CN108102920B

CN108102920B - 一株黄丝藻及其培养与应用

Info

Publication number: CN108102920B
Application number: CN201711252249.1A
Authority: CN
Inventors: 白雪梅; 吴洪; 李青; 尹顺吉; 王慧岭; 王琳; 杨巧利; 刘芳伟; 陈昱; 朱振旗
Original assignee: ENN Science and Technology Development Co Ltd
Current assignee: ENN Science and Technology Development Co Ltd
Priority date: 2017-12-01
Filing date: 2017-12-01
Publication date: 2021-06-01
Anticipated expiration: 2037-12-01
Also published as: CN108102920A

Abstract

本发明提供了一株黄丝藻及其培养与应用，该黄丝藻命名为ENN177(Tribonema sp.)，已于2017年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.14717。该黄丝藻可以应用于二氧化碳减排、废水处理、生产生物燃料、食品、营养保健品、医药制品、化妆品、化学制品、饲料及饵料领域。

Description

一株黄丝藻及其培养与应用

技术领域

本发明涉及一株黄丝藻及其培养与应用，具体地，本发明涉及一株黄丝藻ENN177(Tribonema sp.)及其在二氧化碳减排、废水处理、生产生物燃料、食品、营养保健品、医药制品、化妆品、化学制品、饲料及饵料领域方面的应用。

背景技术

在社会经济迅猛发展的同时，温室效应和能源危机也接踵而至，正威胁着全球安全。二氧化碳捕集与利用已从环境问题上升为国际政治问题，成为多国政府关注重点。各国纷纷制定了减排目标，颁布了新能源特别是生物燃料的支持政策。生物燃料先后经历了三个发展阶段：第一代生物燃料源于玉米、大豆、甘蔗、甜菜、植物油和动物脂肪等，在美国、巴西以及欧洲已达商业水平，但由于其“与人争粮”、“与粮争地”，其规模化应用受到限制；第二代生物燃料来源于秸秆、麻疯树籽和棕榈树等农、林业产品及废弃物，但由于原料收集困难、转化效率低，其应用实践也受到制约。第三代生物燃料以微藻为代表，它是一类光合效率高、产油能力强的单细胞低等微生物。目前，地球上存活的微藻已超过20万种，藻类(包括大型海藻和微藻)每年可固定二氧化碳约0.95×10¹¹吨，占全球净光合作用产量的47.5％；其产量远高于大豆、麻风树籽，最高含油量可达50％以上，并且藻类生长还可与沙荒地等非农耕地治理、废水中氮磷等元素回收利用(即废水治理)相结合，被公认为是最具发展潜力的生物能源原料。

黄丝藻是微藻中的一个种类，属于黄藻门、黄藻纲、黄丝藻目、黄丝藻属，藻体呈不分枝丝状群体。据现有报道，本属有28种，我国仅有17种2变种，与其相关的研究记载很少，并且一般认为黄丝藻油脂积累速度慢、生长速度慢、油脂中具有特殊功能的组分少，故至今未见关于黄丝藻规模化养殖及产业化应用方面的报道。因此，开发具有油脂积累速度快、生长速率快、油脂中富含特殊功能组分等优良特性的黄丝藻藻株对推进其规模化应用实践具有重要意义。

发明内容

为了克服上述问题，本发明公开了一株油脂积累速度快、生长速率快、油脂中富含特殊功能组分的黄丝藻。

本发明提供了一株黄丝藻，命名为ENN177(Tribonema sp.)，已于2017年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.14717。

本发明还提供了上述黄丝藻在二氧化碳减排和废水处理中的应用。

本发明还提供了上述黄丝藻在生产生物燃料中的应用。

本发明还提供了上述黄丝藻在食品、营养保健品、医药制品、化妆品、化学制品、饲料和饵料领域中的应用。

本发明还提供了上述黄丝藻在规模化养殖中的应用。

本发明还提供了上述黄丝藻在上述黄丝藻在能源(油脂)、营养保健及医药制品(EPA、棕榈油酸、多糖)、化妆品(多糖)、饲料(藻粉、藻渣)、饵料(藻活细胞)的联产中的应用。

