CN115232841A - 一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法，具体涉及微藻生物技术领域，具体培养过程如下：步骤1、将藻种转接于装有mBBM液体培养基的三角瓶中光照摇床振荡培养；步骤2、将步骤1中的藻种接入气升式柱状玻璃光生物反应器；步骤3、将步骤2中获得的藻种转接至气升式柱状光生物反应器，先在MgSO4·7H2O浓度增至为0.375g/L的mBBM培养基中培养9天后，再更换至无硫的mBBM培养基中高光条件下培养。本发明通过两步法的培养方式可显著提高黄丝藻油脂和棕榈油酸产率，为利用黄丝藻高效生产油脂和棕榈油酸提供了技术支持。

Description

一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法
技术领域
本发明涉及微藻生物技术领域，更具体地说是一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法。
背景技术
微藻主要是一类光合自养型的低等水生生物，由于它们不竞争其它资源，并能够生产多种高附加值的生物产品，因此，开发利用具有重要商业应用价值的特色微藻资源具有重大潜力。棕榈油酸是一种含有1个双键的十六碳不饱和脂肪酸，属于ω-7单不饱和脂肪酸的一种。目前，棕榈油酸已被广泛应用于医药制剂、保健护理、水产饵料与饲料、化工产品以及生物能源等领域。一些野生油料植物是生产棕榈油酸相关产品的主要原料，但是，这些野生油料植物存在农艺性状差、种子小难采收、油脂产量低、地理分布窄等缺点。传统油料作物种子油脂中几乎没有或只含有微量的棕榈油酸。这导致野生油料植物和传统油料作物都难以满足人类食用和工业使用对棕榈油酸的大量需求。研究发现一种丝状微藻—黄丝藻(Tribonema sp.)可在特定培养条件下积累大量油脂，而且总脂肪酸中棕榈油酸含量可达40％以上。同时，黄丝藻还具有抵抗原生动物捕食能力强及易于采收的优势，可大大降低户外大规模生产成本，这使得黄丝藻成为生产油脂和棕榈油酸的理想原材料。黄丝藻与大部分产油微藻不同，其油脂含量并不受氮胁迫的诱导而提高，目前文献报道中仍未提及通过某种无机盐缺乏而胁迫诱导提高黄丝藻油脂和棕榈油酸产量的方法。
发明内容
为了提高黄丝藻的生长、油脂和棕榈油酸的产量，降低其生产成本，本发明发现当增加培养基中硫酸镁的浓度时可以显著促进黄丝藻的生长，硫缺乏和增加光强可胁迫诱导黄丝藻油脂和棕榈油酸的积累，通过两步法的培养方式即首先在增加培养基中的硫酸镁浓度的培养基培养黄丝藻9天后，将黄丝藻通过筛绢过滤后转入无硫培养基中高光培养，可显著提高黄丝藻油脂和棕榈油酸产率，为利用黄丝藻高效生产油脂和棕榈油酸提供了技术支持。
本发明发现在气升式柱状光生物反应器中培养黄丝藻时，将mBBM培养基中硫酸镁浓度增加5倍时(5S)有利于黄丝藻快速生长，积累较高浓度生物质，最终生物量可达到8.74g/L，它是对照组mBBM培养基中(硫酸镁浓度为0.075g/L，称之为1倍硫酸镁浓度，1S)培养时生物量的1.95倍；当将5倍硫酸镁浓度的培养基中培养9天后的黄丝藻转到无硫mBBM培养基中(5S→0S)高光条件继续培养时黄丝藻的生物质浓度又有一定程度的增加，最终生物量达到9.33g/L。而当黄丝藻一开始就在缺乏硫(0S)的mBBM培养基中培养时最终生物量较低(图1)。但在0S条件下黄丝藻可迅速积累油脂，在第6天油脂含量可达到干重的49.91％，是对照组的3.22倍(图2)。5S组的油脂积累速度较慢，当更换至无硫培养基中高光条件下培养后，5S→0S组油脂含量最终可达到细胞干重的46.29％，是5S组油脂含量的1.97倍。此外，0S和5S→0S条件下的总脂肪酸和棕榈油酸含量均高于1S对照组(图3)。另外，我们也比较了这几种培养条件下黄丝藻的生物质、油脂、总脂肪酸和棕榈油酸产率，发现黄丝藻在5S→0S条件下的结果均最高(表2)，表明先采用高硫酸镁浓度的mBBM培养基培养再更换至无硫的mBBM培养基培养的两步法培养策略是提高黄丝藻油脂和棕榈油酸产量的有效方法，具有重要的应用前景。
本发明的目的是通过下述技术路线方案实现的：
为实现上述目的，本发明所需的藻种购买于德国哥廷根大学藻类培养收集中心(SAG)(http://www.uni-goettingen.de/en/45175.html)。藻种保存于改良BBM(mBBM)培养基中(表1)
