JP4047354B2 - ドコサヘキサエン酸（ｄｈａ）の生産性の高い新規ラビリンチュラ類微生物およびその利用 - Google Patents

Description

本発明は、多価不飽和脂肪酸の一種であるドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の生産性に優れた新規ラビリンチュラ類微生物とその代表的な利用技術とに関するものであり、例えば、米ヌカ等の固形または半固形状の培地に接種しても十分な培養が可能であり、培養後に得られる固形または半固形培地を、そのままＤＨＡ含有組成物またはその原料として利用することが可能な新規ラビリンチュラ類微生物と、これを用いたＤＨＡおよびＤＨＡ含有組成物の製造方法とに関するものである。

ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）は、記憶改善作用や視力低下抑制作用等、種々の作用を有すると期待されており、栄養的価値が高い。そのためＤＨＡは、各種食品の添加物として用いられたり、いわゆるサプリメント等の健康補助食品または健康食品として製品化されたりしている。また、医薬品への応用も期待される。

現在、上記ＤＨＡの最も主要な供給源としては魚油が挙げられる。しかしながら、魚油をＤＨＡの供給源とするには次のような課題が存在する。まず、（１）魚油には独自の臭気（いわゆる魚臭さ）があるため、食品への添加した場合等、この臭気が製品としての品質や価値を損なう場合がある。（２）魚油中に含まれる各種長鎖高度不飽和脂肪酸は構造が類似しているため、高濃度のＤＨＡを得ることが困難である。（３）魚油は漁獲高が変動することが避けられないために、油脂原料の供給源として安定性に欠ける上、海洋汚染による油脂原料そのものの汚染の可能性が大きい。

そこで最近では、ＤＨＡの供給源として各種の微生物を用いることが広く試みられている。このような微生物の中でも、ラビリンチュラ類と呼ばれる非光合成性の単細胞微生物が最も有用であると考えられている。

ラビリンチュラ類は、狭義のラビリンチュラ類とヤブレツボカビ類とに大別される。以前は、狭義のラビリンチュラ類は原生動物界や菌界の生物等として認識される等しており、ヤブレツボカビ類は菌界のツボカビ類やミズカビ類等に分類されたりしていたが、最近では、クロミスタ界と呼ばれる新しい界に分類されることが一般的である。ただし、狭義のラビリンチュラ類とヤブレツボカビ類とがどの分類階級で分割されることが適当であるのかについては、研究者によって見解が異なっている。このように、ラビリンチュラ類（広義）は、最近になって研究が進んできた生物であって、分類も確立したとは言いがたい状況にある（非特許文献１参照）。

上記ラビリンチュラ類をＤＨＡの供給源として用いる技術は、すでに、アメリカ合衆国等では実用化されており、ＤＨＡ含有脂質の原料や、高ＤＨＡ含有飼料等が製品化されている。具体的には、例えば、トラウストキトリウム属、シゾキトリウム属の生育技術（特許文献１参照）、トロウストチトリアレ類、トロウストチトリアレ類から抽出されるω−３ＨＵＦＡ（高度不飽和脂肪酸）の利用技術（特許文献２参照）等が挙げられる。

一方、日本国内においても、ラビリンチュラ類をＤＨＡの供給源として用いる技術は種々開発されている。具体的には、例えば、ラビリンチュラ属の微生物であるＳ３−２株を利用する技術（特許文献３・４参照）、シゾキトリウム属の微生物であるＳＲ２１株およびその利用技術（特許文献５〜７参照）等が挙げられる。

ところで、公知のラビリンチュラ類微生物には海洋から発見されたものがほとんどであるため、その培養には、ある程度の塩化ナトリウム濃度が必要となる。言い換えれば、公知のラビリンチュラ類微生物においては、一般的には、その増殖に際して、培地中の塩化ナトリウム濃度を比較的高くする必要がある。そこで、ラビリンチュラ類微生物のこの性質を利用することにより、例えば、食品廃棄物を発酵処理して動物飼料とする技術が知られている（特許文献８）。

この技術では、特許文献３・４に開示されているＳ３−２株を用いて、残飯を培地代わりとして培養する。残飯等の食品廃棄物は塩分や油脂を多く含んでいるが、これらの成分は通常微生物処理が困難とされている。これに対して残飯を培地として用い、かつ、残飯中の塩化ナトリウム濃度を所定濃度以上に調節すれば、Ｓ３−２株を増殖させることができるとともに、ＤＨＡも生産される。その結果、この技術によれば、Ｓ３−２株で処理した残飯は、ＤＨＡを含む動物飼料として利用することが可能であるとされる。
特表平８−５０２４０５号公報（平成８年（１９９６）３月１９日公表、国際公開番号：ＷＯ９４／０８４６７、平成６年（１９９４）４月２８日国際公開、特許３１２７１６１号公報、平成１２年（２０００）１１月２日登録） 特表平８−５０９３５５号公報（平成８年（１９９６）１０月８日公表、国際公開番号：ＷＯ９１／０７４９８、平成３年（１９９１）５月３０日国際公開） 特開２００１−２７５６５６（平成１３年（２００１）１０月９日公開、特許第３４２５６２２号公報、平成１５年（２００３）５月９日登録） 特開２００３−０００２９２（平成１５年（２００３）１月７日公開） 特開平９−０００２８４号公報（平成９年（１９９７）１月７日公開、特許第２７６４５７２号、平成１０年（１９９８）４月３日登録） 特開平１０−０７２５９０号公報（平成１０年（１９９８）３月１７日公開） 特開平１０−３１０５５６号公報（平成１０年（１９９８）１１月２４日公開） 特開２００４−２９８７９８号公報（平成１６年（２００４）１０月２８日公開） 海洋と生物１３２（vol. 23 no. 1），4-17，2001

上述したように、ラビリンチュラ類をＤＨＡの供給源とする技術は一部実用化されており、また、実用化を目指して、ＤＨＡを生産する微生物が数多く単離されて、その性質が調べられている。しかしながら、ＤＨＡ含量が非常に高く、かつ低価格での培養が可能で、魚油に替わるＤＨＡの安価な供給源としての微生物、特にラビリンチュラ類の微生物については、実用化されているものは未だ少ない状況にある。

また、特許文献１・２には、ＤＨＡ含有飼料に関する技術も一部開示されているが、ラビリンチュラ類微生物をＤＨＡ含有飼料の製造に利用する技術も実用化には至っているものは数少ない。

さらに、上記特許文献１の技術は、低塩化物濃度でのトラウストキトリウム属、シゾキトリウム属の培養を主目的としており、上記属の微生物の大量培養には有効であると考えられる。しかしながら、当該特許文献１の技術は、実際には、トラウストキトリウム属やシゾキトリウム属の特定株をモデルとして確立されたものであるので、上記属に属さないラビリンチュラ類だけでなく、上記属に属するラビリンチュラ類であっても、その培養には必ずしも適さない場合も多いと考えられる。

また、特許文献８の技術はＳ３−２株を利用して、残飯等の有機質食品廃棄物を動物飼料等に転用することを図っているが、その実用性は十分ではない。まず、特許文献８では、培地（残飯等の有機食品廃棄物）の塩化ナトリウム濃度を少なくとも０．６質量％に調整することを開示しているが、さらに、培地の水分量を「６２〜７５％」に調整することも開示している。有機質食品廃棄物の種類にもよるが、本発明者の検討によれば、基本的には、固形分に添加する水分量が概ね６０％（ｖ／ｗ）を超えると固形分から水分が遊離し流動性を増していくことが分かっている。また、この文献に開示される実施例では、予め基本平板培地（寒天培地）にＳ３−２株を植菌して前培養してから、弁当残飯に人工海水を混合したものを塗布して本培養している。

つまり、この文献では、寒天培地上で微生物を予め前培養しておいて、この上に、水分量の多い残飯を塗布して後培養することを開示するのみであり、残飯そのものに微生物を接種して培養しているのではない。このような培養手法では、微生物は常に寒天培地の影響を受けるため、増殖しやすいと考えられる。

このように、特許文献８に開示される技術では、残飯等の有機質食品廃棄物のみを培地としてＳ３−２株が増殖できるか否かが不明であるので、この技術を用いて工業的に有機質食品廃棄物を処理して動物飼料を生産することが可能であるかは不明である。また、残飯への加水率が相対的に高いので、動物飼料への利用のためには水分を減らす処理（乾燥処理等）が必要になる上に、廃棄物処理という視点からは、被処理物（残飯等の有機食品廃棄物）の体積が相対的に増大するため効率性も高いとはいえない。これらの点も実用性の上からは不利であると考えられる。

