CN107287252A - 一种ω-7脂肪酸合成物及培养黄丝藻生产该合成物的方法与应用 - Google Patents

一种ω-7脂肪酸合成物及培养黄丝藻生产该合成物的方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种以异养培养和/或兼养培养所获得的黄丝藻为原料的ω‑7脂肪酸合成物，以及利用异养培养和/或兼养培养方式培养黄丝藻的方法。所述的ω‑7脂肪酸合成物中，ω‑7脂肪酸的含量为30％到70％。所述的培养方法涉及培养基的营养物组成、培养条件和培养过程的操作步骤。本发明还公开了所述方法在生产黄丝藻生物质、富含ω‑7脂肪酸的油脂、以及以所述生物质和/或油脂为原料的产品等方面的应用。

Description

一种ω-7脂肪酸合成物及培养黄丝藻生产该合成物的方法与应用
技术领域
本发明涉及一种ω-7脂肪酸合成物及培养黄丝藻生产该合成物的方法与应用，具体的，涉及一种以异养培养和/或兼养培养的方式培养黄丝藻的方法，以该方法所得到的黄丝藻为原料所生产的ω-7脂肪酸合成物，以及上述ω-7脂肪酸合成物在生产食品、营养品、饮料、饲料、化工品、燃料、化妆品、护肤品、保健品、医药品、食品添加剂中的应用，属于微藻生物技术领域。
背景技术
ω-7脂肪酸是一类双键位于第七个碳原子的单不饱和脂肪酸。棕榈油酸(C16:1)，英文名palmitoleic acid，是ω-7脂肪酸中的一种，其化学式为CH3(CH2)5CH＝CH(CH2)7COOH。棕榈油酸是由棕榈酸经delta-9去饱和酶催化后生物合成的。
棕榈油酸在医药、营养品、工业等领域具有重要的应用价值。例如，棕榈油酸已被证明能提高人体对胰岛素的敏感性，对糖尿病、代谢综合症有效，且没有明显的副作用(Cao HM,et al.Identification of a lipokine,a lipid hormone linking adipose tissue to systemic metabolism.Cell,2008,134,933-944.)。
不仅如此，棕榈油酸还能降低C-反应蛋白(CRP)的水平，通过减少炎症降低心脏疾病、中风的风险。棕榈油酸可以增加细胞膜的流动性，降低血液中低密度脂蛋白LDL胆固醇含量，减少血管中粥样硬化斑块形成而造成的阻塞血管，从而防止心律失常和减少高血压等(Akazawa Y,et al.Palmitoleate attenuates palmitate-induced Bim and PUMA up-regulation andhepatocyte lipoapoptosis.J Hepatol,2010,52,586-593.Misra A,et al.Obesity,the metabolicsyndrome,and type 2diabetes in developing countries:role of dietary fats and oils.J Am Coll Nutr,2010,29,S289-S301.)。
此外，棕榈油酸具有很好的皮肤渗透性，因此，其在防止皮肤老化、脂肪堆积、恢复皮肤弹性方面也具有明显的作用，是用于抗衰老化妆品理想的原料。
另外，棕榈油酸可直接用于高效生产工业需求量较大的辛烯(Rybak A,et al.Acycli dienemetathesis with a monomer from renewable resources:control of molecular weight and one-steppreparation of block copolymers.Chem Sus Chem,2008,1,542-547.)。同时，棕榈油酸因其是单不饱和脂肪酸，具有非常好的抗低温和抗氧化特性，适于制取优质生物柴油(Cao YJ,et al.Production of free monounsaturated fatty acids by metabolically engineered Escherichia coli.Biotechnolgy for Biofuels,2014,7,59.Knothe G,et al.Biodiesel derived from a model oil enrichedin palmitoleic acid,Macadamia nut oil.Energy Fuel,2010,24(3),2098-2103.)。
迄今，野生植物是目前市面上棕榈油酸产品的主要原料，很多公司都选择从沙棘果(Hippophae rhamnides)中提取分离棕榈油酸。沙棘的果肉中可积累25％的棕榈油酸(Yang B,et al.Fatty acid compositon of lipids in sea buckthorn(Hippophae rhamnoides L.)berries ofdifferent orgins.J Agric Food Chem,2001,49,1939-1947.)。猫爪草(Doxantha unguis-cati)和澳洲坚果(Macadamia integrifolia)也是棕榈油酸的重要来源。棕榈油酸在猫爪草的种子中的含量约为60％，在澳洲坚果中的含量约为30％。另外，在貂油中也含有少量的棕榈油酸。
