CN110923185B - 一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法 - Google Patents

一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法，属于微藻生物技术领域，具体的，所述培养方法为通过添加外源性的油脂合成前体物质至微藻培养液中以提高微藻细胞油脂含量。本发明所述培养方法有效避免了传统微藻油脂积累诱导方法过程复杂、成本高昂、效果有限的不足，适用于各种微藻的培养以及微藻油脂积累的促进和提升，尤其适用于生产具有高附加值的珍稀脂肪酸，如棕榈油酸、DHA、EPA等，可实现了低值油脂的高值化，经济效益显著，具有良好的工业化应用前景。

Description

一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法
技术领域
本发明属于微藻生物技术领域，涉及一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法，具体的，涉及一种在微藻培养过程中，通过往培养基内添加外源性油脂前体物质以提高微藻细胞油脂含量的方法。
背景技术
该部分内容仅提供与本发明有关的背景信息，并不必然构成现有技术。
微藻在自然界分布广泛、种类繁多，因其具有个体小、光合效率高、生长迅速、环境适应性强、油脂含量高等特点，被认为是生产生物油脂最具潜力的生物资源。个别微藻如黄丝藻、小球藻、红球藻、微拟球藻、裂殖壶藻、裸藻、硅藻等因其油脂中富含棕榈油酸、DHA、EPA、虾青素等具有重要医疗保健作用的成分而备受重视。另外，微藻在生长过程中可固定二氧化碳，同时吸收水体中的氮、磷等营养物质，因此其在废气、废水处理领域也具有一定潜力。美国国家可再生能源实验室探索了利用微藻生产生物油脂的可行性，筛得300余株生长迅速、油脂含量高的微藻。近年来，我国也陆续开展了一系列相关领域的研究，取得了显著成就。
然而，虽然微藻能够积累油脂，但在正常的生长条件下微藻细胞的含油量一般在5-25％，远不能满足微藻油脂的生产需求，且油脂含量低导致油脂的提取效率低、成本高。因此，如何从培养方法入手快速有效的提高微藻的油脂产出，是目前微藻研究的热点之一。
为了提高微藻油脂含量，常用的油脂积累调控手段有控制培养基的碳氮比、氮源种类或浓度、培养温度、pH值、盐度等，进而在这些胁迫条件下促使微藻积累油脂，但这种调控手段大都收效甚微(Wei AL,Zhang XW,Wei D,et al.Effects of cassava starchhydrolysate on cell growth and lipid accumulation of the heterotrophicmicroalgae Chlorella protothecoides.Journal of Industrial Microbiology &Biotechnology,2009,36:1383-1389.Shen XF,Liu JJ,Chauhan AS,et al.Combiningnitrogen starvation with sufficient phosphorus supply for enhanced biodieselproductivity of Chlorella vulgaris fed on acetate.Algal Research,2016,17:261-267.)。中国专利CN 104195189A公开了一种提高微藻油脂产率的方法，具体方法为先用含有植物激素的培养基光自养培养小球藻，到稳定期后离心收获藻体，再将其转移至胁迫培养基中培养，以提高小球藻的油脂含量。该方法培养过程复杂，离心能耗较大，不适于规模化微藻培养。中国专利CN 101016514A通过微波处理微藻以提高微藻生物量，由于微波器件难于大型化，且耗能高，升热大，因此不适合工业应用。中国专利CN 102021208A公开了一种快速积累微藻胞内油脂的方法，即所谓的异养培养--稀释--光诱导，但该方法主要还是解决微藻生物量快速增殖，对油脂的积累影响不大，且如此复杂的过程对大规模工业过程是很难实现的。上述技术总体思路都是通过培养条件调控来提高微藻油脂产率。但这些调控方式主要是通过抑制微藻的生长使其生化过程转向油脂合成，结果是微藻产率大幅度降低。显然这种方法难以从根本上解决油脂产率低的问题。