本発明は上記課題に鑑みてなされたものであり、その目的は、これまでに無い新規な性質を有し、ＤＨＡの供給源として、従来とは異なる形態での利用が可能なラビリンチュラ類微生物と、その代表的な利用技術とを提供することにある。

本発明者らは、上記課題に鑑み鋭意検討した結果、従来よりも高いレベルでＤＨＡを生産する能力を有するヤブレツボカビ様の新規微生物を、沖縄県の河川水中から採取した葉から単離することに成功し、本発明を完成させるに至った。

すなわち、本発明にかかる新規ラビリンチュラ類微生物は、ＤＨＡの生産能を有する新規ラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８）である。このラビリンチュラ類微生物は配列番号１に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有している。また、本発明にかかるＤＨＡ含有組成物の製造方法は、培地に上記１２Ｂ株を接種して培養する培養工程を含むことを特徴としている。

上記培養工程で用いられる培地は、液体、固形、または形状保持性を有する半固形の何れかの形状を有していればよい。また、上記培養工程では、培地の形状が固形である場合に、当該培地に添加する水分量の下限を４５％（ｖ／ｗ）以上とすることが好ましく、水分量の上限を６０％（ｖ／ｗ）以下とすることが好ましい。特に好ましくは４５〜５０％の範囲内である。

さらに、上記培養工程では、静置培養または振盪培養の何れかを適宜選択することができる。また、上記培養工程では、上記培地として食品または飼料を用い、これに対して、上記ラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株を接種して培養することにより、当該食品または飼料にＤＨＡを含有させることができる。特に、上記食品または飼料として、米ヌカを用いることができる。

上記ＤＨＡ含有組成物の製造方法においては、培養後に得られる食品または飼料をさらに加工する加工工程を含んでいてもよい。また、上記培養により得られる微生物細胞、および、培養後の培地の少なくとも一方を、ＤＨＡ源として用い、当該ＤＨＡ源からＤＨＡ含有脂質を抽出する脂質抽出工程を含んでいてもよい。さらに、上記ＤＨＡ含有脂質からＤＨＡを分離するＤＨＡ分離工程と、分離したＤＨＡを食品または飼料、あるいはこれらの原料に添加するＤＨＡ配合工程とを含んでいてもよい。上記ＤＨＡ含有組成物の具体例としては、例えば、ＤＨＡ含有油脂またはＤＨＡ含有リン脂質を挙げることができる。

また、本発明には、培地に上記１２Ｂ株を接種して培養し、得られる微生物細胞、および、培養後の培地の少なくとも一方から、ＤＨＡを取得するＤＨＡの製造方法（生産方法）も含まれる。

本発明は、以上のように、ＤＨＡを産生する新規微生物として取得されたラビリンチュラ類１２Ｂ株とその利用技術である。この新規微生物は、形態学的・生理学的性質、およびｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の違い等から、新しい種であると判断され、従来知られている類似微生物よりも生育速度が大きく、培養液１リットル当りの細胞の収量やＤＨＡの生産量も高いので、ＤＨＡ供給微生物としてより効率的に利用することができる。

しかも、この新規微生物は、例えば米ヌカを含む培地（柔らかな固形状態）でも増殖が可能であるという特性を有している。そのため、固形物をベースとした培地での培養を行うことにより、直接家畜の飼料、ペットフードなどとして利用することが可能となる。このように、ＤＨＡを家畜へ投与すれば、当該家畜の健康保全に役立つだけではなく、食肉や鶏卵などにＤＨＡを取り込ませることができる。その結果、ＤＨＡやこれを用いた食品等の製造に有用だけでなく、例えば上記畜産製品においても、より付加価値の高い製品を製造することが可能であるという効果を奏する。

本発明の一実施形態について説明すると以下の通りであるが、本発明はこれに限定されるものではない。

（１）本発明にかかる新規微生物
本発明にかかる新規微生物は、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）の生産能を有する新規ラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株である。この１２Ｂ株は、クロミスタ界（Kingdom Chromista）、不等毛門（Phylum Heterokonta）に属し、ラビリンチュラ鋼（Class Labyrinthulea）、ラビリンチュラ目（Order Labyrinthulida）に属すると考えられる。科（Family）以下の分類群に関しては、生理形態的性質に基づく分類と１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分類に整合性が乏しく、現在統一した見解が得られていないために、１２Ｂ株の帰属に関しては不明である。現時点で、今受け入れられている科以下の分類群に１２Ｂ株を強いて当てはめれば、その生理形態的性質と１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を考慮すると、ヤブレツボカビ科（Family Thraustochytriaceae）に属すると考えられる。つまり、当該１２Ｂ株は、より具体的には、ヤブレツボカビ類微生物１２Ｂ株（thraustochytrid strain 12B）と考えられる。ただし、１２Ｂ株の帰属は確定していないので、この表現は一時的なものである。

上記１２Ｂ株は、日本国千葉県木更津市かずさ鎌足２−５−８（郵便番号２９２−０８１８）に所在する、独立行政法人製品評価技術基盤機構（ＮＩＴＥ）の特許微生物寄託センター（ＮＰＭＤ）に寄託された。受領日（寄託日）は平成１７年１月２４日であり、受領番号はＮＩＴＥ ＡＰ−６８であり、受託番号はＮＩＴＥ Ｐ−６８である。

ラビリンチュラ類微生物としては、数多くの種がこれまでに見出されているが、本発明にかかるラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株は、後述する実施例に示すように、既知の種とは形態学的性質、生理学的性質、並びに１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列の違いから、公知の属に属さない全く新しい種であると考えられる。

具体的には、本発明にかかる１２Ｂ株は、亜熱帯汽水域のマングローブの落葉に由来する単細胞性真核微生物である。栄養細胞から外質ネットを形成し、栄養細胞は遊走子嚢に変化したのちに多数の遊走子を放出する時期がある。本発明にかかる１２Ｂ株は、これらの形態学的性質に加えて、(i) ＤＨＡを高い割合で合成し、オイルボディーとして細胞内に蓄積する、(ii) １８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が広義のラビリンチュラ類と高い相同性を有する、等の生理学的および分子生物学的性質から、広義のラビリンチュラ類微生物とみなすことができる。

一方で、本発明にかかる１２Ｂ株を既知のラビリンチュラ類、すなわちラビリンチュラ科のラビリンチュラ（Labyrinthula）属、ヤブレツボカビ科のラビリンチュロイド（Labyrinthuloides）属、コラロキトリウム（Corallochytrium）属、アプラノキトリウム（Aplanochytrium）属、アルトルニア（Althornia）属、ジャポノキトリウム（Japonochytrium）属、ウルケニア（Ulkenia）属、トラウストキトリウム（Thraustochytrium）属、およびシゾキトリウム（Schizochytrium）属の各属と比較すると、外質ネット内の滑走運動を行わないという点でラビリンチュラ属と、胞嚢（apophysis）を生じないという点でジャポノキトリウム属とは異なっている。また、本発明にかかる１２Ｂ株は、１個の栄養細胞の複数部位から外質ネットを生じる点において、栄養細胞の一箇所から多数の外質ネットを生じるラビリンチュロイド属、ウルケニア属、トラウストキトリウム属と異なっている。

さらに、本発明にかかる１２Ｂ株は、膜で囲まれた１個の桑実状の栄養細胞から多数の外質ネットを生じる場合がある点において、シゾキトリウム属を含む既知のいずれのラビリンチュラ類とも異なっている。加えて、本発明にかかる１２Ｂ株は、食作用または細胞融合とも考えられる特異な性質を有している。後述の実施例における〔１２Ｂ株の増殖過程の観察〕の項、および図１０（ａ）〜（ｄ）に示すように、本発明にかかる１２Ｂ株においては、ブドウ状細胞群から１つの大きな細胞になったものの中には近接する細胞を食作用により取り込む現象が見られる。なお、食作用や細胞融合は、公知のラビリンチュラ類では報告がない。さらに１２Ｂ株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子には４つの領域で塩基配列の多型がみられるが、この性質も従来知られているラビリンチュラ類では報告されていない特異な性質である。以上の結果から本発明にかかる１２Ｂ株は、広義のラビリンチュラ類微生物とみなすことができるものの、既存のいずれの属にも属さない新しい種であると考えられる。

