CN114437947B - 高蛋白、高dha裂殖壶菌诱变株及其作为饲料添加剂的应用 - Google Patents

高蛋白、高dha裂殖壶菌诱变株及其作为饲料添加剂的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了高蛋白、高DHA裂殖壶菌诱变株及其作为饲料添加剂的应用。本发明提供了一株高蛋白质含量的裂殖壶藻诱变株B3，其蛋白质含量达到45.37%，DHA产量达到16.21g/L，其微生物保藏编号是：CGMCC No.40082。本发明还公开了一种高DHA裂殖壶菌诱变株的筛选方法，包括采用常压室温等离子体（ARTP）诱变裂殖壶藻细胞，将诱变株进行平板初步筛选和摇瓶复筛，其中，将诱变株进行平板初步筛选时，平板是丙二酸和2,2’‑联吡啶的复合筛选平板。采用本发明建立的筛选方法所筛选得到的裂殖壶菌诱变株的DHA产量及含量较原始藻株显著升高，说明本发明建立的筛选方法可以实现高DHA藻株的定向筛选。

Description

高蛋白、高DHA裂殖壶菌诱变株及其作为饲料添加剂的应用
技术领域
本发明涉及裂殖壶菌诱变株以及筛选方法，尤其涉及一株高蛋白以及高DHA含量的裂殖壶菌诱变株及其应用，本发明进一步涉及富DHA殖壶菌诱变株的筛选方法，属于裂殖壶菌诱变株及其应用领域。
背景技术
裂殖壶菌(Schizochytrium sp.)，又称裂壶藻，是一种海洋真菌，属于真菌中的卵囊菌纲、水霉目、脆霉壶菌科、裂殖壶菌属。该菌种由于 DHA 含量高、几乎不含EPA、质量稳定、脂肪酸组成易被人体利用、不含鱼腥味、不受重金属污染等优点，拥有替代鱼油DHA的绝对优势。其中裂殖壶菌是由于其生长迅速、DHA (二十二碳六烯酸，C22:6，ω-3)含量高、易于扩大培养等优势成为目前发酵法生产DHA研究最多的一种海洋真菌。
裂殖壶菌营养丰富，不仅含有大量的DHA，还含有蛋白质，脂肪，糖类等常规营养物质，可作为饲料添加剂直接在饲料中添加，或替代部分蛋白源和油脂在鱼类、虾类等水生动物以及蛋鸡中广泛应用，具有提高存活率，提高产品 DHA 含量，增强体色，促进脂肪代谢，提高非特异性免疫能力等功效，在动物生产中具有非常好的应用前景。
裂殖壶菌作为饲料添加剂使用，不仅要考虑到DHA含量的高低，作为动物营养的最重要成分之一的蛋白质，其含量的高低也应是重要的考虑因素。
现有技术中对于裂殖壶菌的诱变均是注重于获得DHA产量提升的突变株，没有注重考虑获得蛋白质含量显著提升的诱变株，导致现有的裂殖壶菌及其突变株均存在蛋白质含量偏低的缺陷，在作为饲料添加剂使用时会大大降低其营养价值。
发明内容
本发明的目的之一是提供一株高蛋白质含量、高DHA产量的裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）诱变株；
本发明的目的之二是提供一种高蛋白质含量、高DHA产量的裂殖壶菌诱变株的筛选方法；
本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：
本发明首先提供了一株高蛋白质含量、高DHA产量的裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）诱变株B3，其蛋白质含量达到45.37%，DHA产量达到16.21 g/L。
本发明将高蛋白质含量和高DHA产量的裂殖壶菌诱变株B3提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是：CGMCC No.40082；其分类命名是：裂殖壶菌 Schizochytrium sp.；保藏日期是2022年2月18日；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
本发明提供的高蛋白质含量和高DHA产量的裂殖壶菌诱变株B3由于具有较高的蛋白质含量以及产DHA能力，具有非常高的营养价值，可以制备成饲料添加剂添加到动物饲料中以补充动物的蛋白质以及DHA；此外，本发明提供的高DHA和高蛋白质含量的裂殖壶菌诱变株B3可以制备成富含蛋白质或DHA的保健品或食品。