一般地，微藻细胞内油脂的生物合成主体路线主要包括脂肪酸的从头合成以及脂质整合两个部分。在第一个过程中，糖酵解形成的丙酮酸在丙酮酸脱氢酶(PDH)的作用下生成乙酰辅酶A(acetyl-CoA)，在质体中，乙酰辅酶A在乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)的催化下形成丙二酰辅酶A(malonyl-CoA)，之后，丙二酰基从CoA转移到蛋白辅因子酰基载体蛋白(ACP)上形成malonyl-ACP。Malonyl-ACP在脂肪酸合成酶(FAS)的催化下经过一系列碳链加长和脱饱和反应后形成以C16和C18为主的脂肪酸-ACP。在第二个过程中，质体内的脂肪酸从ACP上解离，形成游离脂肪酸，转出质体后在内质网上经GPAT、LPAAT、PAP以及DGAT等一系列酶的催化后渐次形成溶血磷脂酸(LPA)、磷脂酸(PA)、二酰甘油(DAG)，最终组装形成甘油三酯(TAG)。在此过程中，PA和DAG亦可作为底物合成磷脂酰胆碱、半乳糖脂等极性脂。
因此，在微藻油脂合成的整个途径中，第一个过程是油脂合成的源头，其中乙酰辅酶A在ACCase的催化下形成丙二酰辅酶A被认为是第一个关键限速步骤。近些年有很多研究试图利用基因工程过表达ACCase来解除丙二酰辅酶A合成的限速问题，但这些研究仅局限于基础研究层面，未能实现工业应用。显然，要想提高微藻的油脂积累，从源头入手，通过提供充足的油脂合成前体可能是更为直接和有效的方法。然而迄今国内和国际上尚未有为微藻提供油脂合成前体物质以提高微藻油脂含量的专利和文献报道。
发明内容
针对上述技术不足和技术空缺，本发明提供了一种有效的解决方法，通过添加价格低廉的外源性的油脂合成前体物质至微藻藻液中，外源性前体物质经微藻细胞吸收后在胞内一系列酶的催化作用下转化成微藻自身的油脂，适用于各种微藻的培养以及微藻油脂积累的促进。特别是对于某些高附加值的珍稀脂肪酸，如棕榈油酸、DHA、EPA等的生产，可以通过添加低值油脂合成前体来加速合成目标脂肪酸，从而实现低值油脂的高值功能性油脂转化，具有良好的工业化生产价值。
本发明的目的之一在于提供一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法。
本发明的目的之二在于提供上述方法制备得到的微藻油脂。
为实现上述目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的第一个方面，提供一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法，所述方法包括：在微藻培养过程中，向中添加外源性油脂合成前体物质。
进一步的，所述微藻培养包括光合自养、异养和/或兼养培养；
进一步的，所述添加的方式包括一次性添加、分批次添加和/或连续流加；
进一步的，外源性油脂合成前体物质添加时间并不固定，可以在培养初期添加，或者在培养过程中的任意时期添加；
进一步的，添加外源性油脂合成前体物质后，继续培养微藻细胞1-10天，使前体物质被微藻细胞充分吸收，并进一步转化为胞内油脂，提高微藻油脂产量；
进一步的，所述外源性油脂合成前体物质包括但不限于脂肪酸及其脂肪酸盐、低分子有机酸及其盐、油脂及其油脂水解物和/或皂化产物、含有脂肪酸基团的化合物中的任意一种或多种；
更进一步的，
所述脂肪酸包括但不限于丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)、月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)中的任意一种或多种；