ここで、これまで報告されているラビリンチュラ類微生物のうち、本発明にかかる１２Ｂ株にＤＨＡ生産性において近似すると考えられるシゾキトリウム属およびトラウストキトリウム属に属する株について、ＤＨＡの生産性をまとめて表１に示す。

これまで報告されているビリンチュラ類微生物の中では、シゾキトリウム・リマシナムＳＲ２１株（Schizochytrium limacinum SR21）（特許文献５〜７参照）が最も高いＤＨＡの生産性を示している。そこで、本発明にかかる１２Ｂ株と上記ＳＲ２１株との諸性質を比較すると、次の表２に示すようになる。

また、本発明にかかる１２Ｂ株と上記ＳＲ２１株とにおけるＤＨＡの生産性を比較すると、次の表３に示すようになる。

培養法がフラスコとジャーファーメンターとでは大きく異なるので、培養法別に比較すると、ＳＲ２１株のフラスコ培養では、ＤＨＡの生産性は、4,200ｍｇ／Ｌ／５日（840ｍｇ／Ｌ／日）であるのに対して、１２Ｂ株のフラスコ培養では、6294ｍｇ／Ｌ／２日（3,147ｍｇ／Ｌ／日）となり、１２Ｂ株が時間（日）当り約３．７倍という高い収量を示す。また、ＳＲ２１株のジャーファーメンター培養では、13,300ｍｇ／Ｌ／４日という高いＤＨＡ生産性を示すが、これは、3,325ｇ／Ｌ／日である。これに対して、１２Ｂ株のジャーファーメンター培養では、5,390ｍｇ／Ｌ／日であり、ジャーファーメンター培養でもＳＲ２１株は１２Ｂ株に比べてＤＨＡ生産性に劣る。

なお、１２Ｂ株は、培養上では、実質的にS. cerevisiae等の酵母類（単細胞の真核生物）と同様の取り扱いが可能であるため、工業的には、公知の発酵技術の延長線上にて利用することが可能である。さらに、上記食作用（細胞融合）を１２Ｂ株の品種改良に利用することも期待できる。

このように、本発明にかかる１２Ｂ株を用い、より迅速に高いＤＨＡ生産量を得ることができるとともに、工業的な実用性も優れたものとなっている。

（２）本発明にかかるＤＨＡの製造方法、およびＤＨＡ含有組成物の製造方法
本発明では、ＤＨＡの生産に上記１２Ｂ株を用いてもよいし、ＤＨＡを含有する組成物の製造に１２Ｂ株を用いてもよい。すなわち、本発明にかかるＤＨＡの製造方法（生産方法）、およびＤＨＡ含有組成物の製造方法は、上記１２Ｂ株を用いる方法であればよく、具体的な工程や条件は特に限定されるものではない。

本発明にかかるＤＨＡ含有組成物の製造方法では、培地に上記１２Ｂ株を接種して培養する培養工程を含んでいればよく、それ以外の工程としてはどのような工程を含んでいてもよい。なお、培養工程で液体培地を用いた場合、得られる培養後の液体培地、すなわち培養された１２Ｂ株細胞を含む液体培地を「培養液」と表現する。

上記培養工程で用いられる培地の種類は特に限定されるものではなく、１２Ｂ株が生育可能な培地であれば公知のどのような培地を用いてもよい。培地の形状としては、液体、固形、または形状保持性を有する半固形の何れかの形状であればよい。培地の成分も特に限定されるものではなく、炭素源（Ｃ源）、窒素源（Ｎ源）、ミネラル等の成分を含有しておればよい。

上記炭素源としては、後述する実施例に示すように、単糖としてＤ−グルコース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース等を、二糖以上のオリゴ糖類としてＤ−フルクトース等を利用することができる。また、グリセロールも利用することができる。窒素源やミネラル成分も特に限定されるものではなく、後述する実施例に示すように、ペプトンや酵母エキス（Yeast Extract）等の公知の培地成分を用いればよい。

特に本発明では、後述する実施例（〔１２Ｂ株の米ヌカ培地での増殖とＤＨＡ生産〕の項）に示すように、培地として米ヌカ等の固形物を用いることができる。米ヌカは、ウシ等の家畜や家禽の飼料として広く利用されている。それゆえ、飼料用の米ヌカにＤＨＡを含有させることができれば、家畜・家禽用飼料として付加価値を上げることができる。また、後述する実施例に示すように、１２Ｂ株はブドウ糖等の糖類を栄養源とできるだけでなく、米ヌカのみを栄養源として増殖することが可能である。したがって、米ヌカを培地として１２Ｂ株を接種し培養することにより、ＤＨＡ含有米ヌカを直接的に製造することができる。

ここで、１２Ｂ株は、固形成分から遊離した水分を含まない状態の培地（水分の全てが固形成分に吸い込まれている状態の培地）であっても培養することが可能である。言い換えれば、本発明にかかるＤＨＡ含有組成物の製造方法では、培養工程において、固形培養（または固体培養）を採用することができる。

後述する実施例では、１２Ｂ株の米ヌカ培地での培養において、通常の液体培養よりも流動性を低めた状態で１２Ｂ株の増殖（ＤＨＡの生産）を検討したが、このとき、米ヌカに対する水分含量（米ヌカに添加する水分量）が４５〜６６．７％（ｖ／ｗ）の範囲内であれば、１２Ｂ株は十分に増殖しＤＨＡを生産することが可能である（もちろん水分量が６６．７％を超えても十分有効に培養できる）。

また、米ヌカの場合、水分含量が６０％以下であれば、米ヌカとなじんでいない水分（固形成分から遊離した水分）は観察されない。そこで、本発明では、米ヌカを固形物の基準として採用し、固形物に対する水分含量が６０％（ｖ／ｗ）以下のものを培地として用いた培養を「固形培養（または固体培養）」と定義する。

なお、本明細書では、固形培養に対する液体培養は、通常の液体培地のように、液体としての十分な流動性を有する培地で培養することを指す。また、半固形培養は、水分含量が６０％を超え、かつ、形状保持性を有する程度の粘性を有する培地（半固形培地）で培養することを指すものとする。本発明にかかる１２Ｂ株は、固形培養、半固形培養、液体培養の何れであっても十分有効に増殖することができる。したがって、上記培養工程では、培地成分の種類や培養条件等によって、上記固形培養、半固形培養、液体培養の何れを選択してもよい。

また、米ヌカ等の固形物を培地として用いる際の具体的な条件は特に限定されるものではないが、まず、後述する実施例に示すように、米ヌカに１２Ｂ株を接種した後、静置培養よりも振盪培養する方がＤＨＡの生産性が高いため好ましい。それゆえＤＨＡの生産効率を向上する観点から見れば、培養工程では、振盪培養を採用することが好ましい。ただし、後述する実施例に示すように、静置培養した場合でも量や比率は低いもののＤＨＡは検出される。１２Ｂ株の培養においては、固形物、半固形物、液体に関わらず、培地中のＤＨＡ含量を１２Ｂ株の増殖の指標とすることができる。１２Ｂ株は振盪しない状態でもある程度増殖してＤＨＡを生産することが可能である。それゆえ、本発明では、培養工程として振盪せずに静置培養を採用することもできる。

また、固形物に添加する水分、すなわち固形培養における培地の水分含量についても特に限定されるものではないが、その下限は、ある程度のＤＨＡの生産効率を得たい場合には４５％（ｖ／ｗ）以上であればよい。一方、上限は特に限定されるものではなく、固形培養、半固形培養または液体培養の何れを採用するかによって適宜設定すればよい。固形培養を採用する場合には、水分含量の上限は６０％（ｖ／ｗ）以下であればよく、５０％（ｖ／ｗ）であることが好ましい。

水分含量が５０％（ｖ／ｗ）であれば、水分が遊離していない固形状であるので、そのまま飼料等に利用することができる。また、水分含量をより低下させて乾燥物とすることも容易である。さらに、５０％（ｖ／ｗ）程度の水分含量を確保できれば、ＤＨＡの生産効率の大幅な低減を回避することができる。それゆえ、有効なＤＨＡの生産効率を達成するとともに乾燥工程を省いたり簡素化したりできる観点から水分含量は４５〜５０％（ｖ／ｗ）の範囲内であることが好ましい。