另外，本发明提供的高蛋白质含量和高DHA产量的裂殖壶菌诱变株B3也具有较高的产DHA能力，因此，也可以采用常规发酵的方法进行发酵后从发酵产物中提取得到DHA。
本发明的另外一个目的是提供一种高DHA产量的裂殖壶菌诱变株的筛选方法，包括采用常压室温等离子体诱变裂殖壶藻细胞，将诱变株进行平板初步筛选和摇瓶复筛，其中，将诱变株进行平板初步筛选时，所述的平板是含丙二酸和2,2’-联吡啶的复合筛选平板。
作为本发明一种优选的具体实施方案，所述的由丙二酸和2,2’-联吡啶组成的复合筛选平板中，丙二酸的浓度是0.6 g/L，2,2’-联吡啶的浓度是20 μmol/L。
本发明利用常压室温等离子体诱变裂殖壶菌细胞，并设计采用丙二酸、2,2’-联吡啶及丙二酸-2,2’-联吡啶复合平板进行筛选，得到能够稳定遗传的高蛋白含量、高DHA含量的裂殖壶菌诱变株。在试验过程中，本发明共设处理组4个，分别为丙二酸筛选组、2,2’-联吡啶筛选组、丙二酸-2,2’-联吡啶筛选组及无筛选因子组，初步确定0.6 g/L丙二酸，60 μmol/L2,2’-联吡啶,0.6 g/L丙二酸+20 μmol/L2,2’-联吡啶为最适筛选浓度。进一步的筛选试验结果表明：1）丙二酸抗性藻株、2,2’联吡啶抗性藻株、2,2’联吡啶-丙二酸复合抗性藻株和无筛选因子诱变藻株的平均DHA产量与出发藻株相比得到显著提高，分别提高了30.42%、26.12% 、39.70%和19.26%，平板筛选藻株正向突变率达到88.70%。2）2,2’联吡啶-丙二酸复合组藻株藻体平均DHA的产量明显优于丙二酸组、2,2’联吡啶组和无筛选因子组，且2,2’联吡啶-丙二酸复合平板筛选出DHA产量含量最高藻株I-F-9，DHA含量达54.56%，DHA产量达10.88 g/L。
本发明进一步将I-F-9高产藻株进行连续诱变，经2,2’联吡啶-丙二酸高效筛选，得到DHA含量及产量进一步提高的高产藻株II-F-3，II-F-3藻株DHA产量达15.67g/L，与原始藻株相比提高151.12%，DHA含量达68.23%，与原始藻株相比提高95.50%。高产藻株DHA重量占藻体干重的比例由16.23%提高到了38.85%。将两藻株进行120 h连续发酵，结果显示，II-F-3藻株与原始藻株生物量，油脂产量无显著变化，但II-F-3藻株DHA产量及含量较原始藻株显著升高，说明2,2’联吡啶-丙二酸筛选方法可以实现高蛋白和高DHA藻株的定向筛选。
本发明采用所建立的2,2’联吡啶-丙二酸筛选方法筛选得到一株高蛋白质含量和高DHA产量的裂殖壶菌诱变株B3，其蛋白质含量高达45.37%，DHA产量达到16.21 g/L；该高DHA和高蛋白质含量的裂殖壶菌诱变株B3可以作为饲料添加剂添加到饲料中补充动物蛋白质或DHA，或者采用常规的发酵方式进行发酵培养，从发酵物中提取DHA。
附图说明
图1 裂殖壶菌ARTP诱变致死率曲线。
具体实施方式
以下结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
试验例1
一、富DHA裂殖壶菌诱变株的筛选方法的建立
㈠ 试验设计
本试验采用常压室温等离子体诱变裂殖壶藻细胞，设计使用丙二酸、2,2’-联吡啶及丙二酸-2,2’-联吡啶复合平板筛选出能够稳定遗传的高含油量、高DHA含量的裂殖壶藻藻株。
㈡菌株
裂殖壶藻（保藏编号GIM6.2，其它编号ATCC20888），购置于广东省微生物菌种保藏中心。
㈢培养基
固体培养基（g/L）：葡萄糖5，胰蛋白胨1，酵母粉1，琼脂20，人造海水34.4。
种子培养基（g/L）：葡萄糖30，胰蛋白胨10，酵母粉5，人造海水34.4，VB10.05，VB60.05，VB120.0005。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖100，胰蛋白胨5.6，谷氨酸钠20，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁7.2，硫酸钠12.8，氯化钙0.4，人造海水34.4，VB1 0.1，VB6 0.1，VB12 0.001。