表1mBBM培养基配方
Figure BDA0003770819460000031
将上述成分加入1L去离子水，121℃、20min高温灭菌处理。
具体培养过程如下：
步骤1、由藻种室获得藻种后，转接于装有300mL的mBBM液体培养基的三角瓶中，然后光照摇床振荡培养6～8天，进行下一步扩种；
步骤2、将步骤1中的藻种接入直径为6.5cm的气升式柱状玻璃光生物反应器中，培养基为mBBM液体培养基，通入含有1.5-2.0％CO2的压缩空气，气升搅拌培养6～8天；
步骤3、将步骤2中获得的藻种通过400目筛绢过滤，按照0.3g/L的初始接种密度转接至1.3L的气升式柱状光生物反应器中，先在MgSO4·7H2O浓度增至为0.375g/L的mBBM培养基中培养9天后，再更换至无硫的mBBM培养基中高光条件下继续培养。
步骤4、培养过程中每天定时测定生物质浓度，每隔3天取藻液样品，通过400目筛绢过滤收集藻细胞，然后真空冷冻干燥获得冻干藻粉。
优选地，步骤1中在装有300mL的mBBM液体培养基的三角瓶中光照摇床振荡培养时的光照强度为40～60μmol photons m-2s-1。
优选地，步骤2中光强60～80μmol photons m-2s-1。
优选地，步骤3中MgSO4·7H2O浓度增至为0.375g/L的mBBM培养基单侧光照，光强为200～250μmol photons m-2s-1。
优选地，步骤3中无硫的mBBM培养基中双侧光照，每侧光强分别为200～250μmolphotons m-2s-1。
优选地，步骤3中培养过程中按照0.2vvm通入含有1.5-2.0％CO2的压缩空气进行气升式搅拌。
本发明的技术效果和优点：
1、本发明提供了通过硫浓度调控黄丝藻生长及代谢产物积累的方法，增加mBBM培养基中硫酸镁的浓度能够有效提高黄丝藻生长积累较高的生物质浓度；无硫缺乏诱导可快速促进黄丝藻积累油脂及棕榈油酸，该方法简单迅速，具有重要的应用前景。
2、本发明提供了通过两步法利用黄丝藻快速积累生物质，高效生产油脂和棕榈油酸的方法，两步法策略培养过程中最高生物质、油脂和棕榈油酸产率均比对照组提高90％以上。
3、本发明可快速获得大量的黄丝藻生物质，具有绿色、安全的优势；可在户外或室内培养、持续采收，可以满足生产油脂和棕榈油酸以及黄丝藻其它生物活性物质生产所需的原料。
附图说明
图1是本发明的4种培养条件下黄丝藻的生长曲线。
图2是本发明的黄丝藻在4种培养条件下的总脂含量的时相变化。
图3是本发明的黄丝藻在4种培养条件下的总脂肪酸组成和棕榈油酸含量。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法，具体培养过程如下：
步骤1、由藻种室获得藻种后，转接于装有300mL的mBBM液体培养基的三角瓶中，然后光照摇床振荡培养6～8天，光照强度为40～60μmol photons m-2s-1，进行下一步扩种；
步骤2、将步骤1中的藻种接入直径为6.5cm的气升式柱状玻璃光生物反应器中，培养基为mBBM液体培养基，光强60～80μmol photons m-2s-1，通入含有1.5-2.0％CO2的压缩空气，气升搅拌培养6～8天；
步骤3、将步骤2中获得的藻种通过400目筛绢过滤，按照0.3g/L的初始接种密度转接至1.3L的气升式柱状光生物反应器中，培养基分别为mBBM液体培养基(MgSO4·7H2O浓度为0.075g/L，记为1S对照组)，硫酸镁浓度增加5倍的mBBM液体培养基(MgSO4·7H2O浓度为0.375g/L，记为5S处理组)和不含硫的mBBM液体培养基(记为0S处理组)，单侧光照，光强为200～250μmol photons m-2s-1，培养过程中按照0.2vvm通入含有1.5-2.0％CO2的压缩空气进行气升式搅拌。
步骤4、培养过程中每天定时测定生物质浓度，每隔3天取藻液样品，通过400目筛绢过滤收集藻细胞，然后真空冷冻干燥获得冻干藻粉。
实施例1：黄丝藻在不同硫酸镁浓度培养时细胞生长、油脂及棕榈油酸积累的变化比较。
实验材料：黄丝藻(已进行扩种培养)。