さらに、後述する実施例に示すように、１２Ｂ株を米ヌカ培養するにおいて、米ヌカに海水を添加せずに塩化ナトリウム等の海水成分を含まない水（便宜上、「真水」と称する）を添加した場合であっても、十分な量のＤＨＡが生産される。それゆえ、培養工程では、添加する水分は海水に限定されるものではなく、固形物の種類に応じて適宜、真水を添加することができる。

このように、本発明では、上記培養工程において、培地として米ヌカ等の飼料（あるいは食品そのもの）を用い、これに対して、上記１２Ｂ株を接種して培養することが可能である。これにより、当該飼料または食品にＤＨＡを含有させることができる。培地として利用可能な飼料または食品としては、上記米ヌカ以外に、例えば、小麦フスマ、小麦ヌカ等のヌカ類の他、コーングルテンフィード、コーングルテンミール、デンプン粕、糖蜜、ビートパルプ等の農産物製造粕類、醤油粕、ビール粕等の加工食品製造廃棄物等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

加えて、１２Ｂ株は、上記農産物製造粕類や加工食品製造廃棄物以外にも、米ヌカに類似する成分を有する固形物も培地として利用することが可能である。米ヌカは米油の原料としても用いられるように脂質を多く含む（一般に、１５〜２０重量％程度）が、１２Ｂ株はこのような脂質を多く含む培地であっても培養が可能である。したがって、本発明において、固形培養に用いられる固形分は米ヌカに限定されるものではなく、例えば、家庭や食堂・レストラン等から生ごみとして排出される残飯等も用いることができる。

また、上記のように、培養工程において、飼料または食品を培地として用いた場合（固形培養に限定されない）、培養後に得られる飼料または食品（培養後に得られる培地、１２Ｂ株の細胞も含む）をそのまま用いてもよいが、これらを加工してもよい。例えば、上記米ヌカの場合、培養後に得られるＤＨＡ含有米ヌカをそのまま飼料として用いてもよいが、加熱等により１２Ｂ株を殺菌したり、ＤＨＡ含有米ヌカを粒子状に固める加工を行ったりしてもよい。このように、本発明にかかるＤＨＡ含有組成物の製造方法では、上記培養後に得られる飼料または食品をさらに加工する加工工程を含んでいてもよい。

また、本発明にかかるＤＨＡ含有組成物の製造方法では、液体培養等により得られる１２Ｂ株の細胞、１２Ｂ株を除いた培養後の培地、またはその両方をＤＨＡ源として用い、これらからＤＨＡ含有脂質を抽出し、これをＤＨＡ含有組成物として用いてもよいし、他の食品や飼料等に配合して用いることもできる。すなわち、本発明にかかるＤＨＡ含有組成物の製造方法では、ＤＨＡ含有脂質を抽出する脂質抽出工程を含んでいてもよい。１２Ｂ株の細胞や培地等からＤＨＡ含有脂質を抽出する方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。また、抽出したＤＨＡ含有脂質からＤＨＡを分離するＤＨＡ分離工程を含んでいてもよい。ＤＨＡ含有脂質からＤＨＡを分離する方法も特に限定されるものではなく、従来公知の方法を好適に用いることができる。

本発明では、１２Ｂ株における全脂肪酸中のＤＨＡの含有量は、他のラビリンチュラ類微生物に比べても高いものとなっている。そのため、細胞または培地から抽出した粗製の脂質には、高い割合でＤＨＡが含有されている。それゆえ、このような粗製の脂質（ＤＨＡ含有脂質）をそのまま用いてもよいし、さらに、公知の方法で精製することにより、より純度の高いＤＨＡを取得してもよい。いずれにしても、粗製の脂質中に含まれるＤＨＡ含量が高いため、本発明では、効率的なＤＨＡ利用が可能となる。このように、本発明では、ＤＨＡ含有粗製物だけではなく、ＤＨＡの生産そのものも容易化することができる。

抽出されたＤＨＡ含有脂質または精製されたＤＨＡは、そのまま食品、食品添加物、飼料用添加物、医薬品等に用いることができるが、他の食品や飼料、医薬品、あるいはこれらの原料に添加して配合してもよい。すなわち、本発明にかかるＤＨＡ含有組成物の製造方法には、ＤＨＡ配合工程が含まれていてもよい。

ＤＨＡまたはＤＨＡ含有脂質を配合する対象は、特に限定されるものではなく、公知の食品や飼料、医薬品等を挙げることができる。具体的には、食品としては例えば、ビスケット、クッキー、ケーキ、キャンデー、チョコレート、チューインガム、和菓子等の菓子類；パン、麺類、ごはん、豆腐もしくはその加工品；清酒、薬用酒等の発酵食品；みりん、食酢、醤油、味噌、ドレッシング等の調味料；ヨーグルト、ハム、ベーコン、ソーセージ、マヨネーズ等の畜農食品；かまぼこ、揚げ天、はんぺん等の水産食品；果汁飲料、清涼飲料、スポーツ飲料、アルコール飲料、茶などの飲料等の形態が挙げられるが、特に限定されるものではない。なお、ＤＨＡは脂質であるため、飲料等といった水分の多い食品へ添加する場合には、公知の乳化剤等を併用することができる。

また、本発明では、サプリメントにＤＨＡを配合してもよい。サプリメントの形状は特に限定されるものではなく、液体製剤であってもよいし、固形製剤であってもよいし、それ以外の形状であってもよい。また、サプリメントに含有される他の成分も特に限定されるものではなく、製剤技術分野において通常使用し得る公知の添加剤等を挙げることができる。このような添加剤としては、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯味剤、安定化剤等を挙げることができるが、特に限定されるものではない。

さらに、本発明では、上記食品を、自然流動食、半消化態栄養食もしくは成分栄養食、またはドリンク剤等の加工形態としたり、例えば、医師の食事箋に基づく栄養士の管理の下に、病院給食の調理の際に、任意の食品に対して添加・配合し、その場で調製した食品の形態で患者に与えたりすることもできる。

また、本発明では、粗製のＤＨＡ含有脂質からＤＨＡを高純度に精製することが容易であるため、目的に応じて、薬学的組成物すなわち医薬品として用いることもできる。医薬品の形態等は特に限定されるものではなく、上記サプリメントと同様であればよい。

ここで、上記したように、上記ＤＨＡ含有脂質はそのままＤＨＡ含有組成物として用いることができるが、当該ＤＨＡ含有脂質としては、油脂（脂肪）のような単純脂質だけでなく、リン脂質のような複合脂質または極性脂質も含まれる。脂質は、一般に、脂肪（油脂またはトリアシルグリセロール）等の単純脂質、脂肪酸、ステロール等の誘導脂質、リン脂質、糖脂質等の複合脂質とに大別することができる。ここで、上記１２Ｂ株から抽出される脂質の大部分、具体的には９０〜９５重量％は脂肪であるが、リン脂質も含有されるので、１２Ｂ株細胞は、脂肪等の単純脂質の抽出素材だけでなく、リン脂質等の複合脂質または極性脂質の抽出素材としても利用することができる。

特に、１２Ｂ株細胞から得られるリン脂質画分には脂肪画分よりも多くのＤＨＡが含まれている上に、リン脂質は、例えば抗ガン作用等、脂肪には見られない機能を有していることも知られている。したがって、ＤＨＡ含有リン脂質は、ＤＨＡ含有油脂（ＤＨＡ含有脂肪）とは異なる有用な組成物として利用することができる。

上記ＤＨＡ含有脂質の製造方法は、上述したＤＨＡ含有組成物の製造方法に従えばよく、特に限定されるものではない。すなわち、上記抽出工程で得られたＤＨＡ含有脂質から従来公知の方法で油脂（脂肪）画分を分離すればＤＨＡ含有油脂とすることができ、同じく上記ＤＨＡ含有脂質からリン脂質画分を分離すればＤＨＡ含有リン脂質とすることができる。

（３）本発明の利用
本発明の利用分野は特に限定されるものではなく、ＤＨＡを効率的に生産したり、ＤＨＡ含有粗製物を効率的に製造したりする分野に広く利用することができる。特に、上記のように、サプリメント等の食品、飼料、医薬品等の製造や、これらの原料としてのＤＨＡの製造に好適に用いることができる。

