Suc1多核苷酸克隆到载体pCL0120中。产生的载体pCL0137的质粒图谱如图15所示。用这种载体转化野生型菌株裂殖壶菌属菌种ATCC 20888并在含SMM的固体SSFM培养基上选择产生的克隆。然后再将SMM-抗性克隆重新铺板到含有蔗糖作为唯一碳源的SSFM固体培养基上以测定生长。取决于转化实验，50%-90%的SMM抗性原代转化体能够在蔗糖培养基上生长。

实施例7

在裂殖壶菌属中分泌性转化酶、胞质转化酶和蔗糖转运蛋白的表达

对酿酒酵母AGT1α-葡糖苷转运蛋白基因(GenBank登录号L47346)进行密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达，并将其插入到包含ZEOCIN^TM选择标记的载体pCL0121(SEQ ID NO:6)，以产生载体pCL0125(SEQ ID NO:7)。

对马铃薯(Solanum tuberosum)(土豆)SUT1蔗糖转运蛋白基因(GenBank登录号X69165)进行密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达，并将其插入到包含ZEOCIN^TM选择标记的载体pCL0121(SEQ ID NO:6)，以产生载体pCL0126(SEQ ID NO:8)。

对编码酿酒酵母胞质SUC2转化酶蛋白的多核苷酸序列(GenBank登录号P00724)进行密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达，并将其插入到包含巴龙霉素选择标记的载体pCL0122(SEQ ID NO:9)，以产生载体pCL0127(SEQID NO:10)。

将用pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种B76-32克隆#19进一步用分别包含AGT1α-葡糖苷转运蛋白和SUT1蔗糖转运蛋白的pCL0125或pCL0126转化。在抗生素上选择转化体并通过PCR证实了转运蛋白基因的存在。将转化体进一步用包含胞质SUC2的pCL0127转化，在抗生素上选择，并如实施例2中所述基于干重和FAME含量分析在蔗糖上的生长。观察了在蔗糖上的生长和脂肪酸的产生。

使用：(1)包含AGT1α-葡糖苷转运蛋白的pCL0125和包含胞质SUC2的pCL0127的组合；或(2)包含SUT1蔗糖转运蛋白的pCL0126和包含胞质SUC2的pCL0127的组合，转化野生型裂殖壶菌属菌种ATCC 20888细胞。将转化体在蔗糖上培养并选择。pCL0125/pCL0127和pCL0126/pCL0127的组合中的每一种产生了能够在蔗糖上生长的转化体。鉴定了阳性转化体并冷冻。在其后的时间内，解冻所述阳性转化体，将其进一步用包含分泌性转化酶的pCL0076转化，在抗生素上选择，并分析生长水平和FAME，如实施例2中所述。

使用：(1)包含AGT1α-葡糖苷转运蛋白的pCL0125和包含胞质SUC2的pCL0127的组合；或(2)包含SUT1蔗糖转运蛋白的pCL0126和包含胞质SUC2的pCL0127的组合，进一步转化用包含SUC2分泌性转化酶的pCL0076转化的裂殖壶菌属菌种ATCC 20888(克隆1-3，实施例2)。将转化体在ZEOCIN^TM和巴龙霉素上培养并选择。鉴定了阳性转化体并冷冻。在其后的时间内，解冻所述阳性转化体并分析在蔗糖上的生长和脂肪酸甲酯，如实施例2中所述。

本文所述的各个方面、实施例和选项均可以与任何和所有的变化相结合。

只要个人出版物、专利或专利申请是专门单独表示将纳入本文作为参考的，在本文中提到的所有出版物、专利和专利申请，以相同的程度纳入本文作为参考。

Claims (37)

1.一种生产破囊壶菌(thraustochytrid)细胞培养物的方法，该方法包括：

(a)以包含编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列的核酸分子转化破囊壶菌细胞，并

(b)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养转化的破囊壶菌细胞。

2.依照权利要求1所述的方法，其中所述蔗糖酶是转化酶。

3.依照权利要求1或权利要求2所述的方法，其中所述蔗糖酶可操作地与信号肽连接。

4.依照权利要求1-3任一项所述的方法，其中编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属(Schizochytrium)中表达；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的多核苷酸序列。