培养基的配制(配方见表1)：将上述成分加入1L去离子水为1S-mBBM培养，将上述成分中MgSO4·7H2O浓度调整为0.375g/L加入1L去离子水为5S-mBBM培养基，将上述成分MgSO4·7H2O浓度调整为0g/L，添加浓度为0.029g/L的MgCl2加入1L去离子水为0S-mBBM培养基，121℃、20min高温灭菌。
试验方法：
获得的藻种按照0.3g/L的初始接种密度转接至直径为6.0cm的1.3L气升式柱状光生物反应器中，培养基为分别为1S-mBBM液体培养基、5S-mBBM液体培养基和0S-mBBM液体培养基，单侧光照，光强为200～250μmol photons m-2s-1，培养过程中按照0.2vvm通入含有1.5-2.0％CO2的压缩空气进行通气搅拌培养18天，每一组实验设置3个重复。每天定时测定生物质浓度，每隔3天取藻液样品，通过400目筛绢过滤收集藻细胞。藻体经真空冷冻干燥后，测定藻粉中油脂和棕榈油酸的含量。
总脂含量测定采用差重法，准确称取40-70mg冻干藻粉(记为M0)，放入体积为15mL的螺口玻璃离心管中并放入磁力转子，加入2mL体积比为1：9的二甲基亚砜-甲醇混合液，50℃水浴磁力搅拌3h，3000r/min离心5min，吸取上清于玻璃小瓶中。再加入4mL体积为1：1的正己烷-乙醚混合液到玻璃离心管中，转为冰浴磁力搅拌1.5h，离心取上清，重复以上步骤直至藻渣变为灰白色。加入4mL去离子水至装有上清合并液的玻璃小瓶中，静置过夜分层，上层有机相小心转移到另一干净玻璃离心管中，3000r/min离心5min，吸取上清至已标记的小瓶并用氮吹仪浓缩，用少量乙醚溶解油脂，并转移至已称重的1.5mL Eppendorf管中(管重记为M1)，在氮气仪里吹干至恒重(记为M2)。总脂含量计算公式为：总脂含量(％DW)＝(M2-M1)/M0×100％。
脂肪酸组成及含量测定为：准确称取25mg冻干藻粉，放入体积为15mL的螺口玻璃离心管中并放入磁力转子，依次加入2mL含有2％H2SO4的无水甲醇-甲苯(1：1，体积比)混合液，100μL 0.25％的十七烷酸(C17：0)作为内参，充入惰性气体氩气后密封，80℃磁力搅拌1.5h进行脂肪酸甲酯化，冷却后加入1mL正己烷和1mL去离子水，3000r/min离心5min，将上层有机相取200μL转移至气相色谱样品瓶中，保存于-20℃冰箱中待测。利用高效气相色谱仪检测样品，色谱柱型号为CD-2560，规格为100m×0.25mm×0.20μm，GC条件：柱温140℃保持20min；4℃ min-1升温到240℃，保持20min；进样量为1μL，FID检测器进样口温度250℃；检测口温度为260℃。通过内参脂肪酸(十七烷酸)的出峰时间及相应峰面积可计算出样品中脂肪酸的组成及含量。
研究发现(图1)，培养基中增加硫酸镁浓度(5S)有利于黄丝藻快速生长，积累较高浓度生物质，最终生物量可达到8.74g/L，是对照组(1S)中生物量的1.95倍；而当黄丝藻在缺乏硫(0S)的培养基条件下最终生物量较低。但0S条件下黄丝藻可迅速积累油脂，在第6天油脂含量可达到干重的49.91％，是对照组的3.22倍(图2)，表明通过增加硫酸镁的浓度能够有效提高黄丝藻生长积累较高的生物质浓度，无硫缺乏诱导可快速促进黄丝藻积累油脂，通过硫浓度调控黄丝藻生长及代谢产物的积累，该方法简单迅速，具有重要的应用前景。
实施例2：两步法培养促进黄丝藻获得较高油脂和棕榈油酸产量。
实验材料：黄丝藻(已进行扩种培养)。
培养基的配制(配方见表1)：将上述成分中MgSO4·7H2O浓度调整为0.375g/L加入1L去离子水记为5S-mBBM培养基，将上述成分MgSO4·7H2O浓度调整为0g/L，添加浓度为0.029g/L的MgCl2加入1L去离子水记为0S-mBBM培养基，121℃、20min高温灭菌。
试验方法：
获得的藻种通过按照0.3g/L的初始接种密度转接至直径为6.0cm的1.3L气升式柱状光生物反应器中，先在5S-mBBM液体培养基培养，光强为200～250μmol photons m-2s-1，9天后通过筛绢过滤，将黄丝藻直接转移至0S-mBBM培养基培养，双侧光照，每侧光强分别200～250μmol photons m-2s-1培养9天。培养过程中按照0.2vvm通入含有1.5-2.0％CO2的压缩空气进行气升搅拌，每一组实验设置3个重复。每天定时测定生物质浓度，每隔3天取藻液样品，通过400目筛绢过滤收集藻细胞。藻体经真空冷冻干燥后，测定藻粉中油脂和棕榈油酸的含量。