种子培养基和发酵培养基中涉及的维生素配成溶液后，用0.22 μm过滤膜过除菌，使用时加入。
㈣培养条件
藻种活化：将-80oC保存的甘油管藻种，吸取500 uL于种子培基中，28oC、200 rpm条件下培养2-3 d，然后取100 μL藻液稀释至适宜浓度后涂布于固体平板培养基上，30°C培养至藻落长出。挑取长出的单藻落转接至新的平板培养基上，30°C培养4 d，置于4°C冰箱备用。
种子培养：将平板培养基上的藻种用接种环挑取一环接种于装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，28°C、200r·min-1条件下培养2-3 d。
发酵液培养：按5%接种量，将种子液转接至装有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，28oC、200 rpm培养5 d。
㈤磷酸香草醛反应液
磷酸香草醛反应液: 准确称量0.15 g香草醛，将其溶解于2 mL无水乙醇中，并添加25 mL蒸馏水，最后用85%磷酸定容至100 mL待用。
㈥细胞结构观察
使用Leica DMI8倒置显微镜观察，调节目镜16倍，油镜100倍。
㈦生物量与生化检测方法
⒈生物量测定
取30 mL发酵液于离心管中，8000r·min-1离心15 min，沉淀双蒸水洗涤离心2次，冷冻干燥后称重藻体干重，生物量（DCW）计算如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE001
⒉油脂提取与含油量测定
精确称取冷冻干燥后的藻体约1 g（m1）于50mL离心管中，加入10 mL浓盐酸和5 mL去离子水，70-80oC水浴1 h左右，期间隔10 min震荡一次。冷却后加4 mL无水乙醇与10 mL正己烷，充分摇匀，3000r·min-1离心2 min，萃取油脂。收集上层正己烷层于已知重量（m2）离心管中，重复3次，用氮吹仪65oC水浴至正己烷完全蒸发，称旋转瓶总重m3。
含油量c、油脂产量PL及油脂产率VL计算公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE002
⒊磷酸香草醛反应分析初筛藻体的油脂含量
取10 mL藻液, 4000 r/min离心10 min，蒸馏水洗1~2次。定容至2 mL, 取100 µL（对照取蒸馏水）, 加入一带塞试管中, 加入18 mol/L H2SO4 2 mL, 沸水浴中孵化10 min,常温水浴 5 min, 加入5 mL磷酸香草醛试剂，37oC保温15 min, 常温水浴10 min，于530nm测其OD值。
⒋脂肪酸含量测定
①脂肪酸甲酯化
将提取油脂用5 ml正己烷定容，取80 μL的油脂样品置于10 mL离心管中，再向其中加入1 mL 1mol·L-1的KOH-CH3OH溶液，65oC恒温水浴30 min。反应完全后，冷却至室温，向其中加入2 mL 14% BF3-甲醇溶液，65oC恒温水浴10 min后冷却至室温，再向其中加入1mL正己烷，充分震荡后再继续加入1 mL饱和NaCl溶液，充分震荡后静置，待分层后，用移液枪吸取上层澄清有机层并过0.45 μm有机滤膜后即为脂肪酸甲脂化样品，储存于1.5 mL EP管中，待气相分析。
②GC检测方法
气相色谱仪：安捷伦6890N；
气相色谱柱：Agilent hp-88（100m×0.25mm×0.20um）；
载气：氢气；
分流比：50:1；
色谱柱流量：36.9 mL/min；
进样量：2 uL；
色谱柱升温程序：初始温度120oC，维持10 min，然后以1.5oC/min升温至230oC并维持30 min；
进样口温度：250oC；
FID检测器温度：280oC。
⒌发酵液残糖测定
采用生物传感分析仪（SBA-40，山东省科学院生物研究所，中国）检测。
㈧ ARTP诱变及筛选方法
⒈试验流程
Figure DEST_PATH_IMAGE003
⒉致死率曲线测定