然而，这些富含ω-7脂肪酸的野生植物与动物，由于其资源量有限、产量低、地理分布窄或种群稀少等原因，还不能像普通油料作物那样大规模种植和商业化生产。目前，规模化种植的大豆、玉米等油料作物种子的主要成分包括棕榈酸(C16:0)、硬脂酸(C18:0)、油酸(C18:1)和亚油酸(C18:2)，而仅含微量(＜2％)的棕榈油酸(Cao YJ,et al.Production of freemonounsaturated fatty acids by metabolically engineered Escherichia coli.Biotechnolgy forBiofuels,2014,7,59.Imke L,et al.Fatty acid profiles and their distribution patterns in microalgae:a comprhensive analysis of more than 2000strains from the SAG culture collection.BMC PlantBiology,2011,11,124.)，难以满足人类食用和工业的需求(表1)。近年来，人们发现一些酵母(如Kluyveromyces polysporus,Torulaspora delbrueckii,Saccharomyces cerevisiae)的脂肪酸中含有较高比率的棕榈油酸。但这些酵母总脂含量不高，导致棕榈油酸含量占细胞干重的比率较低(Beopoulos A,et al.An overview of lipid metabolism in yeasts and its impact onbiotechnological processes.Applied Microbiology and Biotechnology,2011,90,1193-1206.Liu Y,et al.Bioconversion of crude glycerol to glycolipids in Ustilago maydis.Bioresource Technology,2011,102,3927-3933.)。
表1几种典型油料作物的脂肪酸组成
随着棕榈油酸的有益之处被越来越多地发现和证实，其需求量也将显著增加。因此，寻求一种棕榈油酸含量高，且不受季节、地域因素限制的新的资源成为解决原料供应不足问题的首选之路。
黄丝藻，归属于黄藻门黄藻纲异丝藻目黄丝藻科黄丝藻属，其植物体为不分枝的丝状体。研究表明，黄丝藻具有生长速度快、油脂含量高的特点，而且，其脂肪酸中棕榈油酸的含量超过了50％(Wang H,et al.Integration process of biodiesel production from filamentousoleaginous microalgae Tribonema minus.Bioresour.Technol,2013,142,39-44.Guo F J,et al.Special biochemical responses to nitrogen deprivation of filamentous oleaginous microalgaeTribonema sp..Bioresour.Technol.2014,158,19-24.)。因此，黄丝藻可以替代传统的野生植物与动物，成为一种全新的生产棕榈油酸的原料。同时，开发一种可以高密度、规模化培养黄丝藻的方法也势在必行。
微藻的大规模培养主要有两种途径：自养培养和异养培养。其中，自养培养可以固定温室气体二氧化碳并释放出氧气，对环境友好，但是由于微藻细胞间的互相遮蔽效应，光能的利用往往受到极大的限制。细胞浓度越高，这种遮蔽效应体现得越明显，严重影响细胞的生长和油脂合成。而对于异养培养而言，细胞的生长主要依赖细胞对有机碳源的吸收，由于它不受光的限制，因此可以通过有机碳的加入来迅速提高细胞培养密度并实现油脂的高效合成；但是与光自养培养相比，异养培养的藻细胞蛋白及色素含量偏低。因此，上述两种微藻的大规模培养方式各有利弊，在实际应用时需根据具体需求进行选择。
美国专利US2013/0129775A1公开了一种富含ω-7脂肪酸的合成物以及分离ω-7脂肪酸的方法。该专利虽指出其所述的合成物来自于藻生物量，但其并未明确说明藻的种类，而仅以微拟球藻(Nannochloropsis)为实施例进行了简要阐述。
美国专利US2014/0275596A1公开了一种以藻类为来源的ω-7脂肪酸和ω-3脂肪酸的混合合成物。该专利虽在其发明详述中详细列举了多种藻类作为其生产ω-7脂肪酸和ω-3脂肪酸混合合成物的来源，但其中并未涉及黄丝藻。