在上述应用中，所述黄丝藻的藻株的棕榈油酸占藻株的总脂肪酸含量的60％以上，二十碳五烯酸占所述藻株的总脂肪酸含量的3.4％以上。

在上述应用中，所述黄丝藻的藻株的脂肪酸含量的日增长量为5-8.07％。

在上述应用中，所述黄丝藻的增长速率为0.70g/L/d-1.32g/L/d。

在上述应用中，所述黄丝藻的单位面积产量为18.7g/m²/d-94.07g/m²/d。

与现有技术相比，本发明的优势在于：

1、不饱和脂肪酸含量高，室内养殖过程中细胞脂肪酸中棕榈油酸(C16:1)含量可达总脂肪酸含量的50％以上，EPA(C20:5)含量可达总脂肪酸含量的2.7％以上；户外养殖过程中细胞脂肪酸中棕榈油酸(C16:1)含量可达总脂肪酸含量的60％以上，EPA(C20:5)含量可达总脂肪酸含量的3.4％以上。

2、油脂积累速度快：室内油脂生产过程中，细胞中脂肪酸含量每天的增长量达到细胞干重的6.22-8.07％，室外油脂生产过程中，细胞中脂肪酸含量每天的增长量达到细胞干重的5-7％。

3、生长速度快：1)室内增长速率为0.70-1.32g/L/d；2)户外跑道池单位面积产量可达18.7-31.4g/m²/d；3)户外附着式培养为40.41-94.07g/m²/d。

4、该藻株具有异养能力：利用有机碳源对该藻株进行异养养殖，最终生物量比初始增加了近2倍，表明该藻株具有异养能力，可用异养方式对其进行培养。

6、可用于二氧化碳减排和废水治理、生产生物能源、生产生物燃料、食品、营养保健品、医药制品、化妆品、化学制品、饲料及饵料领域，并且可实现能源(油脂)、营养保健及医药制品(EPA、棕榈油酸、多糖)、化妆品(多糖)、饲料(藻粉、藻渣)、饵料(藻活细胞)的联产。

附图说明

图1是ENN177(Tribonema sp.)的18S序列进化树。

图2是ENN177(Tribonema sp.)藻株的显微镜观察图。

图3是ENN177(Tribonema sp.)藻株的室内培养的生长曲线。

图4是ENN177(Tribonema sp.)藻株的室内诱导的脂肪酸积累曲线。

图5是ENN177(Tribonema sp.)藻株的户外养殖平均产量柱形图。

图6是ENN177(Tribonema sp.)藻株的户外附着式养殖平均产量柱形图。

图7是ENN177(Tribonema sp.)藻株的室内污水养殖的生长曲线(

表示污水；

表示BG11培养基)。

图8是废水中总氮消耗曲线。

图9是废水中总磷消耗曲线。

图10是鸡蛋中的EPA含量对比柱形图。

具体实施方式

下面的实施例可以使本领域技术人员更全面地理解本发明，但不以任何方式限制本发明。

本发明提供了一株黄丝藻，命名为ENN177(Tribonema sp.)，已于2017年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.14717。该黄丝藻油脂积累速度快，生长速率快，油脂中富含特殊功能组分，适用于规模化养殖，并且可应用于二氧化碳减排和废水治理，以及生产生物能源、营养品、保健品、医药制品、食品、化妆品、化学制品、饲料及饵料领域。

实施例1黄丝藻ENN177的筛选及分子鉴定

一、黄丝藻ENN177(Tribonema sp.)的筛选

秋季在内蒙古东北地区取土壤样，在实验室中，向水样中加入稀释1/10的BG11培养基，于自然光及室温下富集培养2-3天，用无菌去离子水对样品进行稀释，取单藻丝在24孔板中进行纯化培养，培养基为BG11培养基，培养温度25℃，光照采用自然光。取孔板中纯化后的藻丝移至三角瓶中进行扩大培养，最终获得ENN177纯藻株。