藻悬液制备：将裂殖壶藻接种于装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，28oC、200rpm条件下培养3 d。取1 mL培养液离心收集藻体，用无菌水洗涤2次后调整藻液至OD600为1.1-1.3。
ARTP诱变：吸取10 uL藻悬液，均匀涂抹在灭过菌的载片上，将载片置于ARTP诱变仪（ARTP-IIS，无锡源清天木生物科技有限公司，中国）载物台上，诱变处理0、5、10、15、20、25、30、35s。诱变参数为：电源功率120W，氦气流量10 slm，照射距离2 mm。ARTP诱变处理后，将载片转移至装有1 mL无菌水的EP管中，震荡洗脱藻体。吸取100 uL藻液均匀涂布于平板培养基上，28oC培养至藻落长出，计数长出藻落数量，计算致死率。建议选择致死率在85-95%的处理时间作为最适诱变条件。
Figure DEST_PATH_IMAGE004
⒊初筛平板最低抑制浓度（MIC）测定
①丙二酸筛选
丙二酸作为琥珀酸的结构类似物竞争性消耗琥珀酸脱氢酶，抑制琥珀酸的氧化，进而能够抑制三羧酸循环（TCA）循环。TCA循环受阻后，线粒体中过量积累的柠檬酸跨膜释放到线粒体外并在柠檬酸裂解酶的作用下生成乙酰CoA，为脂肪酸合成提供更多的前体。因此，选育丙二酸抗性突变藻株有助于DHA产量的提升。
将藻液稀释至OD600 1.1-1.3左右，稀释100倍后吸取100 uL涂布在分别添加0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5、2.0 g/L丙二酸的平板培养基上，28oC培养3-5 d。根据藻株生长情况，确定丙二酸对藻株的最低抑制浓度。
②2,2’-联吡啶筛选
2,2’-联吡啶是活性氧（ROS）氧化反应诱导剂的一种，DHA和EPA可以作为生物体内的抗氧化剂，能够避免ROS引起的过氧化作用。因此，利用2,2’-联吡啶进行藻株筛选，可以通过外加氧化胁迫淘汰抗氧化能力较低的藻株以期筛选得到抗氧化性较高，有较高 DHA生产能力的藻株。
将藻液稀释至OD600 1.1-1.3左右，稀释100倍吸取100 uL涂布在分别添加0、20、40、60、80、100、120、150、200 μmol/L 2,2’-联吡啶的平板培养基上，28oC培养5 d。根据藻株生长情况，确定2，2’-联吡啶对藻株的最低抑制浓度。
⒋突变藻株初筛
最适条件下对裂殖壶藻出发藻株进行诱变，诱变后的藻液突变在筛选平板上，选择生长速度快的突变株进行复筛。
⒌突变藻株复筛
选择初筛平板上生长速度快的藻株进行摇瓶复筛，在种子液转接发酵液时进行藻株保种，将摇瓶发酵5天的藻液利用磷酸香草醛反应初筛出油脂含量较高的藻株，后利用正己烷提取方法，气相色谱对油脂含量较高的藻株进行高DHA筛选。
⒍重复验证（遗传稳定性验证）
经过复筛的藻株产DHA如有一定的提高，可进行重复验证以及5代藻株遗传稳定性验证。
二、试验结果
㈠ ARTP处理时间的确定
ARTP照射时间不同，藻体的突变率也不同。采用不同的ARTP照射时间，并对藻体致死率进行分析。结果见图1。当ARTP照射时间与致死率之间存在明显的剂量效应关系。在0-5s内，随着照射处理时间的延长，藻体的死亡率快速上升。5 s以后随照射时间延长，致死率缓慢上升。当照射处理时间为25 s时，死亡率达到99%以上。建议选择致死率为85-95%的诱变剂量，即诱变时间选择10-15 s。
㈡筛选平板最小抑菌浓度（MIC）测定结果
⒈丙二酸筛选
表1 丙二酸MIC测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE005
⒉ 2,2’-联吡啶筛选
表2 2,2’-联吡啶MIC测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE006
⒊复合筛选
表3 藻株在不同质量浓度丙二酸-2,2’-联吡啶复合筛选平板上的生长情况
Figure DEST_PATH_IMAGE007