具体的な用途としては、単離したＤＨＡを、上記のように食品やサプリメント等に用いることが可能であり、細胞そのものも食品や飼料等として用いることが可能である。また、家畜や家禽、ペット等のヒト以外の動物に対するサプリメントとしても用いることができる。この場合、飼料やペットフードにＤＨＡまたは粗製のＤＨＡ含有脂質を配合してもよいし、別途製剤化して、必要に応じて飼料やペットフードに配合してもよい。また、１２Ｂ株の細胞は乾燥して用いることが好ましい。これにより細胞から水分が除去されるので、単位重量当たりのＤＨＡ含有量を増やすことができるとともに、飼料やペットフードへの加工もしやすくなる。乾燥方法は特に限定されるものではなく、従来公知の方法を用いればよい。

特に、本発明では、１２Ｂ株を、米ヌカなどをベースとした固形培地、半固形培地で培養することが可能である。それゆえ、ＤＨＡ含有米ヌカを直接的にほぼ１段階で製造することが可能になる。また、米ヌカに限らず、他の固形分（前述した他の穀物のヌカ類、農産物製造粕類、加工食品製造廃棄物、残飯等）を処理することで、ＤＨＡ含有飼料を簡素なプロセスで製造できるだけでなく、廃棄物を高付加価値の飼料に再利用することも可能である。さらに、得られたＤＨＡ含有飼料を他の飼料に配合したり、他の成分を添加したりすることで、適宜、用途に応じた飼料を製造することも可能となる。このように、ＤＨＡ含有飼料やペットフードをより安価に製造することが可能になるため、飼料・ペットフード用途に好適に利用することができる。

本発明について、実施例および図１〜１０に基づいてより具体的に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。当業者は本発明の範囲を逸脱することなく、種々の変更、修正、および改変を行うことができる。なお、以下の実施例では、重量％は単に「％」と記載する。また、以下の実施例にて用いた培地は次のようにして調製した。

〔培地〕
以下の実施例で用いたＢｙ＋培地、および、Ｆ培地は、表４に示す組成となるように各成分を秤量し、これら成分を蒸留水に添加して、均一に溶解または分散するまで攪拌し、オートクレーブにより滅菌して調製した。なお、寒天培地の場合は１％濃度となるようにアガーを加えた。

〔ＤＨＡ生産微生物の単離〕
ＤＨＡ生産微生物を単離する試料として、沖縄県西表島シーラ川河口近くのマングローブ林床（汽水域）から採集した落葉を用いた。落葉に付着している微生物をできるだけ多数培養するため、落葉を直接、ペニシリンＧおよびストレプトマイシン（各５０μＭ）を含むＢｙ＋寒天培地上に置き、２８℃で数日間培養した。

寒天プレート上に多数のコロニーの出現を確認した後、寒天プレートにＢｙ＋液体培地１５ｍｌを加え、コロニー全てを懸濁した。この懸濁液（約１３ｍｌ）を滅菌した５０ｍｌフラスコに移し、２８℃、１８０ｒｐｍで振盪培養した。数日間培養して、培養液の一部を新しい液体培地に接種し、同じ条件で数日間培養した。増殖の確認できた培養液を新しい培養液に移し、さらに培養を続けるという操作を６回くりかえした。

培養液の一部を19,000×ｇの遠心に供し、細胞を集めた。細胞（沈殿物）の一部にメタノール性２Ｍ ＨＣｌを加え、１００℃、１時間メタノリシスを行った。この処理によって得られた脂肪酸メチルエステルを３ｍｌのｎ−ヘキサンにより抽出した。脂肪酸メチルエステルは濃縮後、ガスクロマトグラフィにより分析し、ＤＨＡと考えられるピークの有無を確認した。さらに、継代して培養を重ね、それぞれの培養液から細胞を回収してそれぞれの脂肪酸組成を調べた。この操作を繰返すことによりＤＨＡの存在比が大きくなっていく微生物集団（培養液）を選び出した。

ＤＨＡ含量の最も大きい培養液をＢｙ＋寒天培地上に塗沫する操作（ストリーキング）を４〜５回繰返し行い、微生物を単離した。以上の操作の結果、ＤＨＡの含量が全脂肪酸の４０％以上を占める高ＤＨＡ生産微生物１２Ｂ株を単離した。１２Ｂ株の寒天培地上のコロニーは滑らかで、白色を呈した。２週間以上の培養でコロニーの色は微かなピンク色に変わった。

〔１２Ｂ株の同定：形態学的性質〕
１２Ｂ株は単細胞性であり、ペニシリンＧおよびストレプトマイシン存在下での生育が可能であることから単細胞性真核生物であると結論した。さらに、マングローブの林床に由来する試料から単離されたこと、ＤＨＡ含量が非常に高いことから不等毛類（Heteroconta）に属するヤブレツボカビ類（thraustochytrid）であることが予想された。

同定を行うために１２Ｂ株をスライドグラス上で培養し、その細胞を経時的に光学顕微鏡により観察した。まず、１２Ｂ株の前培養をＢｙ＋寒天平板培地を用い２８℃で行った。スライドグラス上にビニールテープで作った１ｃｍ四方のチャンバーを滅菌海水中で満たし、これに前培養した１２Ｂの細胞を接種して室温で培養した。培養開始後、光学顕微鏡で細胞を観察したところ数種類の形態が見られた。１２Ｂ株の光学顕微鏡写真像を図１〜図３に示す。

図１（ａ）は１２Ｂ株の単独の栄養細胞であり、栄養細胞から伸びている数本の外質ネットが確認できる。一方で、他のラビリンチュラ類に見られる多数の細胞からなる細胞塊の一部の細胞から多数の外質ネットを伸ばしているという細胞は観察されなかった。一方、図１（ｂ）に示すように、１２Ｂ株の膜で囲まれた一つの細胞が膜内で分裂をして桑の実状の細胞塊になり、その細胞が分岐した６~８本の外質ネットを伸ばしている状態が観察された。このような細胞はこれまでいずれのラビリンチュラ類においても報告されていない。

図２（ａ）・（ｂ）に示すように、１２Ｂ株は遊走子を含む遊走子嚢を形成する。１２Ｂ株はその液体培養の対数期において、多数の遊走子が観察される。また、光学顕微鏡により１２Ｂ株が２本の長さの異なる遊走子を持つことが観察されるが、図３に示すように、写真撮影しても短い鞭毛は明確な像を示さなかった。

上記１２Ｂ株の細胞内構造をより詳細に観察するために、上記１２Ｂ株の透過型電子顕微鏡写真を図４〜図５に示す。図４（ａ）・（ｂ）では、１２Ｂ株の細胞内構造を示しており、真核生物に特徴的な細胞小器官が観察される。また、図４（ａ）・（ｂ）に示すように、１２Ｂ株には、油滴塊（オイルボディー／リピッドボディー）と思われる電子密度の高い部分が観察されるが、図４（ａ）に示すように、この油滴塊が少数見られるものと、図４（ｂ）に示すように非常に広範囲に見られるものとが存在する。図５では、特に１２Ｂ株細胞における細胞壁を示している。同図から明らかなように、薄い鱗片が層状に重なった細胞壁の存在が確認できる。

〔１２Ｂ株の同定：生理学的性質〕
上記１２Ｂ株を１０ｍＬのＦ培地（ｐＨ７．５）を入れた５０ｍＬの三角フラスコに接種し、２８℃、１８０ｒｐｍの条件で２日間振盪培養した。一定時間毎に約５０〜１００μＬの培養液を無菌的に採取し、その一部を用いて６００ｎｍの吸光度を測定し、１２Ｂ株の増殖の程度を評価した。残りの培養液は遠心分離に供し、得られた細胞を１０ｍＬの１％塩化ナトリウムおよび蒸留水で各１回洗浄した。得られた細胞は凍結乾燥し、秤量した。凍結乾燥した細胞の一定量（１０ｍｇ）を用い、上記〔ＤＨＡ生産微生物の単離〕の項で説明したようにメタノリシスし、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフ分析に供し、脂肪酸組成を分析した。

上記１２Ｂ株の増殖曲線を図６に示す。縦軸が６００ｎｍの吸光度であり、横軸が培養時間（単位：hour）である。この増殖曲線から、１２Ｂ株の増殖速度は０．３７／ｈであり、これは１２．８分裂／日となる。この値は従来報告されているヤブレツボカビ類の最も高い増殖速度９．４分裂／日（USP 5,130,242参照）の１．４倍であった。

上記１２Ｂ株における培養後２日目の脂肪酸組成を表５に示す。なお、表５では、１２Ｂ株の脂肪酸組成と、これまで報告されている２種のヤブレツボカビ類の微生物（Aki 他, 2003）における脂肪酸組成と比較して示す。