所述低分子有机酸包括但不限于丙酸和/或丙二酸；
所述低分子有机酸盐包括但不限于丙酸盐和/或丙二酸盐；
所述油脂包括但不限于豆油、花生油、橄榄油、葵花籽油、玉米油、菜籽油中的任意一种或多种。
进一步的，所述外源性油脂合成前体物质在藻液培养基中的添加总量为0.1g/L～50g/L(优选为1g/L～3g/L)。
进一步的，在添加这些外源性油脂合成前体物质的过程中，向微藻培养液中添加甘油、乙醇、二甲基亚砜、或者具有助溶或增加细胞渗透性的物质，以使微藻细胞能更快、更充分地吸收并转化外源性油脂合成前体物质。
进一步的，所述的微藻属于绿藻门、裸藻门、轮藻门、金藻门、黄藻门、硅藻门、甲藻门、蓝藻门、褐藻门、红藻门、隐藻门中的一种或多种；
更进一步的，所述微藻包括但不限于黄丝藻、小球藻、栅藻、红球藻、微拟球藻、裂殖壶藻、裸藻、硅藻、金藻、衣藻、盐藻。
进一步的，培养结束时收集微藻细胞提取油脂。
本发明的第二个方面，提供上述方法制备得到的微藻油脂。
本发明的有益技术效果：
本发明提供了一种提高微藻油脂含量的培养方法，该方法通过添加价格低廉的外源性的油脂合成前体物质至微藻培养基中，外源性前体物质经微藻细胞吸收后在胞内转化成微藻自身的油脂。
本发明所述方法具有操作方便、成本低廉、效果显著等优点，本发明所述方法有效避免了传统微藻油脂积累诱导方法过程复杂、成本高昂、效果有限的不足，适用于各种微藻的培养以及微藻油脂积累的促进和提升，尤其适用于生产具有高附加值的珍稀脂肪酸，如棕榈油酸、DHA、EPA等。本发明实质上是通过往微藻培养基中添加价格低廉的外源性油脂合成前体物质，通过微藻的吸收与转化，合成微藻细胞内具有更高价值的珍惜脂肪酸，从而实现低值油脂的高值化，经济效益显著。
综上，本发明从根本上，即从微藻的油脂合成途径上解决了微藻油脂积累量低的问题，填补了国内和国际上相关技术的空白，极具工业化生产及应用前景。
附图说明
图1为以不同脂肪酸作为外源性油脂合成前体物质时黄丝藻的生长曲线；
图2为以不同脂肪酸作为外源性油脂合成前体物质时黄丝藻的油脂含量；
图3为以丁酸(C4:0)作为外源性油脂合成前体物质时黄丝藻的脂肪酸组成；
图4为以己酸(C6:0)作为外源性油脂合成前体物质时黄丝藻的脂肪酸组成；
图5为以肉豆蔻酸(C14:0)作为外源性油脂合成前体物质时黄丝藻的脂肪酸组成；
图6为以豆油作为外源性油脂合成前体物质时小球藻的脂肪酸组成；
图7为以丙二酸作为外源性油脂合成前体物质时栅藻的脂肪酸组成。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
术语解释和说明：
若无特殊说明，本发明中的“自养培养”是指在提供光照和无机碳源的条件下对微藻进行的培养。
本发明中的“异养培养”是指在不提供光照但提供有机碳源的条件下对微藻进行的培养，因此可以理解为“发酵”；具体而言，是指在培养微藻时不提供光照，但其培养基中应含有适量的有机碳源、氮源、磷酸盐以及其他营养物质。在异养培养条件下，微藻将有机碳源作为能量来源与合成生物质的碳源。
本发明中的“兼养培养”是指在提供光照同时提供有机碳源的条件下对微藻进行的培养，因此可以理解为“有适当光照下的发酵”；具体而言，是指在培养微藻时提供适量的光照，同时，其培养基中应含有适量的有机碳源、氮源、磷酸盐以及其他营养物质。在兼养培养条件下，微藻将光能和/或有机碳源作为能量来源，将有机碳源和/或无机碳作为合成生物质的碳源。
如前所述，部分微藻的油脂富含具有重要医疗保健作用的高附加值成分，但这些微藻在正常的生长条件下细胞的含油量一般在5-25％，远不能满足微藻油脂的生产需求。并且，微藻的大规模培养水平有限，使得微藻油脂价格居高不下。微藻油脂产能的不足成为制约微藻油脂产业，尤其是以微藻油脂为来源的重要医药保健品产业发展的瓶颈。常用的微藻油脂积累调控手段有控制培养基的碳氮比、氮源种类或浓度、培养温度、pH值、盐度等，但这些调控手段操作过程复杂、成本较高、油脂提升效果不明显，因而难以从根本上解决油脂产率低的问题。