文献“Application of sweet sorghum for biodiesel production by heterotrophic microalgaChlorella protothecoides”(Gao CF,et al.Application of sweet sorghum for biodiesel production byheterotrophic microalga Chlorella protothecoides.Applied Energy,2010,87,756-761.)和“Enhancement of microalgal biomass and lipid productivities by a model of photoautotrophicculture with heterotrophic cell as seed”(Han FF,et al.Enhancement of microalgal biomass and lipidproductivities by a model of photoautotrophic culture with heterotrophic cell as seed.Bioresour.Technol,2012,118,431-437.)报道了异养培养微藻的方法，但其所异养培养的微藻皆为单细胞的小球藻(Chlorella)。本技术领域的人员应当知晓，小球藻的采收过程将消耗较高的电能或需要添加一定量的絮凝剂。而黄丝藻，因其丝状体形态，只需对其进行简单的筛绢过滤或气浮即可完成高效率的采收，不但降低了采收成本，还可有效避免絮凝剂的添加。
对于黄丝藻的大规模培养而言，由于先前的研究皆以光合自养为基础，尚未有对其进行异养或兼养培养的研究，且本领域的研究人员一直以来都将注意力集中在单细胞藻类的异养上，而对多细胞的丝状藻却鲜有关注，因此，黄丝藻目前多采用自养的方式进行培养和产业化应用，例如，中国专利CN103960117A公开了一种制备黄丝藻生物油的方法及由其制备的黄丝藻生物油。该专利所公开的方法中，通过使用通用的微藻培养基(即BG11培养基)对黄丝藻进行光照培养以获取黄丝藻生物质，黄丝藻的生长方式为光合自养生长，黄丝藻生物油也来自光合自养生长所获取的黄丝藻生物质。但受限于环境、季节、产能等因素的限制，以及细胞间的遮蔽效应，黄丝藻的生长速度、所能达到的细胞密度，以及黄丝藻的生物质产率和油脂产率还有待进一步的提高。
发明内容
针对上述现有技术，本发明提供了一种有效的解决方法，对于富含ω-7脂肪酸的黄丝藻采用异养培养法和/或兼养培养法进行大规模培养，以培养获得的黄丝藻细胞作为原料来提取ω-7脂肪酸合成物。细胞中ω-7脂肪酸(主要为棕榈油酸)的含量为30％到70％。采用本发明的方法可以避免黄丝藻在规模化培养时受环境、季节、产能等因素的限制，有效提高了黄丝藻繁殖速度、生物量产率及油脂产率；为解决黄丝藻在大规模光自养培养过程中所存在的问题，从而高效迅速解决ω-7脂肪酸的生物量资源问题提供了一种重要的技术手段。
术语说明：
若无特殊说明，本发明中的“异养培养”是指在不提供光照但提供有机碳源的条件下对黄丝藻进行的培养，因此可以理解为“发酵”；具体而言，是指在培养黄丝藻时不提供光照，但其培养基中应含有适量的有机碳源、氮源、磷酸盐以及其他营养物质。在异养培养条件下，黄丝藻将有机碳源作为能量来源与合成生物质的碳源。
所述“兼养培养”是指在提供光照同时提供有机碳源的条件下对黄丝藻进行的培养，因此可以理解为“有适当光照下的发酵”；具体而言，是指在培养黄丝藻时提供适量的光照，同时，其培养基中应含有适量的有机碳源、氮源、磷酸盐以及其他营养物质。在兼养培养条件下，黄丝藻将光能和/或有机碳源作为能量来源，将有机碳源和/或二氧化碳作为合成生物质的碳源。
本发明第一方面，提供一种黄丝藻的培养方法，该方法包括对黄丝藻进行异养培养和/或进行兼养培养的步骤。
上述培养方法中，所述异养培养和/或兼养培养的步骤包括：在培养装置中加入培养基，接入无菌黄丝藻藻株进行培养，培养温度为2℃到40℃，搅拌速率1rpm到400rpm，通气速率0.01vvm到1vvm，pH值5-10，光照强度0μmol photons m-2s-1到1000μmol photons m-2s-1。
优选的，所述培养温度为25℃到30℃，搅拌速率90rpm到270rpm，通气速率0.1vvm到0.2vvm，pH值7到9，光照强度50μmol photons m-2s-1到200μmol photons m-2s-1。在优选的培养条件下，黄丝藻可以在相同的培养时间内达到更高的生物量和油脂含量。
上述培养方法中，所述培养基由有机碳源、氮源、磷酸盐以及其他营养物质组成；所述有机碳源在培养基中的浓度为0.1g/L到200g/L，氮源在培养基中的浓度为0.1g/L到20g/L，磷酸盐在培养基中的浓度为0.01g/L到5g/L。
优选的，所述有机碳源在培养基中的浓度为10g/L到60g/L，氮源在培养基中的浓度为1g/L到4g/L，磷酸盐在培养基中的浓度为0.05g/L到1g/L。