表1BG11培养基组成

物质名称	每升去离子水中添加量
		NaNO<sub>3</sub>(硝酸钠)	1.5g
K<sub>2</sub>HPO<sub>4</sub>·3H<sub>2</sub>O(磷酸氢二钾)	0.04g
		MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O(七水硫酸镁)	0.075g
CaCl<sub>2</sub>·2H<sub>2</sub>O(二水氯化钙)	0.036g
		柠檬酸	0.006g
FeCl<sub>3</sub>·6H<sub>2</sub>O(六水三氯化铁)	0.00315g
		Na<sub>2</sub>EDTA·2H<sub>2</sub>O(二水乙二胺四乙酸二钠)	0.00436g
Na<sub>2</sub>CO<sub>3</sub>(碳酸钠)	0.02g
		A<sub>5</sub>微量元素	1mL

表2A5微量元素的组成

物质名称	每升去离子水中添加量
		H<sub>3</sub>BO<sub>3</sub>(硼酸)	2.86g
MnCl<sub>2</sub>·H<sub>2</sub>O(一水氯化锰)	1.81g
		ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O(七水硫酸锌)	0.222g
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O(五水硫酸铜)	0.079g
		NaMoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O(钼酸钠)	0.390g
Co(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O(硝酸钴)	0.0494g

二、黄丝藻ENN177(Tribonema sp.)的分子鉴定

1)提取藻类DNA并扩增其18S核苷酸序列

用植物DNA提取试剂盒提取连续培养4天的藻类DNA；

18S核苷酸序列扩增采用真核生物18S扩增通用引物(引物由上海生工生物工程公司合成)：

引物：GTAGTCATATGCTTGTCTC

引物：GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC

取1μL总DNA为模板，采用以下条件进行PCR扩增：94℃预变性5min，然后94℃变性40s，56℃退火40s，72℃延伸2min，30个循环，最后72℃延伸10min，之后用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，PCR扩增产物的长度为1457bp，获得的序列如下所示：

GTAGTCATATGCTTGTCTCAAAGATTAAGCCATGCATGTCTAAGTATAAGCGACTCATACTGTGAAACTGCGAATGGCTCATTATATCAGTAATAGTTTATTTGATGGTCTCTTACTACCTGGATACCCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACATGCACTACGGTCCCAACTGCTTTAGCGGGCGGGATGCCTTTATTAGATCGAAACCAATGCGGCTCCTCGGAGCCGGTGTTGTGGTGATTCATGATAACCTAGCGAATCGCATGCCTTTTGGCGGCGATATTTCATTCAAGTTTCTGCCCTATCAGCTTCGGATGGTAGGGTATTGGCCTACCATGGCTTTAACGGGTAACGGGGAATTGGGGTTCGATTCCGGAGAGGGAGCCTGAGAGACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATCCTGACTCAGGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCCGGGCTCTTCGAGTCTGGCAATTGGAATGAGAACAATTTAAATCCCTTATCGAGGATCAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAGTTGGATTTCTGGGGTGTCGGATGGGCCCTGGCCTAACGGCTCAGGCTGCCCGACTCCTGTCGCCCCATCCGCGGGTGGATCCCCCTTGGCATTAGGTTGTTGGGGGGGTTAAGCCCGCCGTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCTTAGGCCGTGGATACATTAGCATGGAATAATGAGATAGGGCCTTGATGGAATGATTTTCACGAGTCTATTTTGTTGGTTTGCACGCCAAGGCAATGATTGACAGGGATAGTTGGGGGTATTCGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATGGAAGACGAACTACTGCGAAAGCATTTACCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGATGATTAGATACCATCGTAGTCTTAACCATAAGCTATGCCGACTAGGGATTGGCGGTCGCCTCTGTATGGCTCCGTCAGCACCTTTCGAGAAATCAAAGTCTTTGGGTTCCGGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCCCCGCCTGCTAAATAGCTCCCCGCACGCATTAGCGTGACGGGCGGCGCTTCTTAGAGGGACTTTCAGTGATTAACTGAAGGAAGTTGGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGC。

