CN106916747B

CN106916747B - 索罗金小球藻藻株及其培养方法和用途

Info

Publication number: CN106916747B
Application number: CN201510994276.0A
Authority: CN
Inventors: 揣文华; 胡强; 韩丹翔; 王红霞; 加晶; 王垚; 王谝
Original assignee: Sdic Biotechnology Investment Co ltd; Institute of Hydrobiology of CAS
Current assignee: Sdic Biotechnology Investment Co ltd; Institute of Hydrobiology of CAS
Priority date: 2015-12-25
Filing date: 2015-12-25
Publication date: 2020-06-23
Anticipated expiration: 2035-12-25
Also published as: CN106916747A

Abstract

本发明提供索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)藻株GT‑1。本发明还提供以自养或异养的方式培养GT‑1的方法，在缺氮条件下对GT‑1进行培养的方法以及GT‑1在制备油脂、生物柴油、不饱和脂肪酸、营养保健品以及蛋白质中的用途。

Description

索罗金小球藻藻株及其培养方法和用途

技术领域

本发明涉及一株索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)及其培养方法和该小球藻在制备生物柴油、营养保健品中的应用。

技术背景

对石油能源与日俱增的需求导致其储藏量快速下降，使得寻求可替代能源成为各国迫在眉睫的首要任务。可再生的生物质能源被广泛认为是最具潜力的、可持续的、环境友好型的替代能源。用于产生能源的第一代生物质为油料作物、废食用油、动物脂肪酸等，第二代生物质为秸秆、杂草、木材等，发展至今，已聚焦在以微藻类为主的第三代生物质上。

目前使用微藻生产油料的缺点在于成本过高，可通过选育优良藻种、改进培养方式、优化生产工艺等途径来降低原料成本，而选育优良藻种从而改进微藻的产油能力是从根本上解决此问题，因此需要生物量高及油脂含量高的优良藻株。

小球藻是最早应用于商业化规模生产，同时也是目前开发较多的藻种之一，其具有易于培养，细胞内富含油脂如包含不饱和脂肪酸的油脂，及蛋白质，在生物材料、营养食品及保健品领域具有很好的应用前景。

小球藻的培养方法包括自养培养和异养培养。现有的小球藻藻种无论自养还是异养，其生物质增殖速率都较低，生长周期大约在8天甚至更长时间。并且，有报道的最大的培养物干重仅为约100g/L，当小球藻异养培养一段时间达到一定干重后，即使再延长培养时间，其生物量干重依然没有实质增加甚至会减少。因此，很难进一步增加生物质干重。究其原因，可能是由于现有的这些小球藻的异养培养至一定密度后，会产生相互抑制的代谢产物。

此外，现有小球藻耐酸性差，导致很难在酸性环境下正常生长，故使小球藻的培养方式受到限制，难以适应异养培养的环境。再者，现有的小球藻藻种在异养条件下培养后(培养结束后)，均可在培养液中检测到大量残余的糖。由此可见，现有小球藻在异养培养时糖利用率低，应用于工业生产会增加成本。而且，培养基中残余的糖也增加了染菌的几率，这是进行异养培养所不希望发生的状况。再一个问题是，目前小球藻品种经培养后总油脂含量低，开发价值有限。

因此，需要筛选可高效率地获得高生物量和含油量的优良藻株。

发明内容

本发明提供索罗金小球藻藻株GT-1，以保藏号CGMCC No.11801保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

本发明还提供一种以自养方式培养索罗金小球藻的方法，包括将本发明的藻株以置于培养基中，并在20-30℃，连续光照强度为150-200μmol m^-2s^-1，pH值5-8，以及通入CO₂的条件下培养。

在优选的实施方式中，所述培养基为BG11培养基。

在优选的实施方式中，所述培养在pH值6-7的条件下进行。

在优选的实施方式中，所述培养进行6-12天。

在优选的实施方式中，所述连续光照强度为165μmol m^-2s^-1。

本发明进一步提供一种以异养方式培养索罗金小球藻的方法，包括将本发明的藻株置于异养培养基中，并在25-35℃，pH值5-8，以及溶氧浓度20-100％的条件下进行连续补料培养。

在优选的实施方式中，所述培养基为改良的Endo培养基。

在优选的实施方式中，所述培养在pH值6-7的条件下进行。

在优选的实施方式中，所述培养在30℃进行。

在优选的实施方式中，所述溶氧浓度为40-60％，更优选40％。

在优选的实施方式中，所述培养进行6-12天。

在优选的实施方式中，其中所述藻株以OD₇₅₀＝1-16的接种量置于异养培养基中。在更优选的实施方式中，所述接种量为OD₇₅₀＝3-9。在进一步优选的实施方式中，所述接种量为OD₇₅₀＝5-7。