表５の結果から明らかなように、１２Ｂ株におけるＤＨＡ、エイコサペンタエン酸（ＥＰＡ）、およびドコサペンタエン酸（ＤＰＡ）の含量はそれぞれ４０．６％、０．７％、および８．５％であり、１２Ｂ株から得られる脂肪酸は、ＤＨＡに富み、ＥＰＡ含量が非常に低い脂肪酸ことがわかった。また、１２Ｂ株から得られる脂肪酸のＤＨＡ含量は、公知の２種の微生物：ＫＨ１０５およびＳＲ２１両株のそれよりも高かった。さらに、１２Ｂ株の全ｎ−３多価不飽和脂肪酸に占めるＤＨＡの割合は８１．５％であった。

次に、１２Ｂ株における各種糖およびグリセロールの利用性を調べた。その結果を表６に示す。なお、表６において比較として挙げているＫＨ１０５株、ＳＲ２１株、S. aggregatum２株の結果は、表１に参照として挙げた文献に基づく。

表６の結果から明らかなように、１２Ｂ株においては、Ｄ−グルコース、Ｄ−フルクトース、Ｄ−マンノース、Ｄ−ガラクトース、およびグリセロールの利用性が認められたが、Ｌ−アラビノース、マルトース、セルビロース、可溶性デンプンは利用しなかった。この性質はＳＲ２１株とまったく同一であった。

〔１２Ｂ株の同定：分子生物学的性質〕
Ｂｙ＋培地を用いて液体培養をした１２Ｂ株を対数増殖期において回収し、セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）法を用いて全ゲノムＤＮＡを抽出した。得られたゲノムＤＮＡを鋳型とし、次の表７に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子に特異的なオリゴプライマーを用いてＰＣＲを行い、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を増幅した。これにより、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列をほぼ決定した。その塩基配列を配列番号１に示す。

配列番号１に示す１７２７ｂｐの塩基配列をＦＡＳＴＡにより検索した結果、トラウストキトリウム属（Thraustochytrium）Ａ５−２０株およびシゾキトリウム・リマシナム（Schizochytrium limacinum）ＳＲ２１株の相同する塩基配列とそれぞれ９６．３％、および９７．６％の一致性（identity）を示した。この結果に基づき、１２Ｂ株を含む類縁生物の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく分子系統樹を図７に示す。

ここで、１２Ｂ株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を決定する過程で、当該分子が多型性を有することを見出した。

まず、上記方法で行ったＰＣＲ産物のアガロース電気泳動の結果を図８に示す。当該ＰＣＲ産物はアガロース電気泳動上で１．８ｋｂｐのサイズを持つ単一のバンドを示す。このＰＣＲ産物を鋳型とし、次の表８に示す３組のオリゴプライマーにより断片Ａ〜Ｃの３つの部分に分けて直接法により塩基配列の決定を試みた。

ところが、断片Ａおよび断片Ｃでは塩基のシグナルが重複し、配列を決定することができなかった。そこで、断片ＣをＴＡクローニングして５個のクローンを得て、これらクローンの塩基配列を決定し、塩基配列の多型性を確認した。その結果を表９に示す。

表９の結果から、断片Ｃは部分配列の異なる少なくとも３種類の配列があることがわかった。そこで、断片Ｃに含まれる一部分を、新たに設計したオリゴプライマーによりＰＣＲで増幅した後、そのＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配電気泳動法（ＤＧＧＥ）により解析した。その結果、図９に示すように、複数のＤＮＡバンドが観察された。この結果からも１２Ｂ株の１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列は多型性を有することが証明された。

〔１２Ｂ株の増殖過程の観察〕
上記のように本発明にかかる１２Ｂ株は、外質ネット、不等鞭毛、鱗片状細胞壁といった形態学的性質を有することから、８属が含まれる広義のラビリンチュラ類と判断されるが、その一方で、既知のラビリンチュラ類には報告されていない性質、すなわち、細胞の形態が桑の実状を呈すること、その１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列が複数箇所で多型を示すことがあきらかとなった。

加えて１２Ｂ株について、ビデオ撮影することによりその増殖過程を詳細に観察したところ、公知のラビリンチュラ類では全く知られていない食作用または細胞融合と見られる特異な性質を有していることが明らかとなった。

まず、ビデオ撮影装置下でスライドガラスにビニールテープを貼ることによって１ｃｍ四方のチャンバーを作製した。次に、Ｂｙ＋培地を用いて１２Ｂ株を３０℃で１７−１９時間振盪培養した。この培養液に滅菌した爪楊枝の先端をつけて少量の細胞を採取し、これを同一の培地を入れたスライドグラス上の上記チャンバーに接種した。このチャンバーをカバーグラスで覆い、接種後速やかに室温条件でビデオ撮影を行った。

１２Ｂ株は培養開始約１２時間後に食作用と見られる行動を示した。ビデオの視界には活発に泳ぎ回る遊走細胞と動きの乏しいブドウ状の細胞群が認められた。このブドウ状の細胞群は互いに解離し、単一の遊走細胞となる場合と、細胞群が融合し１つの大きな細胞を形成する場合とがあることが分かった。

さらに、図１０（ａ）〜（ｄ）に示すように、ブドウ状細胞から１つの大きな細胞になったものの中には、近接する細胞を食作用により取り込む現象が見られた。図中の大きな矢印は大きな細胞、小さな矢印は遊走細胞を示し、各図中の左上には観察時間を記す。時系列は図１０（ａ）〜（ｄ）の順となっている。この図に示す過程から明らかなように遊走細胞は大きな細胞によって取り込まれている。したがって１２Ｂ株は、ラビリンチュラ類としては、その現象が知られていない食作用（または細胞融合）という特異な性質を有することが認められた。

このように、１２Ｂ株は、細胞が桑の実状を呈する時期があること、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子上で塩基配列の多型性を持つことと併せて、上記食作用を有していることから、公知のラビリンチュラ類８属の何れにも属さない、新規なものであることが示唆される。

〔１２Ｂ株のＤＨＡの生産性：ｐＨの影響〕
上記１２Ｂ株によるＤＨＡ生産性の向上（改善）を目的として、培養液のｐＨを４〜８の間で変化させることにより、細胞収量およびＤＨＡ生産性に対する影響を調べた。その結果を表１０に示す。なお、培地としてはＦ培地を用い、ｐＨ以外の培養条件は〔１２Ｂ株の同定：生理学的性質〕の項における培養条件に従った。

表１０に示すように、１２Ｂ株の培養においては、培養液１Ｌ当りの細胞乾燥重量はｐＨが高いほど高く、ｐＨ８で２３ｇ／Ｌであるのに対してｐＨ４では１４ｇ／Ｌであった。また、ＤＨＡの生産量もｐＨ８で最高値（6,294ｍｇ／Ｌ）を示した。これらの結果から、１２Ｂ株の培養には、中性から弱アルカリ性条件が適していることが分かる。公知の微生物のうち、ＳＲ２１株は、酸性条件、特にｐＨ４において最もＤＨＡ含量が高いため、ｐＨの影響については、１２Ｂ株とＳＲ２１株とは対照的な性質を有していることが明らかとなった。

〔１２Ｂ株のＤＨＡの生産性：グルコース濃度の影響〕
炭素源としてグルコース（ブドウ糖）を用いるとラビリンチュラ類の細胞収量が増加することが知られている。そこで、Ｆ培地中のグルコース濃度を５〜１５％の範囲内で変化させることにより、その細胞収量およびＤＨＡ生産性に対する影響を調べた。その結果を表１１に示す。なお、培養条件は〔１２Ｂ株の同定：生理学的性質〕の項における培養条件に従った。

表１１に示すように、１２Ｂ株は、グルコース濃度が８％の時に最大のＤＨＡ収量（１．４６ｇ／Ｌ／日）を得た。また、このときの増殖速度は０．４７／ｈ（１６．３分裂／日）であった。

〔１２Ｂ株のＤＨＡの生産性：海水濃度の影響〕
１２Ｂ株の培養において海水濃度の影響を見るために、Ｆ培地における海水濃度を０〜１００％の範囲内で変化させ、その細胞収量およびＤＨＡ生産性に対する影響を調べた。その結果を表１２に示す。なお、培養条件は〔１２Ｂ株の同定：生理学的性質〕の項における培養条件に従った。

表１２に示すように、１２Ｂ株は、海水濃度が５０％の時に最も高いＤＨＡ含量（2600ｍｇ／Ｌ）を示した。一方、１２Ｂ株は海水無添加でも増殖が可能であり、ＤＨＡの生産も見られた（３７０ｍｇ／Ｌ）。