2)对所扩增的18S核苷酸序列进行同源性搜索

将获得的ENN177的18S序列在NCBI(National Center for BiotechnologyInformation)数据库进行BLAST比对，结果显示与登录号为AM490826.1的Tribonemautriculosum和登录号为AF083397.1的Tribonema intermixtum 18S小亚基rRNA的基因序列最为相似，匹配度为99％，覆盖率为99％和100％，搜索结果如下表3所示：

表3同源性搜索结果

3)根据上述序列作出进化树

利用NCBI数据库中的BLAST工具对藻株ENN177的18S部分序列进行相似性分析。选取部分同源序列和该藻株的18S部分序列。然后，运用Mega6.0软件，采用邻位相连算法，自展数据集bootstraps值为1000构建系统发育进化树，该进化树如图1所示。

参照图1，根据图1的结果可知，获得的ENN177为黄丝藻属(Tribonema)。

4)用显微镜观察ENN177的形态特征

观察结果如图2所示，参照图2，发现ENN177藻体为不分枝丝状体，细胞呈圆柱形、桶形或两侧略膨大的腰鼓形(细胞横壁处略有收缢)，多数宽5-10μm长1.5-5倍；细胞壁由“H”形两节片套合组成，细胞内含1-4个(多数两个)周生、环带状的或盘状或片状色素体，单核，细胞颜色为黄绿色或绿色。

5)保藏信息

将所得菌株命名为ENN177(Tribonema sp.)，已于2017年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.14717。

实施例2ENN177藻株的室内培养

在内直径为5cm、高为60cm的柱式反应器中，用无菌BG11培养基进行培养，培养温度为25℃，初始接种浓度约为1g/L，通入过滤后的空气与二氧化碳的混合气，其中二氧化碳的含量为混合气体总量的1-2％。初始光照强度为120umol/m²/s，后期根据生物量的增长，光照强度增加至200umol/m²/s。每天取样测定生物量和细胞中脂肪酸含量，共计培养4天。

生物量测定方法：准确量取50mL藻液，用烘干后已知初始重量的玻璃纤维膜(孔径为0.45um)抽滤，用150mL去离子水分三次冲洗以去除灰分，再将附着有藻细胞的玻璃纤维膜置于105℃烘箱中干燥至恒重后称量，该称量值减去初始纤维膜重即为藻细胞干重，测定结果如下图3所示。

参照图3，经过4天室内培养，细胞浓度由1.17g/L上升至5.29g/L，日增长速率为0.70-1.32g/L/d，平均增长速率为1.03g/L/d。

实施例3ENN177藻株的油脂生产

将指数生长末期的ENN177藻种接入内直径为5cm、高为60cm的柱式反应器中，藻细胞初始接种量约为1.5g/L，所用培养基为缺氮磷的BG11培养基，培养温度为25℃，初始光照强度为150umol/m²/s，后续光照强度逐渐加至200umol/m²/s，其它参数与实施例2相同。每天取样测定细胞中脂肪酸含量、每两天测定一次生物量，共计培养3天，测定结果如图4所示。

脂肪酸的组分及含量测定方法：称取25mg经冷冻干燥的样品，加入2mL 2％H₂SO₄无水甲醇-甲苯溶液。充氮气后，于80℃加热2小时。之后分别加入1mL的纯水和正己烷，充分混合后离心分离，取上层有机相进行气相色谱测定，测定结果如下表4所示：

表4脂肪酸的组分及含量

由图4可知，ENN177藻株的脂肪酸含量经过3天就能够从15.25％增长至37.26％，平均日增长量为7.34％(脂肪酸占细胞干重，每日增长量为6.22-8.07％)，说明此株藻具有快速积累油脂的能力，可用于微藻油类产品的生产。此外，该藻株积累油脂迅速，可以避免因诱导养殖(此过程中细胞积累油脂)时间过长(如10几天)导致的虫害污染，甚至可以避免细胞损伤、死亡，以及产量的损失。

进一步由表3的结果可知，脂肪酸组成以C16为主；C16-C18脂肪酸含量可达总脂肪酸的76.80％，C16-C18脂肪酸是生产生物柴油的主要来源，因此表明该藻株适于生物燃料特别是生物柴油的生产；不饱和脂肪酸含量达总脂肪酸含量的61.78％，其中，C16:1(棕榈油酸)含量达总脂肪酸含量的51.41％，C20:5(EPA)含量达总脂肪酸含量的2.76％，表明该藻可以作为生产有益于心脑血管健康的食品、保健品、医药制品、功能饲料及饵料的原料。