根据表1-3的筛选结果，本发明最终确定0.6 g/L丙二酸，60 μmol / L2, 2’-联吡啶，0.6 g/L丙二酸+20 μmol/L 2,2’-联吡啶为最适筛选浓度。
㈢筛选结果
表4 2,2’-联吡啶筛选裂殖壶藻藻株生物量、油脂产量、DHA产量测定
Figure DEST_PATH_IMAGE008
表5 丙二酸筛选裂殖壶藻藻株生物量、油脂产量、DHA产量测定
Figure DEST_PATH_IMAGE009
表6 2,2’-联吡啶-丙二酸复合筛选裂殖壶藻藻株生物量、油脂产量、DHA产量测定
Figure DEST_PATH_IMAGE010
表7 无筛选因子诱变裂殖壶藻藻株生物量、油脂产量、DHA产量测定
Figure DEST_PATH_IMAGE011
根据表4-7的筛选结果可见，丙二酸抗性藻株、2,2’-联吡啶抗性藻株、2,2’-联吡啶-丙二酸复合抗性藻株和无筛选因子诱变藻株的平均DHA产量与出发藻株相比得到显著提高，分别提高了30.42% 、26.12% 、39.70%和19.26%，平板筛选藻株正向突变率达到88.70%；2,2’-联吡啶-丙二酸复合组藻株藻体平均DHA的产量明显优于丙二酸组、2,2’-联吡啶组和无筛选因子组，且2,2’-联吡啶-丙二酸复合平板筛选出DHA产量含量最高藻株I-F-9，DHA含量达54.56%，DHA产量达10.88 g/L。这表明，采用丙二酸联合2,2’-联吡啶复合平板所筛选获得的裂殖壶藻藻株的DHA含量显著高于单独采用丙二酸或2,2’-联吡啶平板所筛选获得的裂殖壶藻藻株。
本试验进一步将I-F-9高产藻株进行连续诱变，经2,2’-联吡啶-丙二酸高效筛选，得到DHA含量及产量进一步提高的高产藻株II-F-3，II-F-3藻株DHA产量达15.67 g/L，与原始藻株相比提高151.12%，DHA含量达68.23%，与原始藻株相比提高95.50%，高产藻株DHA重量占藻体干重的比例由16.23%提高到了38.85%。将高产藻株II-F-3和原始藻株进行120 h连续发酵，结果显示，II-F-3藻株与原始藻株生物量，油脂产量无显著变化，但II-F-3藻株DHA产量及含量较原始藻株显著升高（表8-表11）。
表8 不同发酵时间藻株DHA产量变化
Figure DEST_PATH_IMAGE012
表9 不同发酵时间藻株DHA含量变化
Figure DEST_PATH_IMAGE013
表10 不同发酵时间藻株生物量变化
Figure DEST_PATH_IMAGE014
表11 不同发酵时间藻株油脂产量变化
Figure DEST_PATH_IMAGE015
表12 不同筛选因子对DHA含量影响的比较
Figure DEST_PATH_IMAGE016
试验例2
一、高蛋白含量裂殖壶菌诱变株的筛选
㈠试验设计
本试验采用常压室温等离子体诱变裂殖壶藻细胞，使用试验例1建立的丙二酸-2,2’-联吡啶复合平板筛选出能够稳定遗传的高蛋白含量的裂殖壶藻藻株。
㈡菌株
裂殖壶藻（保藏编号GIM6.2，其它编号ATCC20888），购于广东省微生物菌种保藏中心。
㈢培养基
固体培养基（g/L）：葡萄糖5，胰蛋白胨1，酵母粉1，琼脂20，人造海水34.4。
种子培养基（g/L）：葡萄糖30，胰蛋白胨10，酵母粉5，人造海水34.4，VB10.05，VB60.05，VB120.0005。
发酵培养基（g/L）：葡萄糖100，胰蛋白胨5.6，谷氨酸钠20，磷酸二氢钾2.5，硫酸镁7.2，硫酸钠12.8，氯化钙0.4，人造海水34.4，VB1 0.1，VB6 0.1，VB12 0.001。
种子培养基和发酵培养基中涉及的维生素配成溶液后，用0.22 μm过滤膜过除菌，使用时加入。
㈣培养条件
藻种活化：将-80oC保存的甘油管藻种，吸取500 uL于种子培基中，28oC、200 rpm条件下培养2-3 d，然后取100 μL藻液稀释至适宜浓度后涂布于固体平板培养基上，30°C培养至藻落长出。挑取长出的单藻落转接至新的平板培养基上，30°C培养4 d，置于4°C冰箱备用。
种子培养：将平板培养基上的藻种用接种环挑取一环接种于装有50 mL种子培养基的250 mL摇瓶中，28°C、200 r·min-1条件下培养2-3 d。
