CN101892160B - 一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809及其工业应用 - Google Patents
一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809及其工业应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种海洋真菌裂殖壶菌LX0809，其具有高产二十二碳六烯酸(DHA)的能力。本发明所述的裂殖壶菌LX0809分离自辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩里采集的腐土，已于2009年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.3535，所述裂殖壶菌LX0809通过补料发酵，发酵液的细胞干重可达到72.5g/L，DHA的产量达到15.3g/L。LX0809菌体细胞及其提取物既可用作食用油、乳制品和谷物制品等的食品添加剂，也可作为水产和畜牧养殖等的饲料添加剂。菌体细胞中的饱和甘油三酯，经催化转酯化反应可制得生物柴油。
Description
技术领域
本发明涉及海洋微生物的应用技术，具体讲是一种海洋真菌裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809及其在食品和饲料添加剂和生物柴油工业生产中的应用。其属于微生物应用技术领域。
背景技术
营养学和医学研究表明，DHA是一种重要的营养保健品，可有效增进健康和抵御疾病侵扰。DHA是人脑神经细胞膜中主要的脂质成分，也是大脑、神经和视觉细胞中重要的脂肪酸成分，对人体生理功能的正常发挥及多种疾病的防治有着重要作用，特别是在婴幼儿大脑和视觉系统发育过程中占有十分重要的地位。DHA参与婴儿大脑组织(如脑囊泡，髓磷脂和线粒体)发育。世界卫生组织强烈建议在婴儿食品中添加DHA。
DHA可以从海洋鱼油中提取，也可以通过海洋微生物发酵获得。鱼油DHA生产成本低，价格便宜，但是鱼油中常含有的滴滴涕、化学杀虫剂、多氯联苯类物质、二恶英和六氯苯等有害物质。纯种海洋微生物从纯种培养到精炼都需严格消毒，无菌操作，并可采用国际认可的食品安全生产及控制管理技术，所生产的油脂纯度高、无污染，可做到不含或仅含微量EPA，而且DHA稳定，不含鱼腥味。
到目前为止，已有上百个品种海洋微生物的脂肪酸组成中含有DHA。它们隶属于硅藻类、金藻类、绿藻类、甲藻类、隐甲藻类、蓝藻类和黄藻类。其中研究最多的菌种有三角褐指藻、小球藻、盐藻、中肋骨条藻、新月菱形藻、裂殖壶菌等。其中最有应用价值和发展潜力的海洋微生物是破囊壶菌科的(Thraustochytriaceae)的裂殖壶菌(Schizochytrium)。它具有生产周期短、培养简单、细胞内脂肪酸和DHA含量高等优势，被认为是一种具有潜力的DHA的新生资源，是目前进行工业化培养作为DHA来源最理想的物种之一。 裂殖壶菌的安全性已经得到美国食品和药品部(FDA)的认可，并开发了从医药、食品以及饲料等一系列产品。
授权公告号为CN1648233A的专利公开了一种以裂殖壶菌SR21的菌株为出发菌株，通过化学和物理诱变相结合而得到的一株突变株OUC88，通过优化菌株的培养条件下，培养后期补加碳源，发酵液的细胞干重达到25g/l，DHA含量达到8.27g/l。无论是发酵液的细胞干重，还是DHA含量菌株OUC88均显著低于本发明所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌株。
授权公告号为CN1916156A的专利公开了一种以裂殖壶菌WZU4771菌株及其在制备DHA粉末和DHA油脂中的应用。该菌株在优化的培养条件下培养5天，发酵液的细胞干重达到42.15g/l，DHA含量达到14.1g/l。发酵液的细胞干重明显低于本发明所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌株，DHA含量也略低于本发明所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌株，发酵培养时间也长于本发明，不利于规模化生产。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的是提供一种生产周期更短、菌体细胞生物量增加更快、易于规模化培养并高产二十二碳六烯酸的裂殖壶菌菌株。在含有30～50g/L葡萄糖为碳源，1～10g/L的玉米浆为氮源，包括钠盐、钾盐、镁盐、锰盐、硼化物、溴化物及其混合物的无机盐，pH为4.5～8.0的发酵培养基中20～30℃培养80～100小时，得到含有长链多不饱和脂肪酸的油脂，包括二十二碳六烯酸(DHA)和二十二碳五烯酸(DPA)。