实施例4ENN177藻株的户外养殖

在户外1m²跑道池内进行ENN177藻株的户外养殖实验，培养基为用工业用盐配制的BG11培养基，藻液深度为10-25cm，藻细胞浓度维持在0.1-0.8g/L，利用曝气石向池中持续通入煤气化后产生的含有二氧化碳的废气，并将pH维持在7左右，日光照(光照强度在0umol/m²/s-1000umol/m²/s之间)，藻液温度为10-35℃。根据藻液浓度的变化不断的从池中采收藻细胞并补加培养基组分，即采用半连续养殖方式，持续养殖31天，每天取样测定生物量，测定结果如下图5所示。

参照图5可知，在ENN177藻株的户外养殖中，单位面积产量为18.7-31.4g/m²/d，31天平均产量为27.48g/m²/d，表明藻株具有较好的高产能力。

户外养殖31天后又进行诱导养殖3天，该过程中脂肪酸含量平均日增长量为细胞干重的5.96％(细胞中脂肪酸含量每天的增长量达到细胞干重的5-7％)，该藻株积累油脂迅速，可以避免因诱导养殖(此过程中细胞积累油脂)时间过长(如10几天)导致的虫害污染，甚至细胞损伤、死亡，损失产量。最终采收所得藻细胞的脂肪酸中C16:1(棕榈油酸)含量达总脂肪酸含量的60.17％，C20:5(EPA)含量达总脂肪酸含量的3.47％，表明该藻可以作为生产有益于心脑血管健康的食品、保健品、医药制品、功能饲料及饵料的原料。

此外，每天取样镜检观察微藻状态和是否出现污染，并且在实验期间出现了病虫害污染，但是在污染期间的产量与未污染期间的产量相比，没有明显差别，表明藻株具有较好的抗污染能力。

同时，在ENN177藻株的户外养殖中，持续使用煤气化后产生的含有二氧化碳的废气作为藻株生长过程中碳源的供给，但是藻株的产量没有受到影响，表明该藻株具有二氧化碳废气减排的能力。

实施例5ENN177藻株的户外附着式养殖

在户外10m²附着式培养装置上进行ENN177藻株的户外养殖实验，培养基为用工业用盐配制的BG11培养基，环境温度为16-35℃，利用曝气石向培养基中持续通入煤气化后产生的含有二氧化碳的废气，pH维持在7左右，日光照(光照强度在0umol/m²/s-1000umol/m²/s之间)。根据光照及天气情况，每7天或每天(前21天每7天完成一次，后10天每天完成一次)完成一批次接种采收。持续养殖31天，每批次取样测定生物量，每7天或每天取样测定生物量，测定结果如下图6所示。

参照图6可知，在ENN177藻株的户外附着式养殖中，单位面积产量最高为94.07g/m2/d，最低为40.41g/m²/d，31天平均产量49.64g/m2/d，表明藻株具有较好的高产能力。

此外，在ENN177藻株的户外附着式养殖中，持续使用煤气化后产生的含有二氧化碳的废气，但是藻株的产量没有受到影响，表明藻株具有二氧化碳废气减排的能力。

实施例6ENN177藻株的室内污水养殖

将ENN177藻种过滤后分别转入两个内直径为5cm、高为60cm的柱式反应器中，再分别注入约850mL无菌BG11培养基和约850mL灭菌后的内蒙古达拉特旗市政污水出水(事先过滤去除固体杂质)，培养温度为25-27℃，初始接种量约为0.5g/L，以0.1L/min的速度通入过滤后的空气与二氧化碳的混合气，其中二氧化碳的含量约5％；光照强度为150-200umol/m²/s，每天取样测定生物量，共计培养4天，生长情况如下图7所示。

参照图7，从图7中可以看出ENN177藻株在污水中的生长速度为1.33-1.53g/L/d，大于等于其在BG11培养基中的生长速率1.31-1.37g/L/d，4天内在污水中积累的总生物量也大于其在BG11培养基中积累的生物量，表明该藻株可利用污水养殖。