有鉴于此，本发明的一个具体实施方式中，提供一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法，所述方法包括：在微藻培养过程中，向微藻培养基中添加外源性油脂合成前体物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述微藻培养包括光合自养、异养和/或兼养培养。
本发明的又一具体实施方式中，对微藻培养基不做特别限定，本领域技术人员可自行选择适于微藻生长繁殖的培养基，如BG11培养基、f/2培养基或E3培养基。
本发明的又一具体实施方式中，所述添加的方式包括一次性添加、分批次添加和/或连续流加。
本发明的又一具体实施方式中，添加时间并不固定，可以在培养初期添加，或者在培养过程中的任意时期添加，如在微藻培养至3-10天任意时间内进行添加。
本发明的又一具体实施方式中，添加外源性油脂合成前体物质后，继续培养微藻细胞1-10天，使前体物质被微藻细胞充分吸收，并进一步转化为胞内油脂。
本发明的又一具体实施方式中，所述外源性油脂合成前体物质包括但不限于脂肪酸及其脂肪酸盐、低分子有机酸及其盐、油脂及其油脂水解物和/或皂化产物、含有脂肪酸基团的化合物中的任意一种或多种；
本发明的又一具体实施方式中，
所述脂肪酸包括但不限于丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)、月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)中的任意一种或多种；
需要说明的是，由于脂肪酸尤其是长链脂肪酸在水中溶解度较低，因此添加脂肪酸时优选先进行皂化处理，以提高脂肪酸在水中的溶解度；
所述低分子有机酸包括但不限于丙酸和/或丙二酸；
所述低分子有机酸盐包括但不限于丙酸盐和/或丙二酸盐。
所述油脂包括但不限于豆油、花生油、橄榄油、葵花籽油、玉米油、菜籽油中的任意一种或多种。
本发明的又一具体实施方式中，所述外源性油脂合成前体物质在藻液培养基中的添加总量为0.1g/L～50g/L(优选为1g/L～3g/L)。
本发明的又一具体实施方式中，在添加这些外源性油脂合成前体物质的过程中，向微藻培养液中添加甘油、乙醇、二甲基亚砜、或者其他具有助溶或增加细胞渗透性的物质，以使微藻细胞能更快、更充分地吸收并转化外源性油脂合成前体物质。
本发明的又一具体实施方式中，所述的微藻包括但不限于黄丝藻、小球藻、栅藻、红球藻、微拟球藻、裂殖壶藻、裸藻、硅藻、金藻、衣藻、盐藻。
本发明的又一具体实施方式中，培养结束时收集微藻细胞提取油脂。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述培养方法制备得到的微藻油脂。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的试验方法，通常按照常规条件进行。同时本发明实施例中所用到的微藻均为已记录的野生种，普通技术人员可以通过商业渠道购买得到，或从自然水体中分离纯化得到，无需进行用于专利程序的生物材料保藏。
实施例1
在兼养培养条件下以不同脂肪酸作为外源性油脂合成前体物质提高黄丝藻细胞油脂含量，具体步骤如下：
在以下培养条件下培养黄丝藻：葡萄糖分批次补料添加，总浓度为70g/L，尿素浓度为2g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基(表1)，光照强度为50μmol photons m-2s-1，初始生物量为2g/L。培养至第3天时，分别一次性添加1～3g/L不同的外源脂肪酸，包括：丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)和月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)。由于脂肪酸尤其是长链脂肪酸在水中的溶解度较低，在向培养基中添加前可对其先进行皂化处理。