所述的有机碳源可以是葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油醛、甘油、醋酸盐、淀粉水解糖、纤维素水解糖中的一种和/或多种以任意比例混合而成的混合物。
优选的，所述有机碳源为葡萄糖。
所述的氮源可以是酵母提取物、蛋白胨、氨基酸、谷物浆液、硝酸盐、尿素、铵盐中的一种和/或多种以任意比例混合而成的混合物。
优选的，所述氮源为蛋白胨。
所述的其他营养物质是指MgSO4，CaCl2，柠檬酸，乙二胺四乙酸盐，柠檬酸铁铵，碳酸盐，ZnSO4，CuSO4，MnCl2，Na2MoO4，Co(NO3)4，H3BO3，生物素，维生素B1，维生素B12。
上述方法中，所述培养装置应是能够容纳液态和/或固态基质并维持黄丝藻无菌化生长的封闭或半封闭装置。所述的培养装置包括但不限于机械搅拌通风发酵罐、自吸发酵罐、气升发酵罐、塔式发酵罐。
上述培养方法中，所述无菌黄丝藻藻株的获得方式为：将适量抗生素添加至黄丝藻藻液中，培养2天后将黄丝藻藻体转移至无菌水中并重悬。利用生物技术领域所共知的检测手段检验重悬液是否无菌。重复本步骤，直至获得无菌的黄丝藻藻株。
所述的适量抗生素是指，工作液浓度为20mg/L到200mg/L的氯霉素或卡那霉素或链霉素或氨苄青霉素或其他抗生素。
上述培养方法中，异养培养和/或兼养培养黄丝藻的方法也可被通俗地称为黄丝藻的发酵培养。黄丝藻的发酵培养方式可以是分批发酵和/或连续(流加)发酵和/或分批补料发酵。
在本发明的一些实施例中，采用分批发酵和分批补料发酵的方式培养黄丝藻，培养6天后，生物量可以分别达到28g/L和30g/L。
本发明中所述的黄丝藻为黄丝藻属的20余种藻株，包括，但不限于，同形黄丝藻(Tribonema aequale)、近缘黄丝藻(Tribonema affine)、幽美黄丝藻(Tribonema elegans)、Tribonemagayanum、Tribonema intermixtum、小型黄丝藻(Tribonema minus)、单一黄丝藻(Tribonemamonochloron)、狭型黄丝藻(Triconema angustissimum)、蛋白核黄丝藻(Tribonema pyrenigerum)、整齐黄丝藻(Tribonema regulare)、硬壁黄丝藻(Tribonema siderophilum)、螺带黄丝藻(Tribonemaspirotaenia)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)、囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)、绿色黄丝藻(Tribonema viride)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、山田黄丝藻(Tribonemayamadanum)、丝状黄丝藻(Tribonema bombycinum)和带状黄丝藻(Tribonema vermichloris)。
优选地，本发明中所述的黄丝藻为同形黄丝藻(Tribonema aequale)、普通黄丝藻(Tribonemavulgare)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)和囊状黄丝藻Tribonema utriculosum。
上述培养方法中，所培养的黄丝藻为上述黄丝藻属中的一种或两种或更多种的组合。
本发明的第二方面，提供一种ω-7脂肪酸合成物的生产方法，所述生产方法包括对黄丝藻进行异养培养和/或进行兼养培养的步骤、对黄丝藻培养液进行采收，获得黄丝藻生物质的步骤、以及经提取和/或压榨处理，获得ω-7脂肪酸合成物的步骤。
上述生产方法中，利用生物技术领域所共知的技术手段，如离心、过滤、气浮等，对黄丝藻培养液进行采收，获得黄丝藻生物质。
上述生产方法中，获得黄丝藻生物质后，经本领域所共知的提取方法，如氯仿-甲醇提取、正己烷提取、超临界二氧化碳萃取等，或榨取方法，如热榨、冷榨等，进行处理后获得黄丝藻油脂以及ω-7脂肪酸合成物。
本发明的第三方面，提供一种ω-7脂肪酸合成物，其ω-7脂肪酸的含量为30％到70％，棕榈油酸的含量为30％到70％。
上述所公开的ω-7脂肪酸合成物可被用于生产下述但不仅限于下述领域的产品：食品、营养品、饮料、饲料、化工品、燃料、化妆品、护肤品、保健品、医药品和食品添加剂。
由本发明所述的培养方法所获得黄丝藻生物质，未经提取或榨取处理，亦可被用于生产下述但不仅限于下述领域的产品：食品、营养品、饮料、饲料、化工品、燃料、化妆品、护肤品、保健品、医药品、食品添加剂。
根据本发明生产得到的ω-7脂肪酸合成物和/或黄丝藻生物质，在食品与药品领域广为周知，ω-7脂肪酸已被证明能提高人体对胰岛素的敏感性，对糖尿病、代谢综合症有效，且没有明显的副作用。因此，本发明所公开的ω-7脂肪酸合成物、培养黄丝藻的方法、富含棕榈油酸的产品可被应用于医药品领域。