实施例7ENN177藻株的户外污水养殖

在户外2m²小跑道池中进行ENN177藻株的户外污水养殖实验，培养基为廊坊市龙河市政污水(事先过滤)，环境温度为20-33℃，利用曝气石向培养基中持续通入煤气化后产生的含有二氧化碳的废气，pH维持在7左右，采用半连续养殖，细胞浓度维持在0.5-1.5g/L，每5天更换一次污水。连续养殖10天，每批次取样测定生物量及污水中总氮、总磷。

总氮测定采用《碱性过硫酸钾消解分光光度法》，具体步骤参考GB11894-89，测定结果如下图8所示；

总磷测定采用《钼酸铵分光光度法》，具体步骤参考F-HZ-HJ-SZ-0039，测定结果如下图9所示。

参照图8和图9，从图8和图9中可以看出污水中总氮消耗量为10426.5mg/m²，折算为平均消耗速度为1043mg/m²/d，污水中总磷消耗量为2250.3mg/m²，折算为平均消耗速度为速率225mg/m²/d。表明该藻株具有利用废水中氮、磷的能力，可以用于废水治理领域.

实施例8ENN177藻株的异养培养

在无菌超净台内，将ENN177藻种过滤后，转入200mL摇瓶内，摇瓶内事先装入含10g/L蔗糖溶液的GB11培养基，细胞接种浓度约1g/L，于控温摇床内震荡培养6天，转速150rad/min，温度25℃，无光照，第6天取样测定生物量。

生物量测定方法：同实施例2。

实验中的有机碳源除蔗糖外还可以是葡萄糖、果糖、玉米浆、甘油、糖蜜、醋酸等。

实验终止时，测定瓶内生物量浓度为约2.69g/L，比初始增加了将近2倍，表明该藻株具有异养能力，可用异养方式对其进行培养。

实施例9ENN177藻细胞的主要组分含量

将养殖收获的ENN177藻细胞冷冻干燥，测定其中的主要组分情况如下：

总脂测定方法：GB/T 5009.6-2003；

总糖测定方法：GB/T 9695.31-2008，其中试样前处理步骤改为三氟乙酸水解法，即“称取试样约0.1g(精确至0.001g)于15mL螺口小瓶中，加入5mL三氟乙酸溶液后密闭，于烘箱中110℃加热水解2h，冷却后用水定容到容量瓶中，过滤，滤液适当稀释备用。

蛋白测定方法：JY/T 017-1996。

表5ENN177藻细胞的主要组分含量

蛋白	总糖	总脂	其他
				16.6％	44.3％	33.7％	5.4％

从上表5可以看出，ENN177藻细胞中主要含有油脂、糖类和蛋白。表明该藻株可以用于能源生产及饲料、饵料、食品、营养品、保健品、医药制品及化学制品开发。

实施例10ENN177藻株的水溶性组分提取和性能检测

将ENN177藻粉经索氏提取(溶剂为氯仿：甲醇＝2:1(体积比)；温度70℃；提取时间为40～48h)后的固体物质，经80℃水提取2h后，过滤，并收集过滤所得溶液。对滤出固体物质再用80℃水重复提取1次，过滤得到藻渣。之后，将两次过滤所得溶液合并后减压浓缩至约50mL。加入95％乙醇，使乙醇浓度达到约80％，冷藏、静置24小时后，过滤收得沉淀。对该水溶性主要组分和性能检测方法如下：

总糖测定方法：同实施例10；

蛋白测定方法：JY/T 017-1996；

水分测定方法：GB/T-5009.3-2010；

灰分测定方法：GB 5009.4-2010。

表6水溶性物质主要组分

由上表6可见，水溶性物质主要组分中的总糖含量高达69.5％，蛋白含量仅6.20％，证明实验所得固态终产物的主要成分是糖(即藻多糖)。表明该藻株具有应用于化妆品、营养品、保健品及医药领域的能力。