本发明所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)是以从辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩里(东经122°01′，北纬41°11′)采集的腐土上分离的菌株裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809，该菌株已于2009年12月23日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.3535，其具体的筛选步骤如下：
1、初筛：取盘锦市沿海滩涂里的腐土接种在所述的初筛培养基(葡萄糖10g/l，酵母粉2g/l，蛋白胨1g/l，青霉素0.5g/l，链霉素0.5g/l，琼脂15g/l，用盘锦市海域海水稀释10倍后配制)平板上，30℃培养3天。挑取培养物转接到新的平板上进行培养，划线分离得到纯培养物。
2、复筛：将纯培养物接种到所述的复筛培养基(葡萄糖40g/l，酵母粉5g/l，蛋白胨3g/l，用盘锦市海域海水稀释10倍后配制)中，在摇床上培养。离心分离得到培养物，真空干燥至恒重，称量细胞干重。索氏提取法检测细胞干重中的脂肪含量，气相色谱法检测脂肪中的DHA含量，以发酵液细胞干重和DHA产率为指标，筛选得到高产菌株，命名为LX0809。
本发明所述的LX0809在在扫描和透视电镜下观察所述的高产DHA的菌株的外部形态和超微结构，其特征为：营养菌体为椭圆球形，由不连续的细胞壁包裹着，单核。细胞壁由几层紧压在一起的致密鳞片构成，在细胞壁不连续处可分辨鳞片，鳞片厚约2～3纳米。形成放射状的、根状的外质网依附在底物上，外质网产生于外质网形成体，从细胞壁不连续出长出。行无性繁殖，由营养菌体转化为游动孢子囊，其内有许多游动孢子。在游动孢子生成过程中，细胞质分裂紧接着每次细胞核分裂进行，并且形成四倍体细胞。游动孢子侧生着不等长的双鞭毛，前向鞭毛两边排列茸鞭茸毛，后向鞭毛较短。
存在由鳞片构成的细胞壁、外质网形成体和外质网是现行的鉴定破囊壶菌科的标准。破囊壶菌的游动孢子形成机制有两种：(1)分裂细胞核分裂完全完成后进行细胞质分裂的阶段性和(2)细胞质分裂紧接着每次细胞核分裂进行的连续性分裂。连续性分裂可以形成四倍体细胞。以连续性分裂形成游动孢子，产生四倍体细胞，是裂殖壶菌的特征。因此，所述的高产DHA的诱变菌株鉴定为裂殖壶菌，命名为裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809。
所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809在不同时间内的培养基中发酵所得细胞干重和DHA产量如图1所示。发酵液离心后真空干燥得到菌体 干粉，然后菌体干粉经过正己烷萃取，减压蒸馏的到含有DHA毛油。毛油经过脱胶、脱酸、脱色、脱臭、脱蜡等工艺过程，加入抗氧化剂，混匀得到应用于食品的DHA油脂。经过气相色谱检测，油脂含量为细胞干重重量百分含量的40～55％，其中饱和脂肪酸占油脂重量百分含量的40～45％，不饱和脂肪酸占油脂重量百分含量的45～55％，其中DHA占油脂重量百分含量的35～40％，DPA占油脂重量百分含量的10～12％。可用作儿童和妇女的多不饱和脂肪酸补充的保健品，也可作为食用油、乳制品和谷物制品等的食品添加剂，也可作为水产和畜牧养殖等的饲料添加剂。以棕榈酸酯为主的甘油三酯经过催化转酯化反应制得棕榈酸甲酯，可以作为生物柴油使用。
本发明的优点在于：所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809能够以普通碳源(葡萄糖)和普通氮源(玉米浆)进行细胞生长和DHA积累；所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809通过培养基和培养条件优化，经过100小时发酵培养可达到细胞干重为72.5g/l，DHA含量达到15.3g/l，高于已见报道的菌株；裂殖壶菌(Schizochytrium)的安全性已经得到美国食品和药品部(Food and Drug Administration)的认可，可开发从医药、食品(尤其是孕妇、哺乳期妇女和儿童食品)以及饲料等一系列产品；所述裂殖壶菌LX0809的氨基酸种类平衡，并富含甲硫氨酸和赖氨酸等必需氨基酸，适合作为食品和饲料的添加剂；所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的长链多不饱和脂肪酸谱简单，除DHA外，只含有少量的DPA，利于DHA分离和纯化。