〔１２Ｂ株のＤＨＡの生産性：培地に含まれる塩化ナトリウムの影響〕
上記のように、１２Ｂ株の培養においては、海水濃度がＤＨＡの生産性に影響を与えることが明らかとなった。そこで、海水に含有される塩の主成分である塩化ナトリウムの影響を調べた。具体的には、Ｆ培地のグルコース濃度を８％とするとともに、海水に代えて塩化ナトリウムを用いて、塩化ナトリウムの濃度を０〜１．５％の間で変化させることにより、細胞収量およびＤＨＡ生産性に対する影響を調べた。その結果を表１３に示す。なお、他の培養条件は、５０ｍＬフラスコを用いて１０ｍＬの培地で、培養温度３０℃、振盪条件１８０ｒｐｍ、培養時間２日間（４８時間）とした。

表１３に示すように、１２Ｂ株は、塩化ナトリウム濃度が高い方が、ＤＨＡ生産量および細胞収量を高くできることが分かる。

〔ジャーファーメンターによる１２Ｂ株の培養〕
ジャーファーメンターは、空気（酸素）の供給量を任意に変えることができるため、これを用いた培養では、一般的にフラスコで振盪培養する場合に比べて、微生物の増殖性（細胞の生産性）が高い。そこで、１２Ｂ株をジャーファーメンターで培養し、細胞の生産性を確認した。

ジャーファーメンターとしては、３Ｌの培養槽を備えているものを用いた。この培養槽に、グルコース濃度８％のＦ培地（ｐＨ８）を２Ｌ仕込み、培養温度３０℃、酸素供給量１Ｌ／分、攪拌速度３００〜５００ｒｐｍの条件で１２Ｂ株を培養した。培養開始から２４時間経過した後のＤＨＡの収量は５．３９ｇ／Ｌであった。

〔１２Ｂ株の米ヌカ培地での増殖とＤＨＡ生産〕
米ヌカはウシ等の家畜や家禽の飼料として広く利用されている。それゆえ、飼料用の米ヌカにＤＨＡを含有させることができれば、家畜・家禽用飼料として付加価値を上げることができる。そこで、米ヌカを培地に用いて１２Ｂ株を培養することにより、ＤＨＡ含有米ヌカの直接的な製造を試みた。

[i] 培地として米ヌカを用いることが可能か否かの検討
まず、５０ｍＬフラスコに米ヌカ２ｇを加え、これをベースにした３種類の培地Ｘ、Ｙ、およびＺを調製した。その組成を表１４に示す。なお、表１４中の真水とは、海水成分を含まない水（この場合、蒸留水）を指し、培地中の水分含量は６０％となる。また、下記の[ii]・[iii]の培養実験の対比に関し、水分含量のパーセントについては、培地重量に対する水分量であるとともに、海水の溶質の重量は誤差範囲と見なせるので、海水・真水に関わらず水１ｍｌ当たり１ｇとして、「重量％（％（ｗ／ｗ）、本実施例中では、単に「％」と略記）」も「％（ｖ／ｗ）」も等価と見なす。

次に、Ｆ培地を用いて２８℃で２５時間培養した１２Ｂ株の前培養液１５０μＬ（６００ｎｍの吸光度：１３）を培地Ｘ、Ｙ、Ｚに接種し、よく混合した上で、２８℃で４日間振盪培養した（振盪条件：１８０ｒｐｍ）。また、培地Ｚを用いた培養については、２８℃、４日間の静置培養も行った。培養後、１２Ｂ株を含む培地全体をメタノリシスに供し、得られた脂肪酸メチルエステルをガスクロマトグラフィによって分析した。その結果を表１５に示す。

表１５に示すように、培地から回収される全脂肪酸中のＤＨＡの割合は、１〜２％の範囲内であり、米ヌカ１ｇ当りのＤＨＡ含量（単位：ｍｇ ＤＨＡ／ｇ 米ヌカ）は約１〜４ｍｇであり、何れの値も培地Ｚを用いた時が最も高かった。なお、１２Ｂ株を接種しなかった各培地のゼロタイムでのＤＨＡ含量は検出限界以下であった。

培地Ｙよりも培地Ｚで培養した方がＤＨＡの含量が高くなる理由としては、１２Ｂ株がブドウ糖よりも米ヌカそのものを効率的に利用している可能性が見出される。培地Ｘは米ヌカと海水だけからなる培地であるが、ＤＨＡが検出された（０．９ｍｇ ＤＨＡ／ｇ 米ヌカ）。培地Ｚを用いて静置培養してもＤＨＡが検出されたが、その全脂肪酸中のＤＨＡの割合、ＤＨＡの収量とも振盪培養した場合に劣った。

[ii] 米ヌカを培地として用いる際の水分含量の検討
米ヌカに対して、水分含量が４５〜６６．７％（全培地に占める水分の割合（ｖ／ｗ））になるように水分（ブドウ糖を含むＦ培地と前培養液）を加えて、３０℃で７日間培養し、米ヌカに含まれるＤＨＡを定量した。培地ごとの水分含量、海水濃度、ＮａＣｌ濃度、ゼロタイム（培養開始時）および培養７日後におけるＤＨＡの増加量を表１６に示す。

なお、ゼロタイムのＤＨＡ含量は、接種に用いた前培養液（０．３ｍｌ）中のＤＨＡ量から計算によっても求めることができる。具体的には、前培養液の接種による持ちこみＤＨＡは１．３３ｍｇ ＤＨＡ／０．３ｍｌであるが、計算値は表１６に示すように培地に用いている米ヌカの重量により０．３６ｍｇ ＤＨＡ／ｇ 米ヌカから０．８９ｍｇ ＤＨＡ／ｇ 米ヌカの範囲で変動する。そこで、表１６の「ＤＨＡ含量」の項では、「ゼロタイム」および「ＤＨＡの増加率」の項において、上記計算値、および、当該計算値を１．０としたときの培養７日後におけるＤＨＡ量の増加率をそれぞれカッコ内に併記した。また、前培養液の海水濃度は５０％（ｖ／ｖ）とした。さらに、「塩濃度」の項における「水分中のＮａＣｌ濃度」および「培地中のＮａＣｌ濃度」の項では、海水のＮａＣｌ濃度を３．３％（ｗ／ｖ）として計算した。また、表中の「％」は全て「％（ｗ／ｖ）」を意味する。

表１６に示すように、米ヌカに対する水分含量が４５〜６６．７％（ｖ／ｗ）の範囲内であれば、水分含量が多いほど米ヌカ中のＤＨＡ含量（ｍｇ ＤＨＡ／ｇ 米ヌカ）は高くなる。ただし、水分含量４５％（ｖ／ｗ）であってもＤＨＡ含量は６ｍｇ ＤＨＡ／ｇ 米ヌカの値を示した。なお、米ヌカ中のＤＨＡ含量の増加は米ヌカ固形培地中での１２Ｂ株の増殖を示している。

ここで、水分含量が４５〜６６．７％（ｖ／ｗ）の範囲内で米ヌカの性状を確認すると、水分含量が６０％（ｖ／ｗ）以下であれば、全ての水分が米ヌカに吸収されているように見受けられ、米ヌカとなじんでいない水分は観察されなかった。そこで、本発明では、固形物（米ヌカ）に対する水分含量が６０％（ｖ／ｗ）以下のものを培地として用いた培養を「固形培養（または固体培養）」と定義する。

[iii] 米ヌカのみの培地に加える塩化ナトリウムの影響についての検討
前記[ii]の培養では、水分としてブドウ糖を含むＦ培地を加えた。しかしながら、固形培地のコスト、培養後の家畜による米ヌカそのものの炭素源および窒素源としての利用性を考慮すると、Ｆ培地は加えず、水分を加えるのみで固形培養が可能であることが望ましい。さらに、海水を使用しない、あるいはＮａＣｌを添加しないことも同様の効果があると考えられる。

そこで、Ｆ培地に由来する栄養源や海水の影響を排除するために、添加する水分含量を海水だけ、または海水成分を含まない水（真水）だけとした米ヌカ固形培地を調製し、１２Ｂ株の増殖とそれに伴うＤＨＡの生産性について検討した。なお、水分含量は海水および真水に関わらず５０％（ｖ／ｗ）に固定した。培地ごとの水分含量、海水濃度、ＮａＣｌ濃度、ゼロタイム及び培養７日後のＤＨＡ含量を表１７に示す。