结果发现，黄丝藻在接种5S-mBBM培养基中培养9天后转到无硫高光的培养条件(5S→0S)下继续培养可进一步提高黄丝藻的生物质浓度，最终生物量达到9.33g/L。5S组的油脂积累速度较慢，但通过更换至无硫mBBM培养基高光条件下诱导后，5S→0S组油脂含量最终可达到细胞干重的46.29％，是5S组油脂含量的1.97倍。此外，5S→0S条件下的总脂肪酸和棕榈油酸含量均高于对照组(1S)(图3)。另外，我们也比较了黄丝藻在这几种培养条件下的生物质、油脂、总脂肪酸和棕榈油酸产率，发现5S→0S条件下产率均最高(表2)，表明这种两步法培养策略是提高黄丝藻生物质、油脂和棕榈油酸产量的有效方法，具有重要的应用前景。
表2黄丝藻在不同培养条件下的生物质、总脂、总脂肪酸和棕榈油酸产率比较
Figure BDA0003770819460000081
Figure BDA0003770819460000091
最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法，其特征在于：具体培养过程如下：
步骤1、由藻种室获得藻种后，转接于装有300mL的mBBM液体培养基的三角瓶中，然后光照摇床振荡培养6～8天，进行下一步扩种；
步骤2、将步骤1中的藻种接入直径为6.5cm的气升式柱状玻璃光生物反应器中，培养基为mBBM液体培养基，通入含有1.5-2.0％CO2的压缩空气，气升搅拌培养6～8天；
步骤3、将步骤2中获得的藻种通过400目筛绢过滤，按照0.3g/L的初始接种密度转接至1.3L的气升式柱状光生物反应器中，先在MgSO4·7H2O浓度增至为0.375g/L的mBBM培养基中培养9天后，再更换至无硫的mBBM培养基中高光条件下培养；
步骤4、培养过程中每天定时测定生物质浓度，每隔3天取藻液样品，通过400目筛绢过滤收集藻细胞，然后真空冷冻干燥获得冻干藻粉。
2.根据权利要求1所述的一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法，其特征在于：步骤1中在装有300mL的mBBM液体培养基的三角瓶中光照摇床振荡培养时的光照强度为40～60μmol photons m-2s-1。
3.根据权利要求1所述的一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法，其特征在于：步骤2中光强60～80μmol photons m-2s-1。
4.根据权利要求1所述的一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法，其特征在于：步骤3中MgSO4·7H2O浓度增至为0.375g/L的mBBM培养基单侧光照，光强为200～250μmolphotons m-2s-1。
5.根据权利要求1所述的一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法，其特征在于：步骤3中无硫的mBBM培养基中双侧光照，每侧光强分别为200～250μmol photons m-2s-1。
6.根据权利要求1所述的一种提高黄丝藻生长、油脂和棕榈油酸产量的方法，其特征在于：步骤3中培养过程中按照0.2vvm通入含有1.5-2.0％CO2的压缩空气进行气升式搅拌。
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张成武等: "不同营养盐及浓度对黄丝藻Tribonema sp.FACHB-1786生长及脂质积累的影响", 生物工程学报, vol. 36, no. 11, 13 August 2020 (2020-08-13), pages 2478 - 2493 *
黄怡等: "不同磷、硫及二氧化碳浓度对标志链带藻生长和碳水化合物积累的影响", 微生物学报, vol. 59, no. 10, 13 March 2019 (2019-03-13), pages 1915 - 1926 *

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