具体的方法为：将1g脂肪酸加至15mL去离子水中，加热至70℃，逐滴加入2M的氢氧化钾溶液并伴以快速的搅拌，直至溶液的pH升高至9.0左右，之后将溶液体积补至20mL，即配置完成50g/L的脂肪酸母液，灭菌备用。长链脂肪酸母液冷却放置后会产生晶体沉淀，使用前需适当加热。继续培养至8天，通过离心或过滤的方式收集藻细胞，之后用40℃的热乙醇对收获的藻泥快速冲洗三遍，洗去培养液中残余的外源脂肪酸。藻细胞经冷冻干燥后以氯仿-甲醇溶液提取黄丝藻油脂，并用气相色谱法分析其脂肪酸组成。如图1所示，与不添加外源脂肪酸的对照相比，丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)等较短碳链和肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)等较长碳链的脂肪酸对黄丝藻的异养生长有不同程度的小幅抑制，但最终生物量都能达到30g/L以上，甚至高于对照组，而碳链长度居中的辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)和月桂酸(C12:0)则抑制了黄丝藻的生长，说明这三种脂肪酸的添加量需要降低。从油脂含量来看(图2)，外源脂肪酸的添加使得黄丝藻的油含量从对照组的不足25％提高到了34.1％以上，最高可达42.2％，油脂产量达到15.1g/L，增加幅度接近1倍。图3所示为以丁酸(C4:0)作为外源性油脂合成前体物质时黄丝藻的脂肪酸组成，该组成与不添加外源脂肪酸的对照组差别不显著，即添加外源脂肪酸后不影响黄丝藻藻油的品质，不影响高值棕榈油酸在黄丝藻藻油中的含量。
表1BG11培养液中营养盐组成和浓度
Figure BDA0001804574200000081
实施例2
在异养培养条件下以不同脂肪酸作为外源性油脂合成前体物质提高黄丝藻细胞油脂含量，具体步骤如下：
在以下培养条件下培养黄丝藻：葡萄糖分批次补料添加，总浓度为70g/L，尿素浓度为2g/L，其他营养盐浓度参照BG11培养基(表1)，初始生物量为2g/L。培养至第3天时，分别一次性添加1～3g/L不同的外源脂肪酸，包括：丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)和月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)。继续培养至8天，通过离心或过滤的方式收集藻细胞，之后用40℃的热乙醇对收获的藻泥快速冲洗三遍，洗去培养液中残余的外源脂肪酸。藻细胞经冷冻干燥后以氯仿-甲醇溶液提取黄丝藻油脂，并用气相色谱法分析其脂肪酸组成。经测定，添加丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)等外源脂肪酸的异养黄丝藻细胞的油含量分别为37％、35％、43％和35％。图4所示为以己酸(C6:0)作为外源性油脂合成前体物质时黄丝藻的脂肪酸组成，该组成与不添加外源脂肪酸的对照组差别不显著，即添加外源脂肪酸后不影响黄丝藻藻油的品质，不影响高值棕榈油酸在黄丝藻藻油中的含量。
实施例3
在自养培养条件下以不同脂肪酸作为外源性油脂合成前体物质提高黄丝藻细胞油脂含量，具体步骤如下：
在以下培养条件下培养黄丝藻：光照强度为100μmol photons m-2s-1，，其他营养盐浓度参照BG11培养基(表1)，初始生物量为0.5g/L。培养至第10天时，分别一次性添加1～3g/L不同的外源脂肪酸，包括：丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、辛酸(C8:0)、癸酸(C10:0)和月桂酸(C12:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)。继续培养至16天，通过离心或过滤的方式收集藻细胞，之后用40℃的热乙醇对收获的藻泥快速冲洗三遍，洗去培养液中残余的外源脂肪酸。藻细胞经冷冻干燥后以氯仿-甲醇溶液提取黄丝藻油脂，并用气相色谱法分析其脂肪酸组成。经测定，添加丁酸(C4:0)、己酸(C6:0)、肉豆蔻酸(C14:0)、软脂酸(C16:0)等外源脂肪酸的自养黄丝藻细胞的油含量分别提高了1.2～1.3倍。图5所示为以肉豆蔻酸(C14:0)作为外源性油脂合成前体物质时黄丝藻的脂肪酸组成，该组成与不添加外源脂肪酸的对照组差别不显著，即添加外源脂肪酸后不影响黄丝藻藻油的品质，不影响高值棕榈油酸在黄丝藻藻油中的含量。