实施例11ENN177藻株经索氏提取、水提取后的藻渣组分的检测

参照实施例10，ENN177藻粉经索氏提取、水提取后，得到藻渣，对所得藻渣组分进行检测的方法如下：

总糖测定方法：同实施例10；

蛋白测定方法：JY/T 017-1996；

水分测定方法：GB/T-5009.3-2010；

灰分测定方法：GB 5009.4-2010；

总脂测定方法：GB/T 5009.6-2003。

表7ENN177藻渣的主要组分

总糖(％)	蛋白(％)	总脂(％)	灰分(％)	水分及其他(％)
					42.9	29.1	12.4	0.95	14.65

由表7可知，ENN177藻渣中的主要成分为糖类、蛋白和脂类，表明该藻株的藻渣可以用于饲料领域。

由实施例10、11可见，通过对ENN177藻粉中的油脂、水溶性物质的分级提取以及藻渣的组分进行检测，发现ENN177藻株可实现能源(油脂)、营养保健及医药制品(EPA、棕榈油酸、多糖)、化妆品(多糖)、饲料(藻粉、藻渣)、饵料(藻活细胞)的联产。

注：EPA(二十碳五烯酸)是人体常用的一种Ω-3脂肪酸(多不饱和脂肪酸)，是人体必须脂肪酸之一，但人体自身不能直接合成，最有效的补充方式是从食物中获取；并且目前已经证实增加EPA的吸收对治疗冠状动脉心脏病、高血压和炎症(例如风湿性关节炎)均有效。

实施例12ENN177藻株的饲喂实验

将ENN177藻粉粉碎后与常规饲料的原料混合制粒，制成ENN177的质量含量为7％的实验饲料。将实验鸡分成两组，每组100只，分别用实验饲料和常规饲料饲喂60天，实验鸡日龄、生长环境完全相同。实验过程中观察鸡的生长状况，取第58-60天所产鸡蛋进行检测，检测结果如下图10所示。

从图10可以看出，食用实验饲料的实验鸡与食用常规饲料的实验鸡相比，死亡率降低约2％(实验饲料组1％，常规饲料组3％)，精神状态更好，羽毛更有光泽；此外，检测鸡蛋中EPA含量可发现，常规组鸡蛋中没有EPA，实验组鸡蛋中EPA含量达全蛋的0.04％(与常规鸡蛋相比EPA，实现了从无到有)，表明该藻株具有应用于饲料、饲料添加剂、饵料领域，开发高价值畜禽、水产产品的能力。

综上可知，本发明提供的黄丝藻具有以下优点：

1、油脂积累速度快，能较快的积累油脂，适于微藻油脂及微藻油脂相关产品的规模化生产。

2、生长速度快，能较快的积累生物量，适于微藻生物质及微藻生物质相关产品的规模化生产。

3、富含棕榈油酸(C16:1)及EPA(C20:5)等不饱和脂肪酸，能较多较好的生产富含不饱和脂肪酸的藻类及藻类产物，适于含不饱和脂肪酸的营养品、保健品、医药制品、食品、化妆品、化学制品、饲料及饵料的规模化生产。

4、能够在户外进行长时间持续养殖，不需要更换藻种，也没有因污染而导致产量降低，适于规模化养殖。

5、具有异养能力：利用有机碳源对该藻株进行异养养殖，最终生物量比初始增加了近2倍，表明该藻株具有异养能力。

6、可用于二氧化碳减排和废水治理、生产生物能源，并且可实现能源(油脂)、营养保健及医药制品(EPA、棕榈油酸、多糖)、化妆品(多糖)、饲料(藻粉、藻渣)、饵料(藻活细胞)的联产。