本技术领域的人员应当知晓，ω-7脂肪酸可以降低C-反应蛋白(CRP)的水平，通过减少炎症降低心脏疾病、中风的风险；ω-7脂肪酸也可以增加细胞膜的流动性，降低血液中低密度脂蛋白LDL胆固醇含量，减少血管中粥样硬化斑块形成而造成的阻塞血管，从而防止心律失常和减少高血压等。因此，本发明所公开的ω-7脂肪酸合成物、培养黄丝藻的方法、富含棕榈油酸的产品可被应用于营养品、保健品领域。
本技术领域的人员还应当知晓，ω-7脂肪酸具有很好的皮肤渗透性，其在防止皮肤老化、脂肪堆积、恢复皮肤弹性方面也具有明显的作用，是用于抗衰老化妆品理想的原料。因此，本发明所公开的ω-7脂肪酸合成物、培养黄丝藻的方法、富含棕榈油酸的产品可被应用于化妆品、护肤品领域。
此外，微藻已被广泛应用于食品、饮料、饲料、食品添加剂领域。黄丝藻作为微藻中的一类，同样也可应用于如前所述的相关领域。
作为本发明的另一项应用，棕榈油酸可直接用于高效生产工业需求量较大的辛烯。同时，棕榈油酸因其是单不饱和脂肪酸，具有非常好的抗低温和抗氧化特性，适于制取优质生物柴油。因此，本发明所公开的ω-7脂肪酸合成物(主要成分为棕榈油酸)、培养黄丝藻的方法、富含棕榈油酸的产品可被应用于化工品、燃料领域。
本发明的第四方面，提供一种产品，其由本发明所公开的黄丝藻的培养方法进行生产，或来源于由本发明所公开的培养方法所获得的黄丝藻生物质和/或黄丝藻油脂和/或ω-7脂肪酸合成物。
所述的产品可以是下述但不仅限于下述领域的产品：食品、营养品、饮料、饲料、化工品、燃料、化妆品、护肤品、保健品、医药品、食品添加剂。
本发明的有益效果：
传统的ω-7脂肪酸的原料主要为野生植物和动物，由于其种子小、产量低、地理分布窄或种群稀少等原因，导致ω-7脂肪酸原料严重不足。本发明选用富含ω-7脂肪酸的黄丝藻作为生产ω-7脂肪酸的全新原料，提供了一种可以有效提高黄丝藻繁殖速度、生物量产率及油脂产率的培养方法，避免了微藻在规模化培养时受环境、季节、产能等因素的限制，有效解决ω-7脂肪酸原料不足的现状。
附图说明
图1为黄丝藻异养培养、兼养培养与光合自养培养条件下生长对比；
图2为黄丝藻异养培养、兼养培养与光合自养培养条件下油脂含量对比；
图3为黄丝藻异养培养、兼养培养与光合自养培养条件下脂肪酸组成对比；
图4为黄丝藻在不同有机碳源条件下的生长情况；
图5为黄丝藻在不同葡萄糖初始浓度条件下的生长情况；
图6为黄丝藻在不同搅拌速率条件下的生长情况；
图7为黄丝藻在不同初始接种量条件下的生长情况；
图8为批次发酵方式下黄丝藻的生长曲线与葡萄糖浓度变化曲线；
图9为分批补料发酵方式下黄丝藻的生长曲线与葡萄糖浓度变化曲线。
具体实施方式
结合实施例对本发明作进一步的说明，应该说明的是，下述说明仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。
本发明中所用到的黄丝藻均为已记录的野生种，普通技术人员可以通过商业渠道购买得到，或从自然水体中分离纯化得到，无需进行用于专利程序的生物材料保藏。
实施例1
黄丝藻的异养和/或兼养培养方法，具体步骤如下：
(1)利用生物技术领域所共知的技术手段，将适量抗生素添加至黄丝藻藻液中，培养2天后将黄丝藻藻体转移至无菌水中并重悬。利用生物技术领域所共知的检测手段检验重悬液是否无菌。重复本步骤，直至获得无菌的黄丝藻藻株。所述的适量抗生素是指，工作液浓度为20mg/L到200mg/L的氯霉素或卡那霉素或链霉素或氨苄青霉素或其他抗生素。
(2)将含有有机碳源、氮源、磷酸盐以及其他营养物质的培养基置于培养装置中，在115℃下灭菌20分钟。
(3)待步骤(2)中的培养基温度降至室温后，将步骤(1)所获得的无菌的黄丝藻藻株接种于培养装置中，进行异养培养和/或兼养培养，其中，异养培养的条件为：在培养基中葡萄糖浓度为10g/L且不提供光照；兼养培养的条件为：在培养基中葡萄糖浓度为10g/L并提供50μmol photons m-2s-1光照的条件；培养温度为25℃，摇床转速为180rpm。
(4)培养结束后，利用生物技术领域所共知的技术手段，如过滤、气浮等，对黄丝藻培养液进行采收，获得黄丝藻生物质。
获得黄丝藻生物质后，经本领域所共知的提取方法，如氯仿-甲醇提取、正己烷提取等，或榨取方法，如热榨、冷榨等，进行处理后获得黄丝藻油脂以及ω-7脂肪酸合成物。
在异养培养和兼养培养条件下，黄丝藻的脂肪酸组成如表2所示。异养培养条件下，黄丝藻总脂含量为干生物量的40.3％，其中，ω-7脂肪酸的含量为总脂肪酸的58.4％，棕榈油酸的含量为总脂肪酸的58.4％。兼养培养条件下，黄丝藻总脂含量为干生物量的43.5％，其中，ω-7脂肪酸的含量为总脂肪酸的50.1％，棕榈油酸的含量为总脂肪酸的50.1％。
表2异养培养和兼养培养条件下黄丝藻脂肪酸组成
实施例2
黄丝藻在异养培养、兼养培养和光合自养培养条件下的生长、油脂含量及脂肪酸组成