实施例4
在自养培养条件下以豆油(植物油脂)作为外源性油脂合成前体物质提高小球藻细胞油脂含量，具体步骤如下：
在以下培养条件下培养小球藻：光照强度为100μmol photons m-2s-1，其他营养盐浓度参照BG11培养基(表1)，初始生物量为0.5g/L。培养至第10天时，分别添加一次性1～3g/L的豆油。继续培养至16天，通过离心或过滤的方式收集藻细胞，之后用40℃的热乙醇对收获的藻泥快速冲洗三遍，洗去培养液中残余的豆油。藻细胞经冷冻干燥后以氯仿-甲醇溶液提取小球藻油脂，并用气相色谱法分析其脂肪酸组成。经测定，添加1g/L、2g/L以及3g/L豆油的自养小球藻细胞的油含量分别提高了1.4～1.5倍。图6所示为添加3g/L的外源性油脂合成前体物质豆油时小球藻的脂肪酸组成，该组成与不添加外源脂肪酸的对照组差别不显著，即添加外源油脂后不影响小球藻藻油的品质。
实施例5
在自养培养条件下以丙二酸作为外源性油脂合成前体物质提高栅藻细胞油脂含量，具体步骤如下：
在以下培养条件下培养栅藻：光照强度为100μmol photons m-2s-1，其他营养盐浓度参照BG11培养基(表1)，初始生物量为0.5g/L。培养至第10天时，分别一次性添加1～3g/L的丙二酸。继续培养至16天，通过离心或过滤的方式收集藻细胞。藻细胞经冷冻干燥后以氯仿-甲醇溶液提取栅藻油脂，并用气相色谱法分析其脂肪酸组成。经测定，添加1g/L、2g/L以及3g/L的丙二酸使自养栅藻细胞的油含量分别提高了1.3～1.5倍。图7所示为添加2g/L的外源性油脂合成前体物质丙二酸时栅藻的脂肪酸组成，该组成与不添加外源脂肪酸的对照组差别不显著，即添加外源丙二酸后不影响栅藻藻油的品质。
应注意的是，以上实例仅用于说明本发明的技术方案而非对其进行限制。尽管参照所给出的实例对本发明进行了详细说明，但是本领域的普通技术人员可根据需要对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围。

Claims (7)

1.一种提高微藻细胞油脂含量的培养方法，所述方法包括：在微藻培养过程中，向微藻培养基中添加外源性油脂合成前体物质；
所述微藻为黄丝藻时，所述外源性油脂合成前体物质为丁酸、己酸、肉豆蔻酸、软脂酸，及上述脂肪酸的盐；
所述微藻为小球藻时，所述外源性油脂合成前体物质为豆油；
所述微藻为栅藻时，所述外源性油脂合成前体物质为丙二酸及其盐。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述微藻培养包括光合自养、异养和/或兼养培养。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述添加的方式包括一次性添加、分批次添加或连续流加。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，添加时间不固定，可在培养过程中的任意时期添加。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，添加外源性油脂合成前体物质后，继续培养微藻细胞1-10天。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述外源性油脂合成前体物质在藻液培养基中的添加总量为0.1g/L~50g/L。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述方法还包括培养结束时收集微藻细胞提取油脂。
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