本领域技术人员应理解，以上实施例仅是示例性实施例，在不背离本发明的精神和范围的情况下，可以进行多种变化、替换以及改变。

序列表

<110> 新奥科技发展有限公司

<120> 一株黄丝藻及其培养与应用

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 19

<212> DNA

<213> 未知

<400> 1

gtagtcatat gcttgtctc 19

<210> 2

<211> 24

<212> DNA

<213> 未知

<400> 2

gcatcacaga cctgttattg cctc 24

<210> 3

<211> 1457

<212> DNA

<213> 未知

<400> 3

gtagtcatat gcttgtctca aagattaagc catgcatgtc taagtataag cgactcatac 60

tgtgaaactg cgaatggctc attatatcag taatagttta tttgatggtc tcttactacc 120

tggatacccg tagtaattct agagctaata catgcactac ggtcccaact gctttagcgg 180

gcgggatgcc tttattagat cgaaaccaat gcggctcctc ggagccggtg ttgtggtgat 240

tcatgataac ctagcgaatc gcatgccttt tggcggcgat atttcattca agtttctgcc 300

ctatcagctt cggatggtag ggtattggcc taccatggct ttaacgggta acggggaatt 360

ggggttcgat tccggagagg gagcctgaga gacggctacc acatccaagg aaggcagcag 420

gcgcgtaaat tacccaatcc tgactcaggg aggtagtgac aataaataac aatgccgggc 480

tcttcgagtc tggcaattgg aatgagaaca atttaaatcc cttatcgagg atcaattgga 540

gggcaagtct ggtgccagca gccgcggtaa ttccagctcc aatagcgtat attaaagttg 600

ttgcagttaa aaagctcgta gttggatttc tggggtgtcg gatgggccct ggcctaacgg 660

ctcaggctgc ccgactcctg tcgccccatc cgcgggtgga tcccccttgg cattaggttg 720

ttgggggggt taagcccgcc gtttactgtg aaaaaattag agtgttcaaa gcaggcttag 780

gccgtggata cattagcatg gaataatgag atagggcctt gatggaatga ttttcacgag 840

tctattttgt tggtttgcac gccaaggcaa tgattgacag ggatagttgg gggtattcgt 900

attcaattgt cagaggtgaa attcttggat ttatggaaga cgaactactg cgaaagcatt 960

taccaaggat gttttcatta atcaagaacg aaagttaggg gatcgaagat gattagatac 1020

catcgtagtc ttaaccataa gctatgccga ctagggattg gcggtcgcct ctgtatggct 1080

ccgtcagcac ctttcgagaa atcaaagtct ttgggttccg gggggagtat ggtcgcaagg 1140

ctgaaactta aagaaattga cggaagggca ccaccaggag tggagcctgc ggcttaattt 1200

gactcaacac ggggaaactt accaggtcca gacatagtga ggattgacag attgagagct 1260

ctttcttgat tctatgggtg gtggtgcatg gccgttctta gttggtggag tgatttgtct 1320

ggttaattcc gttaacgaac gagacccccg cctgctaaat agctccccgc acgcattagc 1380

gtgacgggcg gcgcttctta gagggacttt cagtgattaa ctgaaggaag ttggaggcaa 1440

taacaggtct gtgatgc 1457

Claims

1.一株黄丝藻，其特征在于，命名为黄丝藻(Tribonema sp.)ENN177，已于2017年09月27日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏编号为CGMCCNo.14717。

2.根据权利要求1所述的黄丝藻在二氧化碳减排和废水处理中的应用。

3.根据权利要求1所述的黄丝藻在生产生物燃料中的应用。

4.根据权利要求1所述的黄丝藻在食品、营养保健品、医药制品、化妆品、化学制品、饲料和饵料领域中的应用。

5.根据权利要求1所述的黄丝藻在规模化养殖中的应用。

6.根据权利要求1所述的黄丝藻在能源、营养保健及医药制品、化妆品、饲料、饵料的联产中的应用。

7.根据权利要求4所述的应用，其中，所述黄丝藻的藻株的棕榈油酸占藻株的总脂肪酸含量的60％以上，二十碳五烯酸占所述藻株的总脂肪酸含量的3.4％以上。

8.根据权利要求3或4中任一项所述的应用，其中，所述黄丝藻的藻株的脂肪酸含量的日增长量为5-8.07％。

9.根据权利要求3或4中任一项所述的应用，其中，所述黄丝藻的增长速率为0.70g/L/d-1.32g/L/d。

10.根据权利要求3或4中任一项所述的应用，其中，所述黄丝藻的单位面积产量为18.7g/m²/d-94.07g/m²/d。