なお、本培養実験では、海水は原液すなわち濃度１００％のものを用いたので、表１７中の「水分」の項における「海水」の項に記載した量（体積）は、海水濃度１００％の体積である。また、[ii]の培養と同じくゼロタイムのＤＨＡ含量は、接種に用いた前培養液中のＤＨＡ量から計算によっても求めることができる（具体的には、０．９３ｍｇ ＤＨＡ／０．３ｍｌなので、計算値では０．３１ｍｇ ＤＨＡ／ｇ 米ヌカ）となる。そこで、表１７の「ＤＨＡ含量」の項では、「ゼロタイム」の項において上記計算値をカッコ内に併記するとともに、「ＤＨＡの増加率」の項では、持ちこみＤＨＡ量を基にした増加率をカッコ内に併記している。さらに、[ii]の培養と同じく前培養液の海水濃度は５０％（ｖ／ｖ）とし、「塩濃度」の項における「水分中のＮａＣｌ濃度」および「培地中のＮａＣｌ濃度」の項では、海水のＮａＣｌ濃度を３．３％（ｗ／ｖ）として計算した。また、表中の「％」は全て「％（ｗ／ｖ）」を意味する。

表１７に示すように、水分濃度が５０％（ｖ／ｗ）海水である米ヌカ固形培地では、７日間の培養により７．３ｍｇＤＨＡ／ｇ米ヌカの収量が得られた。これにより、１２Ｂ株は米ヌカだけを栄養源として増殖が可能であることが明らかとなった。さらに、海水を添加しない場合（水分濃度が真水５０％（ｖ／ｗ）の場合、ただし前培養液中に含まれる海水および栄養物は加えていることになる）でも３．８ｍｇＤＨＡ／ｇ米ヌカの収量が得られた。

ここで、千葉県畜産センター養鶏試験場 飼養技術研究室の資料（「魚油を利用した高付加価値鶏卵を開発!!」、［online］、平成４年（１９９２）、千葉県 ちばの農林水産業農業改良課 試験研究情報 アクティブ・インフォメーション、［平成１８年１月２４日検索］、インターネット <URL : http://www.agri.pref.chiba.jp/nourinsui/07kairyo/gijyutu/active_info/92_yokei.html>）によれば、４％魚油（ＤＨＡ含量を１９．７％とする）を配合した鶏用飼料のＤＨＡ含量が０．８％程度となっている。それゆえ、１２Ｂ株を用いて上記５０％海水の米ヌカ固形培地で培養することでも、４％魚油を配合した場合にほぼ匹敵するＤＨＡ含量を得られることになる。

一方、市販されている犬用の粉ミルクであるゴールデンドッグミルク（（株）森乳サンワールド）はＤＨＡ配合がうたわれているが、その含量は２０ｍｇ ＤＨＡ／１００ｇ（０．０２％（ｗ／ｗ））であり、同様に市販されている、ＤＨＡを強化したとされる幼犬用固形飼料（Hill's Science Diet；日本ヒルズサイエンスダイエット（株））の場合は、０．１％（ｗ／ｗ）以上のＤＨＡ含量（製品の栄養成分表の記載はminimum 0.1% DHA（英文表記））であることから、本発明のＤＨＡ含有米ヌカは５０％真水のみを使用した固形培養であっても０．３８％（ｗ／ｗ）のＤＨＡを含むことから十分にＤＨＡが強化されていることになる。したがって、本発明のＤＨＡ含有米ヌカはそのままでも、あるいはこれを他の飼料と混合することによっても、十分に高いＤＨＡ含量を有する飼料として用いることができる。

さらに、上記ＤＨＡ含有米ヌカは水分含量が５０％であり、水分が遊離していない固形状であるので、このままでも飼料として利用できるし、水分含量を１０−２０％にまで低下させた乾燥物としても利用できる。

なお本発明は、以上説示した各構成に限定されるものではなく、特許請求の範囲に示した範囲で種々の変更が可能であり、異なる実施形態や実施例にそれぞれ開示された技術的手段を適宜組み合わせて得られる実施形態や実施例についても本発明の技術的範囲に含まれる。

以上のように、本発明では、公知のものと比較して、単位培養液当たり、および単位時間当たりのＤＨＡ生産量が格段に高いラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株を単離し、その微生物学的性格付けを行った。その結果、当該１２Ｂ株は、広義のラビリンチュラ類微生物とみなすことができるものの、既存のいずれの属にも属さない新しい種であると考えられた。また、当該１２Ｂ株を用いれば、ＤＨＡを効率的に生産できるとともに、例えば米ヌカ等の固形成分を培地として用いることができるため、新規な培養方法の開発も可能となった。そのため、本発明は、微生物を用いたＤＨＡの生産に代表される発酵産業の分野に利用することができるだけでなく、さらには、ＤＨＡを含有する食品または食品素材産業、ＤＨＡを含有する飼料を用いた畜産産業等、幅広い分野に応用することが可能である。

（ａ）は、本発明にかかる新規ラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株について、単独の栄養細胞の光学顕微鏡像を示す図であり、（ｂ）は、同１２Ｂ株における膜で囲まれた桑の実状となっている細胞塊の光学顕微鏡像を示す図である。 （ａ）・（ｂ）は、上記１２Ｂ株が形成する遊走子嚢の光学顕微鏡像を示す図である。 上記１２Ｂ株の遊走子の光学顕微鏡像を示す図である。 （ａ）・（ｂ）は、上記１２Ｂ株の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 上記１２Ｂ株細胞における細胞壁近傍の透過型電子顕微鏡像を示す図である。 上記１２Ｂ株を振盪培養した際の増殖曲線を示すグラフである。 上記１２Ｂ株および関連微生物における、１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列に基づく系統樹を示す図である。 上記１２Ｂ株における１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子のＰＣＲ産物をアガロースゲル電気泳動にかけた結果を示す図である。 上記１２Ｂ株における１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の断片ＣのＰＣＲ産物を変性剤濃度勾配電気泳動法（ＤＧＧＥ）にかけた結果を示す図である。 （ａ）〜（ｄ）は、上記１２Ｂ株の増殖過程において、大きな細胞が遊走細胞を取り込んでいく過程（食作用または細胞融合）を示す図である。

Claims (11)

1. ドコサヘキサエン酸の生産能を有する新規ラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８）。
2. 配列番号１に示す１８Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を有する請求項１に記載のラビリンチュラ類微生物。
3. ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を含有する組成物の製造方法であって、
   培地にラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８）を接種して培養する培養工程を含むことを特徴とするＤＨＡ含有組成物の製造方法。
4. 上記培養工程で用いられる培地は、液体、固形、または形状保持性を有する半固形の何れかの形状を有していることを特徴とする請求項３に記載のＤＨＡ含有組成物の製造方法。
5. 上記培養工程では、培地の形状が固形である場合に、当該培地に添加する水分量の下限を４５％（ｖ／ｗ）以上とすることを特徴とする請求項４に記載のＤＨＡ含有組成物の製造方法。
6. 上記培養工程では、培地の形状が固形である場合に、当該培地に添加する水分量の上限を６０％（ｖ／ｗ）以下とすることを特徴とする請求項４または５に記載のＤＨＡ含有組成物の製造方法。
7. 上記培養工程では、静置培養または振盪培養の何れかが選択されることを特徴とする請求項３ないし６の何れか１項に記載のＤＨＡ含有組成物の製造方法。
8. 上記培養工程では、上記培地として食品または飼料を用い、これに対して、上記ラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株を接種して培養することにより、当該食品または飼料にＤＨＡを含有させることを特徴とする請求項３ないし７の何れか１項に記載のＤＨＡ含有組成物の製造方法。
9. 上記食品または飼料が、米ヌカであることを特徴とする請求項８に記載のＤＨＡ含有組成物の製造方法。
10. 上記ドコサヘキサエン酸含有組成物が、ＤＨＡ含有油脂またはＤＨＡ含有リン脂質であることを特徴とする請求項３ないし９の何れか１項に記載のＤＨＡ含有組成物の製造方法。
11. 培地にラビリンチュラ類微生物１２Ｂ株（受託番号ＮＩＴＥ Ｐ−６８）を接種して培養し、得られる微生物細胞、および、培養後の培地の少なくとも一方から、ドコサヘキサエン酸（ＤＨＡ）を取得することを特徴とするＤＨＡの製造方法。