5.依照权利要求1-4任一项所述的方法，进一步包括以包含编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列的核酸分子转化所述破囊壶菌细胞。

6.依照权利要求5所述的方法，其中编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；和经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列。

7.依照权利要求1-6任一项所述的方法，其中所述破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属(Thraustochytrium)的。

8.依照权利要求1-7任一项所述的方法产生的破囊壶菌细胞培养物。

9.一种破囊壶菌细胞，其包含核酸分子，所述核酸分子包含编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列。

10.依照权利要求9所述的细胞，其中所述蔗糖酶是转化酶。

11.依照权利要求9或权利要求10所述的细胞，其中所述蔗糖酶可操作地与信号肽连接。

12.依照权利要求9-11任一项所述的细胞，其中编码异源蔗糖酶的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列；编码登录号P00724或S33920的氨基酸序列的多核苷酸序列，其中所述多核苷酸序列经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达；和SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的多核苷酸序列。

13.依照权利要求9-12任一项所述的细胞，其中所述细胞进一步包含核酸分子，所述核酸分子包含编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列。

14.依照权利要求13所述的细胞，其中编码异源蔗糖转运蛋白的多核苷酸序列与选自下组的序列是至少90%相同的：登录号L47346或X69165的多核苷酸序列；和经密码子优化以供在裂殖壶菌属中表达的登录号L47346或X69165的多核苷酸序列。

15.依照权利要求9-14任一项所述的细胞，其中所述破囊壶菌是裂殖壶菌属或破囊壶菌属。

16.一种破囊壶菌培养物，其包含：

(a)权利要求9-15任一项所述的破囊壶菌细胞，和

(b)包含蔗糖作为碳源的细胞培养基。

17.一种生产破囊壶菌生物质的方法，该方法包括：

(a)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养权利要求9-15任一项所述的破囊壶菌细胞，并

(b)从所述培养基收获生物质。

18.一种生产微生物油的方法，该方法包括：

(a)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养权利要求9-15任一项所述的破囊壶菌细胞以生成生物质，并

(b)从所述生物质提取油。

19.一种生产用于动物或人的食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物的方法，该方法包括：

(a)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养权利要求9-15任一项所述的破囊壶菌细胞，

(b)从所述培养基收获生物质，并

(c)从所述生物质制备食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。

20.依照权利要求19所述的方法，进一步包括从所述生物质提取油并从所述油制备食品、化妆品、工业组合物、或药物组合物。

21.依照权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述食品是婴儿配方食品。

22.依照权利要求21所述的方法，其中所述婴儿配方食品适合早产儿。

23.依照权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述食品是牛奶、饮料、治疗性饮品、营养饮品或其组合。

24.依照权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述食品是用于动物或人的食物的添加剂。

25.依照权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述食品是营养补充剂。

26.依照权利要求19或权利要求20所述的方法，其中所述食品是动物饲料。

27.依照权利要求26所述的方法，其中所述动物饲料是水产养殖饲料。

28.依照权利要求26所述的方法，其中所述动物饲料是家畜饲料、动物园动物饲料、役畜饲料、牲畜饲料或其组合。

29.一种生产生物燃料的方法，该方法包括：

(a)在包含蔗糖作为碳源的培养基中培养权利要求9-15任一项所述的破囊壶菌细胞以生成生物质，

(b)从所述生物质提取油，并

(c)通过对油进行酯交换、裂化油、经由热解聚加工油、将油加入石油精炼过程，或其组合生产生物燃料。

30.依照权利要求29所述的方法，其中通过对油进行酯交换生产生物燃料。

31.依照权利要求29或权利要求30所述的方法，其中所述生物燃料是生物柴油。

32.依照权利要求29所述的方法，其中通过裂化油生产生物燃料。

33.依照权利要求29或权利要求32所述的方法，其中所述生物燃料是喷气生物燃料。

34.依照权利要求29所述的方法，其中通过经由热解聚加工油生产生物燃料。

35.依照权利要求29或权利要求34所述的方法，其中所述生物燃料是可再生柴油。

36.依照权利要求29所述的方法，其中通过将油加入石油精炼过程生产生物燃料。

37.依照权利要求29或权利要求36所述的方法，其中所述生物燃料是共处理的可再生柴油。

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