在异养培养、兼养培养和光合自养培养条件下分别对黄丝藻进行培养。异养培养条件为：葡萄糖浓度为10g/L，蛋白胨浓度为2g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，光照强度为0μmol photons m-2s-1，初始生物量为0.3g/L。兼养培养条件为：葡萄糖浓度为10g/L，蛋白胨浓度为2g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，光照强度为50μmol photons m-2s-1，初始生物量为0.3g/L。光合自养培养条件为：葡萄糖浓度为0g/L，蛋白胨浓度为0g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，光照强度为50μmol photons m-2s-1，初始生物量为0.3g/L。所述BG11培养基的各营养成分如表3所示。以250mL三角瓶作为培养容器，单个培养体积为100mL。将所述三角瓶置于摇床中进行震荡培养，温度和摇床转速分别设置为25℃和180rpm。在培养过程中，每天定时取样测定其生物量(干重)。培养结束后，收集黄丝藻生物质，经冷冻干燥后以氯仿-甲醇溶液提取黄丝藻油脂，并用气相色谱法分析其脂肪酸组成。
表3 BG11培养液中营养盐组成和浓度
如图1所示，在三种不同的培养方式下，黄丝藻在兼养培养时生长速度最快，所能达到的最大生物量也最高，培养2天后生物量即可达到5.5g/L。异养培养条件下，黄丝藻的生长速度略有减缓，所能达到的最大生物量也有所降低，培养3天后生物量可达到2.7g/L左右。光合自养培养条件下，黄丝藻的生长速度大幅减缓，培养结束时所能达到的生物量仅为0.8g/L，远远低于另外两种培养方式。由此可见，本发明所提供的异养培养和兼养培养黄丝藻的方法可使黄丝藻在更短的时间内获得更高的生物量。
如图2所示，在三种不同的培养方式下，黄丝藻在兼养培养时油脂含量最高，异养培养次之，光合自养培养最低。但三者之间的差别并不大，且油脂含量均维持在40％左右。由此可见，本发明所提供的异养培养和兼养培养黄丝藻的方法在提高黄丝藻生长速度和生物量的同时，保持了其高油脂含量的特性。
图3所示为三种不同培养方式下黄丝藻的脂肪酸组成。三种培养方式下，黄丝藻的脂肪酸组成均以C16:0和C16:1(即棕榈油酸)为主，这两种脂肪酸的含量约为总脂肪酸的80％左右，其中，C16:1的含量最高，约为总脂肪酸的50％到60％。需要指出的是，在兼养培养和光合自养培养这两种条件下，黄丝藻的脂肪酸组成基本相同，而在异养培养条件下，黄丝藻的脂肪酸组成却与前两者有一定差异，具体表现为：C16:0的含量从28％减少至19％，同时，C16:1的含量从50％增加至58％。
实施例3
不同有机碳源对黄丝藻生长的影响
在兼养培养条件下，以葡萄糖、甘油和乙酸钠分别作为有机碳源对黄丝藻进行培养。所述兼养培养条件为：有机碳源浓度为10g/L，蛋白胨浓度为2g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，光照强度为50μmol photons m-2s-1，初始生物量为0.3g/L。以250mL三角瓶作为培养容器，单个培养体积为100mL。将所述三角瓶置于摇床中进行震荡培养，温度和摇床转速分别设置为25℃和180rpm。在培养过程中，每天定时取样测定其生物量(干重)。
如图4所示，在本实施例中所选取的三种有机碳源中，葡萄糖效果最佳。黄丝藻可利用葡萄糖进行快速生长，培养2天后生物量即可达到5.5g/L。甘油和乙酸钠也可作为黄丝藻生长的有机碳源，但生长速度较为缓慢。
实施例4
葡萄糖初始浓度对黄丝藻生长的影响
在兼养培养条件下，以葡萄糖作为有机碳源对黄丝藻进行培养。所述兼养培养条件为：葡萄糖浓度为5g/L～60g/L，蛋白胨浓度为2g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，光照强度为50μmol photons m-2s-1，初始生物量为0.3g/L。以250mL三角瓶作为培养容器，单个培养体积为100mL。将所述三角瓶置于摇床中进行震荡培养，温度和摇床转速分别设置为25℃和180rpm。在培养过程中，每天定时取样测定其生物量(干重)。
如图5所示，随着葡萄糖初始浓度的增加，黄丝藻所能达到的最高生物量也逐步提高，当葡萄糖初始浓度为5g/L时，所能达到的最大生物量为3g/L左右，当葡萄糖初始浓度增加到60g/L时，所能达到的最大生物量为28g/L左右。随着葡萄糖初始浓度的增加，达到最大生物量所需的培养时间也逐渐增加。需要指出的是，当葡萄糖初始浓度较高时，在培养开始的1到2天内，黄丝藻的生长受到一定程度的抑制，在此期间，生长相对缓慢；但随着培养时间的延长，这种抑制作用不再明显，黄丝藻的生物量得以迅速增加。
实施例5
搅拌速率对黄丝藻生长的影响