发酵液培养：按5%接种量，将种子液转接至装有50 mL发酵培养基的250 mL摇瓶中，28oC、200 rpm培养5 d。
㈤磷酸香草醛反应液
磷酸香草醛反应液: 准确称量0.15 g香草醛，将其溶解于2 mL无水乙醇中，并添加25 mL蒸馏水，最后用85%磷酸定容至100 mL待用。
㈥细胞结构观察
使用Leica DMI8倒置显微镜观察，调节目镜16倍，油镜100倍。
㈦生物量与生化检测方法
⒈生物量测定
取30 mL发酵液于离心管中，8000 r·min-1离心15 min，沉淀双蒸水洗涤离心2次，冷冻干燥后称重藻体干重，生物量（DCW）计算如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE017
⒉蛋白含量测定
称取0.2 g~0.5 g已制备好的样品，转移至250 mL的消化管底部，加入1粒成品催化剂（硫酸铜：硫酸钾=1：9），再用移液管量取10 ml浓硫酸沿消化管壁缓慢的加入消化管中。将样品放入通风橱里石墨消解仪上，盖好连接于水龙头处的上盖后打开冷凝水，打开消解仪开关，设置420℃消化2 h的程序，点击开始，由低温升至420℃消化2 h直至溶液亮绿澄清无黑色颗粒，每批同时做两个试剂空白（除不加样品外，加入1颗成品催化剂，再加10 mL浓硫酸，加热消化）。将消化好的样品放置全自动定氮仪上测定。
结果按下式进行计算：
Figure DEST_PATH_IMAGE018
式中：w-粗蛋白的含量，g；c-盐酸标准溶液浓度，mol/L；m-试样质量，g；V1-滴定试样时所需盐酸标准溶液体积，mL；V0-空白滴定所需盐酸标准滴定溶液体积， mL；0.0140-与1.00 mL盐酸标准滴定溶液相当的，以克表示的氮的质量；6.25-氮换算成蛋白质的平均系数。
⒊脂肪含量测定
取有代表性试样用四分法缩减至200 g，粉碎过 40 目筛，装入密封容器中，备分析。将铝杯在（105±2）℃烘箱中烘干1~2 h，放在干燥器中冷却30 min，称重。再烘干30min，同样冷却称重，两次称重之差小于0.0008 g为恒重。称取试样1～5g（准确至0.0002g），于滤纸筒中。在滤纸筒中样品的上端填放一块棉花，在样品上形成一个棉花通道，有利于保护样品，并用铅笔注明标号。将盛有样品的滤纸筒，转移至FOSS 索氏脂肪提取仪上测定。仪器程序运行结束后，将回收杯放入（105±2）℃烘箱中烘2 h，干燥器中冷却 30 min，称重。再烘30 min，同样冷却称重，两次称重之差小于 0.001 g 为恒重。
结果按下式进行计算：
Figure DEST_PATH_IMAGE019
式中：w—粗脂肪的质量分数，％；m—试样质量，g；m1—抽提瓶质量，g；m2—盛有脂肪的抽提瓶质量，g。
⒋灰分含量测定
选取有代表性样品风干或60℃烘干，经植物样品粉碎机粉碎过 0.45 mm 样品筛，混匀， 装袋，以备分析。将坩埚清洗后，烘干，放入高温电阻炉内，于（550±20）℃灼烧1 h，取出，在空气中冷却1 min，放入干燥器内冷却 30 min，称量。再灼烧30 min、冷却、称量，直至两次称量之差小于0.001 g为恒重。用分析天平称取 2~5 g样品（灰分量应在 0.05 g 以上）置于已恒重的坩埚中，在电炉上炭化，然后放入高温电阻炉内，于（550±20）℃灰化2~4h，直至灰分变白或灰白无炭粒存在为止。取出，在空气中冷却1 min，放入干燥器内冷却30min，称量。再灼烧 30 min，冷却，称量，直至两次称量之差小于 0.001 g 为恒重。
结果按下式进行计算：
Figure DEST_PATH_IMAGE020
式中：m1-坩埚和灰分的总质量，g；m0-坩埚的质量，g；m-试样质量，g。
⒌油脂提取与含油量测定
精确称取冷冻干燥后的藻体约1 g（m1）于50 mL离心管中，加入10 mL浓盐酸和5mL去离子水，70-80oC水浴1 h左右，期间隔10 min震荡一次。冷却后加4 mL无水乙醇与10mL正己烷，充分摇匀，3000r·min-1离心2 min，萃取油脂。收集上层正己烷层于已知重量（m2）离心管中，重复3次，用氮吹仪65oC水浴至正己烷完全蒸发，称旋转瓶总重m3。