附图说明
图1为裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809(CGMCC3535)的在不同发酵时间下的细胞干重和DHA产量。
具体实施方式
实施实例1.裂殖壶菌的筛选
取辽宁省盘锦市大洼县赵圈河乡红海滩里采集的腐土，接种在所述的初 筛培养基平板上，在30℃下富集培养5天。挑取培养物转接到新的平板上进行培养，直到得到纯培养物为止。将纯培养物接种到装有50ml所述的复筛培养基的250ml摇瓶中，在200rpm的摇床上培养3天，培养温度为30℃。培养液经过离心(8000rpm，5分钟)、水洗后再离心，然后真空干燥(温度为60～80℃，真空度为80干帕)3小时，称量细胞干重。采用索氏提取法萃取细胞干粉中的油脂，然后用气相色谱法检测油脂中的脂肪酸组成，以DHA的产率作为指标，筛选出高产DHA的裂殖壶菌菌株，命名为LX0809。采用离子色谱分析法得到所得裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌株的氨基酸谱图见表1。
表1.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的氨基酸谱
| 氨基酸类型 | 占总氨基酸的重量百分比(％) |
| 天门冬氨酸 | 8.95 |
| 苏氨酸 | 4.80 |
| 丝氨酸 | 5.11 |
| 谷氨酸 | 15.97 |
| 脯氨酸 | 4.47 |
| 甘氨酸 | 4.79 |
| 丙氨酸 | 7.99 |
| 缬氨酸 | 7.35 |
| 甲硫氨酸 | 2.24 |
| 异亮氨酸 | 4.15 |
| 亮氨酸 | 7.67 |
| 酪氨酸 | 3.83 |
| 苯丙氨酸 | 4.15 |
| 组氨酸 | 1.92 |
| 赖氨酸 | 6.07 |
| 精氨酸 | 7.03 |
| 半胱氨酸 | 1.92 |
| 色氨酸 | 1.60 |
分析结果显示本发明所述的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的氨基酸种类及各种氨基酸的数量与营养需要量相符，并且富含甲硫氨酸(2.24％) 和赖氨酸(6.07％)等必需氨基酸。从氨基酸角度来看，裂殖壶菌LX0809也是作为食品膳食补充剂和饲料添加剂的理想来源。
实施实例2.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的发酵生产
将在斜面生长45小时的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌种接种至500ml摇瓶中。种子液和发酵培养基包括50g/L葡萄糖、10g/L玉米浆、5g/L氯化钠、2g/L氯化钾、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L氯化锰、0.01g/L硼酸、0.01g/L溴化钾。在30℃的摇床中以250rpm的转速培养至菌液的OD600达到1.0时完成第一代活化，然后取10ml菌液接种至上述新鲜培养基中，连续传三代(均以至菌液的OD600达到1.0时作为一代活化完成)，得到具有较高活力的种子液；再以1％的接种量将种子液接种至5L的发酵罐，搅拌转速300rpm，通气量3.0升/分钟，通过控制通气量和搅拌转速将发酵罐中溶解氧饱和度控制在40％(溶解氧饱和度(％)＝溶解氧实测含量/实测条件下溶解氧的饱和含量)，通过自动添加2.5M的硫酸或氢氧化钠维持pH在7.5。采用SBA-40C生物传感分析仪(山东省科学院生物研究所)测定发酵液中的葡萄糖含量，补料维持发酵液中的碳源和氮源浓度不变，90小时停止发酵。