在兼养培养条件下，以葡萄糖作为有机碳源对黄丝藻进行培养。所述兼养培养条件为：葡萄糖浓度为10g/L，蛋白胨浓度为2g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，光照强度为50μmol photons m-2s-1，初始生物量为0.3g/L。以250mL三角瓶作为培养容器，单个培养体积为100mL。将所述三角瓶置于摇床中进行震荡培养，温度设置为25℃，搅拌速率设置为90～270rpm。在培养过程中，每天定时取样测定其生物量(干重)。
如图6所示，当搅拌速率为90rpm和180rpm时，黄丝藻生长迅速，培养2天后即可达到稳定期，且两者所能达到的最大生物量差别较小。当搅拌速率为270rpm时，黄丝藻生长明显减缓，生物量在整个培养过程中持续增加，直至达到5g/L左右。这一结果表明，相对温和的搅拌环境更有利于黄丝藻的生长。
实施例6
初始接种量对黄丝藻生长的影响
在兼养培养条件下，以葡萄糖作为有机碳源对黄丝藻进行培养。所述兼养培养条件为：葡萄糖浓度为10g/L，蛋白胨浓度为2g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，光照强度为50μmol photons m-2s-1，培养温度为25℃，初始接种量为0.1～3g/L。以1500mL柱状气升式反应器作为培养装置，单个培养体积为1000mL。将过滤后的空气通入所述的柱状气升式反应器，通气速率为0.1vvm。在培养过程中，每天定时取样测定其生物量(干重)。
结果如图7所示，随着初始接种量的增加，黄丝藻所能达到的最大生物量显著提高，且达到最大生物量所需的培养时间也明显缩短。
实施例7
黄丝藻的批次发酵培养
在兼养培养条件下，以葡萄糖作为有机碳源对黄丝藻进行批次发酵培养。所述兼养培养条件为：葡萄糖浓度为60g/L，蛋白胨浓度为12g/L，磷酸盐为0.4g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，初始接种量为0.3g/L。以10L透光发酵罐作为培养装置，培养体积为8L。以外置LED灯作为光源，光照强度为50μmol photons m-2s-1。将过滤后的空气通入所述的发酵罐，通气速率为0.1vvm。培养温度和搅拌速率分别设置为25℃和180rpm。在培养过程中，每天定时取样测定其生物量(干重)和培养基中的葡萄糖残余量。所述葡萄糖残余量的测定由生物传感器来进行。
图8所示为批次发酵方式下黄丝藻的生长曲线与培养基中葡萄糖浓度变化曲线。由图可知，在培养开始的第1天，黄丝藻的生长受到一定程度的抑制，随后黄丝藻开始快速生长，与之相应地，培养液中的葡萄糖含量也迅速降低。当培养至第6天时，培养基中的葡萄糖含量降为0，此时，黄丝藻的生物量可达到28g/L。
实施例8
黄丝藻的分批补料发酵培养
在兼养培养条件下，以葡萄糖作为有机碳源对黄丝藻进行分批补料发酵培养。所述兼养培养条件为：葡萄糖浓度为10g/L，蛋白胨浓度为2g/L，磷酸盐为0.4g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基，初始接种量为0.3g/L。其中，每天向培养基中补加10g/L的葡萄糖以及2g/L的蛋白胨。以10L透光发酵罐作为培养装置，培养体积为8L。以外置LED灯作为光源，光照强度为50μmol photons m-2s-1。将过滤后的空气通入所述的发酵罐，通气速率为0.1vvm。培养温度和搅拌速率分别设置为25℃和180rpm。在培养过程中，每天定时取样测定其生物量(干重)和培养基中的葡萄糖残余量。所述葡萄糖残余量的测定由生物传感器来进行。需要说明的是，每天的取样过程需在补加葡萄糖和蛋白胨之前进行。
图9所示为分批补料发酵方式下黄丝藻的生长曲线与培养基中葡萄糖浓度变化曲线。由图可知，在培养开始后，黄丝藻便可保持较快的生长速度，直至培养结束。与之相应地，每天补加的葡萄糖亦可在次日再次补加葡萄糖之前几乎完全被黄丝藻吸收利用。黄丝藻在分批补料发酵培养6天之后生物量可以达到30g/L，生物量产率为5g/L/d。培养结束后，收集黄丝藻生物质，经冷冻干燥后以氯仿-甲醇溶液提取黄丝藻油脂，结果测得黄丝藻油脂含量可以达到生物质干重的45％，油脂产率为2.25g/L/d。用气相色谱法分析其脂肪酸组成，结果显示，ω-7脂肪酸的含量可以达到总脂肪酸的50％，ω-7脂肪酸的产率为1.125g/L/d。在黄丝藻中，所述ω-7脂肪酸为棕榈油酸，这意味着，棕榈油酸的含量为总脂肪酸的50％，棕榈油酸的产率为1.125g/L/d。

Claims (11)

1.一种黄丝藻的培养方法，其特征在于，该方法包括对黄丝藻进行异养培养和/或进行兼养培养的步骤；