含油量c、油脂产量PL及油脂产率VL计算公式如下：
Figure DEST_PATH_IMAGE021
⒍磷酸香草醛反应分析初筛藻体的油脂含量
取10 mL藻液, 4000 r/min离心10 min，蒸馏水洗1~2次。定容至2 mL, 取100 µL(对照取蒸馏水), 加入一带塞试管中, 加入18 mol/L H2SO4 2 mL, 沸水浴中孵化10min, 常温水浴 5 min, 加入5 mL 磷酸香草醛试剂，37℃保温15 min, 常温水浴10 min，于530 nm测其OD值。
⒎脂肪酸含量测定
①脂肪酸甲酯化
将提取油脂用5 mL正己烷定容，取80 μL的油脂样品置于10mL离心管中，再向其中加入1 mL 1mol·L-1的KOH-CH3OH溶液，65oC恒温水浴30 min。反应完全后，冷却至室温，向其中加入2 mL 14% BF3-甲醇溶液，65oC恒温水浴10 min后冷却至室温，再向其中加入1 mL正己烷，充分震荡后再继续加入1 mL饱和NaCl溶液，充分震荡后静置，待分层后，用移液枪吸取上层澄清有机层并过0.45 μm有机滤膜后即为脂肪酸甲脂化样品，储存于1.5 mL EP管中，待气相分析。
②GC检测方法
气相色谱仪：安捷伦6890N；
气相色谱柱：Agilent hp-88（100m×0.25mm×0.20um）；
载气：氢气；
分流比：50:1；
色谱柱流量：36.9 mL/min；
进样量：2uL；
色谱柱升温程序：初始温度120oC，维持10 min，然后以1.5oC/min升温至230oC并维持30 min；
进样口温度：250oC；
FID检测器温度：280oC。
⒏发酵液残糖测定
采用生物传感分析仪（SBA-40，山东省科学院生物研究所，中国）检测。
㈧诱变及筛选方法
⒈试验流程
Figure DEST_PATH_IMAGE022
⒉突变藻株初筛
最适条件下对裂殖壶藻出发藻株进行诱变，诱变后的藻液突变在筛选平板上，选择生长速度快的突变株进行复筛。
⒊突变藻株复筛
选择初筛平板上生长速度快的藻株进行摇瓶复筛，在种子液转接发酵液时进行藻株保种，将摇瓶发酵5天的藻液初筛出蛋白含量较高的藻株，再对蛋白含量较高的藻株进行高蛋白含量的复筛。
⒋重复验证（遗传稳定性验证）
经过复筛的藻株蛋白质含量有一定的提高，可进行重复验证以及5代藻株遗传稳定性验证。
二、试验结果
本试验从大量的诱变菌株中最终筛选得到一株高蛋白质含量和高DHA产量的裂殖壶藻诱变株B3，诱变株B3的蛋白质含量以及DHA产量的测定结果见表13。
本发明将高蛋白质含量和高DHA产量的裂殖壶藻诱变株B3提交到专利认可的机构进行保藏，其微生物保藏编号是：CGMCC No.40082；其分类命名是：裂殖壶菌 Schizochytrium sp.；保藏单位是：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏地址是：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
表13 裂殖壶藻原始株以及诱变菌株的蛋白质含量和DHA产量测定结果
Figure DEST_PATH_IMAGE023

Claims (7)

1.一株高蛋白、高DHA的裂殖壶菌（Schizochytrium sp.）诱变株，其特征在于，其微生物保藏编号是：CGMCC No.40082。
2.权利要求1所述的裂殖壶菌诱变株作为畜禽饲料添加剂的用途。
3.权利要求1所述的裂殖壶菌诱变株在提取DHA中的用途。
4.权利要求1所述的裂殖壶菌诱变株在制备富含DHA保健品中的用途。
5.权利要求1所述的裂殖壶菌诱变株在制备富含DHA食品中的用途。
6.权利要求1所述的裂殖壶菌诱变株在制备富含蛋白质保健品中的用途。
7.权利要求1所述的裂殖壶菌诱变株在制备富含蛋白质食品中的用途。
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