发酵液经离心(贝克曼Allegra 64R台式高速冷冻离心机，8,000rpm，5分钟)弃上清，向离心管中加入与菌体相同体积的蒸馏水洗涤菌体细胞，然后再离心(贝克曼Allegra 64R台式高速冷冻离心机，10,000rpm，5分钟)弃上清。然后湿菌体经真空干燥(温度为60～80℃，真空度为80千帕)3小时，称量的干细胞72.3g/L。用正己烷萃取得到菌体油脂36ml/L。取1.0g萃取的油脂置于200ml园底烧瓶中，加入浓度为0.8M的氢氧化钾-甲醇溶液70.5ml，65℃水浴回流皂化15分钟；冷却后加入70ml 45％(w/v)的三氟化硼-乙醚，于65℃水浴回流10分钟甲酯化。冷却后加入60ml正己烷振荡2分钟，再加20ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置，收集上清液，减压蒸馏去除正己烷后即得到脂肪酸甲酯。气相色谱检测结果(表2)显示，所得的裂殖壶菌 LX0809的脂肪酸组成入表2所示。其中棕榈酸甘油三酯的含量最高，占油脂重量百分含量的40.4％；DHA(C22:6n3)含量较高，占油脂重量百分含量的38.0％，DPA(C22:5n6)含量次之，占油脂重量百分含量的10.5％，其它油脂总计仅占12％，易于提取纯化。
表2.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的脂肪酸谱
| 脂肪酸成分 | 占脂肪酸重量百分比(％) |
| C 14:0 | 2.91 |
| C 15:0 | 1.64 |
| C 16:0 | 40.4 |
| C 17:0 | 0.71 |
| C 18:0 | 1.61 |
| C 18:1n9 | 0.78 |
| C 18:2n6 | 0.28 |
| C 20:4n3 | 0.48 |
| C 20:5n3 | 0.90 |
| C22:5n6 | 10.0 |
| C22:5n3 | 0.60 |
| C22:6n3 | 38.0 |
| 其他 | 2.41 |
实施实例3.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的发酵生产
将在斜面生长45小时的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌种按照实施例2的方法活化，然后5％的接种量接种至5L发酵罐中。发酵培养基为：30g/L葡萄糖、1g/L玉米浆、5g/L氯化钠、2g/L氯化钾、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L氯化锰、0.01g/L硼酸、0.01g/L溴化钾。按照实施例2条件发酵80小时停止发酵，测得发酵液细胞干重为67.7g/L。用正己烷萃取得到菌体油脂32ml/L。取1.0g萃取的油脂置于200ml园底烧瓶中，加入浓度为0.8M的氢氧化钾-甲醇溶液70.5ml，65℃水浴回流皂化15分钟；冷却后加入70ml 45％(w/v)的三氟化硼-乙醚，于65℃水浴回流10分钟甲酯化。冷却后加入60ml正己烷振荡2分钟，再加20ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置，收集上清液， 减压蒸馏去除正己烷后即得到脂肪酸甲酯。菌体细胞油脂的脂肪酸谱如表3所示。其中棕榈酸甘油三酯的含量最高，占油脂重量百分含量的42.5％；DHA(C22:6n3)含量较高，占油脂重量百分含量的36.0％，DPA(C22:5n6)含量次之，占油脂重量百分含量的10.5％，其它油脂总计仅占11％，易于提取纯化和工业化生产。
表3.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的脂肪酸谱
| 脂肪酸成分 | 占脂肪酸重量百分比(％) |
| C 14:0 | 2.21 |
| C 15:0 | 1.34 |
| C 16:0 | 42.5 |
| C 17:0 | 0.71 |
| C 18:0 | 1.61 |
| C 18:1n9 | 0.78 |
| C 18:2n6 | 0.28 |
| C 20:4n3 | 0.16 |
| C 20:5n3 | 0.90 |
| C 22:5n6 | 10.5 |
| C 22:5n3 | 0.60 |
| C 22:6n3 | 36.0 |
| 其他 | 2.41 |
实施实例4.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的发酵生产
将在斜面生长45小时的裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌种按照实施例2的方法活化，然后5％的接种量接种至5L发酵罐中。发酵培养基为：40g/L葡萄糖、5g/L玉米浆、5g/L氯化钠、2g/L氯化钾、0.5g/L硫酸镁、0.05g/L氯化锰、0.01g/L硼酸、0.01g/L溴化钾。按照实施例2条件发酵90小时停止发酵，测得发酵液细胞干重为71.6g/L。用正己烷萃取得到菌体油脂105ml。取1.0g萃取的油脂置于200ml园底烧瓶中，加入浓度为0.8M的氢氧化钾-甲醇溶液70.5ml，65℃水浴回流皂化15分钟；冷却后加入70ml 45％(w/v)的三氟化硼-乙醚，于65℃水浴回流10分钟甲酯化。冷却后加入60ml 正己烷振荡2分钟，再加20ml饱和氯化钠溶液，振荡，静置，收集上清液，减压蒸馏去除正己烷后即得到脂肪酸甲酯。菌体细胞油脂的脂肪酸谱如表4所示。