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，采用分批发酵和/或连续发酵和/或分批补料发酵的模式实施所述黄丝藻藻株的异养培养和/或兼养培养。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述黄丝藻选自同形黄丝藻(Tribonemaaequale)、近缘黄丝藻(Tribonema affine)、幽美黄丝藻(Tribonema elegans)、Tribonema gayanum、Tribonema intermixtum、小型黄丝藻(Tribonema minus)、单一黄丝藻(Tribonema monochloron)、狭型黄丝藻(Triconema angustissimum)、蛋白核黄丝藻(Tribonema pyrenigerum)、整齐黄丝藻(Tribonema regulare)、硬壁黄丝藻(Tribonema siderophilum)、螺带黄丝藻(Tribonemaspirotaenia)、拟丝黄丝藻(Tribonema ulotrichoides)、囊状黄丝藻(Tribonema utriculosum)、绿色黄丝藻(Tribonema viride)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、山田黄丝藻(Tribonemayamadanum)、丝状黄丝藻(Tribonema bombycinum)和带状黄丝藻(Tribonema vermichloris)中的一种或两种或更多种的组合；优选的，所述黄丝藻选自同形黄丝藻(Tribonema aequale)、普通黄丝藻(Tribonema vulgare)、小型黄丝藻(Tribonema minus)、拟丝黄丝藻(Tribonemaulotrichoides)和囊状黄丝藻Tribonema utriculosum中的一种或两种或更多种的组合。
4.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述异养培养和/或兼养培养的步骤包括：在培养装置中加入培养基，接入无菌黄丝藻藻株进行培养，培养温度为2℃到40℃，搅拌速率1rpm到400rpm，通气速率0.01vvm到1vvm，pH值5-10，光照强度0μmol photons m-2s-1到1000μmol photons m-2s-1；优选的，所述培养温度为25℃到30℃，搅拌速率90rpm到270rpm，通气速率0.1vvm到0.2vvm，pH值7-9，光照强度50μmol photons m-2s-1到200μmol photons m-2s-1。
5.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述培养基由有机碳源、氮源、磷酸盐以及其他营养物质组成；所述有机碳源在培养基中的浓度为0.1g/L到200g/L，氮源在培养基中的浓度为0.1g/L到20g/L，磷酸盐在培养基中的浓度为0.01g/L到5g/L；优选的，所述有机碳源在培养基中的浓度为10g/L到60g/L，氮源在培养基中的浓度为1g/L到4g/L，磷酸盐在培养基中的浓度为0.05g/L到1g/L。
6.如权利要求5所述的培养方法，其特征在于，所述的有机碳源为葡萄糖、果糖、麦芽糖、蔗糖、甘油醛、甘油、醋酸盐、淀粉水解糖、纤维素水解糖中的一种和/或多种以任意比例混合而成的混合物；
所述的氮源为酵母提取物、蛋白胨、氨基酸、谷物浆液、硝酸盐、尿素、铵盐中的一种和/或多种以任意比例混合而成的混合物；
所述的其他营养物质包括MgSO4，CaCl2，柠檬酸，乙二胺四乙酸盐，柠檬酸铁铵，碳酸盐，ZnSO4，CuSO4，MnCl2，Na2MoO4，Co(NO3)4，H3BO3，生物素，维生素B1和维生素B12。
7.如权利要求4所述的培养方法，其特征在于，所述培养装置是能够容纳液态和/或固态基质并维持黄丝藻无菌化生长的封闭或半封闭装置；优选的，所述培养装置是机械搅拌通风发酵罐、自吸发酵罐、气升发酵罐、塔式发酵罐中的一种或两种或多种联用的组合。
8.一种ω-7脂肪酸合成物的生产方法，其特征在于，所述生产方法包括权利要求1中所述的对黄丝藻进行异养培养和/或进行兼养培养的步骤，以及对黄丝藻培养液进行采收，获得黄丝藻生物质的步骤、和经萃取和/或压榨处理，获得ω-7脂肪酸合成物的步骤；
所述获得黄丝藻生物质的步骤优选为：采用离心和/或过滤和/或气浮的方式，对黄丝藻培养液进行采收，获得黄丝藻生物质。
9.一种通过权利要求8所述的生产方法制备的ω-7脂肪酸合成物，其特征在于，该ω-7脂肪酸合成物中，ω-7脂肪酸的含量不少于总脂肪酸的30％，棕榈油酸的含量不少于总脂肪酸的30％。
10.权利要求9所述的ω-7脂肪酸合成物在生产食品、营养品、饮料、饲料、化工品、燃料、化妆品、护肤品、保健品、医药品和/或食品添加剂中的应用。
11.一种产品，其特征在于，其由权利要求1所述的黄丝藻的培养方法进行生产，或来源于由权利要求1的培养方法所获得的黄丝藻生物质和/或黄丝藻油脂和/或权利要求7的生产方法所获得的ω-7脂肪酸合成物；
产品中ω-7脂肪酸的含量为0.1％到99.9％，优选为30％到70％。
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