表4.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的脂肪酸谱
| 脂肪酸成分 | 占脂肪酸重量百分比(％) |
| C 14:0 | 2.11 |
| C 15:0 | 1.64 |
| C 16:0 | 41.5 |
| C 17:0 | 0.71 |
| C 18:0 | 1.61 |
| C 18:1n9 | 0.78 |
| C 18:2n6 | 0.28 |
| C 20:4n3 | 0.48 |
| C 20:5n3 | 0.90 |
| C 22:5n6 | 10.0 |
| C 22:5n3 | 0.60 |
| C 22:6n3 | 37.0 |
| 其他 | 2.41 |
实施实例5.裂殖壶菌菌体细胞油脂的提取和精炼
取实施实例2所述裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的干燥细胞200g，用滤纸包裹后置于索氏提取器，用500ml正己烷浸出24小时，然后在减压蒸馏分离除去正己烷得到96ml毛油。毛油在搅拌下加入1ml浓度为95％的磷酸，再加入300ml热水混合均匀后。静置分层后取出上层毛油，用热水反复洗涤至pH值中性。然后在强烈的搅拌下，加入1ml浓度为8％的氢氧化钠溶液。加热至90℃，静置沉降，除去皂脚。再用50ml的90℃去离子水洗涤，然后真空干燥，干燥温度为60～80℃，真空度为80.0千帕。向干燥油脂中加入2.5g活性白土吸附脱色，脱色温度为90℃，脱色时间为20分钟。过滤除去活性白土。然后对油脂采用水蒸气气提脱臭，脱臭温度为180℃，脱臭时间为2小时。脱臭后油脂在慢速搅拌下，冷却至4～6℃左右，约24小时，使固 体脂肪生成较大结晶，沉淀析出。过滤分离得到39ml DHA含量80％以上液体油和43g固体脂肪。向液体油中加入抗氧化剂，得到富含DHA的成品油脂。
实施实例6.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809的规模化生产
按照实施实例4所述的方法，得到具有较高活力的种子液；然后将裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809菌液以5％的接种量将种子液接种至20吨发酵罐中，搅拌转速300rpm，通气量1.0vvm，通过控制通气量和搅拌转速将发酵罐中溶解氧饱和度控制在5～55％(溶解氧饱和度(％)＝溶解氧实测含量/实测条件下溶解氧的饱和含量)，通过自动添加2.5M的硫酸或氢氧化钠维持pH在5.5～7.5之间。采用SBA-40C生物传感分析仪测定发酵液中的葡萄糖含量，通过补料维持发酵液中葡萄糖浓度为40g/L，100小时停止发酵。用碟片离心机分离出菌体细胞，然后在气流干燥机中干燥得到1604kg菌体细胞(含水量低于8％)，然后干燥细胞在萃取罐中用正己烷萃取，萃取温度为40～50℃，板框过滤去除菌体碎片，然后在减压蒸馏分离正己烷得到748kg毛油。取374kg毛油按照实施实例4所述的方法对毛油进行脱胶、脱酸、脱色、脱臭和冬化处理，得到DHA含量80％以上液体油156kg和171kg固体脂肪。将固体脂肪171kg，置于酯交换反应器，加入4275kg甲醇和17kg的氢氧化钾，在65℃下反应1小时，沉降分层，取上层脂肪酸甲酯经分子蒸馏得到157kg生物柴油，产率达到92％。所得生物柴油以棕榈酸甲酯为主符合2#矿物柴油和相关国家制定的生物柴油的标准，可以作为矿物柴油的替代燃料使用。
实施实例7.裂殖壶菌(Schizochytrium)LX0809在食品和饲料中的应用
将上述实施实例6方法所得的发酵液经过121℃杀菌20分钟，经过碟式离心机脱水后送入旋转闪蒸干燥机中干燥得到含水量为5％的菌体干粉，可直接作为食品和饲料添加剂。将菌体干粉用正己烷萃取后得到毛油，减压蒸馏除去正己烷，然后将毛油通过脱胶、脱酸、脱色、脱臭处理得到含DHA重量百分含量为65％，可直接食用或与其它食用油一起食用。
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