在优选的实施方式中，所述方法进一步包括预培养的步骤。

在优选的实施方式中，本发明的自养和异养培养方法进一步包括收集细胞并从所收集的细胞分离蛋白质或油脂的步骤。

本发明还提供一种对索罗金小球藻进行培养的方法，包括：

(i)将本发明的藻株进行增殖；

(ii)将所增殖的细胞加入到反应器中的缺氮培养基中进行培养；

以及任选地，

(iii)收集所培养的细胞。

在优选的实施方式中，步骤(i)的增殖使用本发明的培养方法进行。

在优选的实施方式中，所缺氮培养基是缺氮的BG11或缺氮的改良的Endo培养基。

在优选的实施方式中，步骤(ii)中将所述细胞以OD₇₅₀＝0.1-0.5的接种量置于缺氮培养基中，并在20-30℃，连续光照强度为50μmol m^-2s^-1，pH值5-8，以及通入CO₂的条件下进行培养，其中培养0-2天后，光照强度改为150μmol m^-2s^-1。

在优选的实施方式中，步骤(ii)中的pH值为6-7。

在优选的实施方式中，步骤(ii)中的培养进行12天。

在优选的实施方式中，步骤(ii)中的培养在25℃进行。

在优选的实施方式中，在步骤(i)和(ii)之间进一步包括收集增殖的细胞，并用缺氮培养基进行清洗的步骤。

在优选的实施方式中，本发明的方法进一步包括收集所培养的细胞的步骤，并从所收集的细胞分离油脂的步骤。

还提供本发明的藻株在制备油脂或生物柴油、制备不饱和脂肪酸或营养保健品以及制备蛋白质中的用途。

本发明还提供包含本发明的索罗金小球藻藻株的细胞和/或细胞提取物的药物组合物、食品组合物、营养补充剂或饲料添加物。

附图说明

图1为GT-1在光学显微镜下的形态特征照片。

图2为GT-1的18S rDNA核酸序列在NCBI中Blast结果。

图3为GT-1的18S rDNA的系统发育树。

图4为GT-1的ITS1和5.8S rDNA的系统发育树。

图5为GT-1的ITS2的系统发育树。

图6为GT-1的ITS核酸序列在NCBI中Blast结果。

图7为GT-1在自养培养条件下的生长曲线。

图8为GT-1在异养培养条件下的生长曲线。

图9为GT-1在异养转为自养缺氮条件下的生长曲线。

图10显示培养基中氮源对GT-1碳水化合物组成的影响。

图11显示培养基中氮源对GT-1蛋白质含量的影响。

图12显示培养基中氮源对GT-1总油脂含量的影响。

图13显示培养基中氮源对GT-1脂肪酸组成的影响。

图14是索罗金小球藻GT-1在BG11培养基中生长3日后的SEM显微照片。A：显示蛋白核、细胞核以及淀粉粒；B显示蛋白核和淀粉粒；C：显示详细的蛋白核；D：显示淀粉粒和油滴；E：显示细胞复制过程中的叶绿体、细胞核以及淀粉粒；F：显示细胞群。其中标尺为500nm。

图15是索罗金小球藻GT-1在无氮的BG11培养基中生长6日后的SEM显微照片。A：显示油滴和淀粉粒；B：显示蛋白核、油滴和淀粉粒；C：显示油滴和淀粉粒；D：显示细胞复制过程中的油滴和淀粉粒。其中标尺为500nm。

发明详述

索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)属于绿藻门(Chlorophyta)，绿藻纲(Chlorophyceae)，绿球藻目(Chlorococcales)，小球藻科(Chlorellaceae)，小球藻属(Chlorella)。

本发明从自然水体中分离出一种单细胞藻类，经形态学分析初步鉴定为小球藻属，命名为GT-1。通过18S rDNA序列分析，进一步鉴定为索罗金小球藻。此外，通过rRNA编码区间隔序列(internal transcribed sequence，ITS)分析，发明人发现所分离到的索罗金小球藻不同于已知的索罗金小球藻藻株。

因此，在第一方面，本发明提供一种索罗金小球藻藻株GT-1，以分类命名小球藻Chlorella sp.，保藏号CGMCC No.11801于2015年12月2日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)(北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)。

在第二方面，本发明还提供用于培养本发明的索罗金小球藻藻株的方法。

可以将本发明的索罗金小球藻藻株以自养的方式进行培养。

在一些实施方式中，本发明的索罗金小球藻藻株置于培养基中，并在20-30℃，连续光照强度为150-200μmol m^-2s^-1，pH值5-8，以及通入CO₂的条件下培养，其中OD₇₅₀是750nm的吸光度。优选地，所述培养在pH值6-7的条件下进行。优选地，所述培养在25℃进行。在一些实施方式中，所述培养进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更长时间。优选地，所述培养进行6-12天。优选地，所述连续光照强度为165μmol m^-2s^-1。在一些实施方式中，培养过程中通入含有1-2％CO₂的空气。在一些实施方式中，所述培养使用BG11培养基。在一些实施方式中，所述培养在柱状反应器中进行。

在一些实施方式中，培养结束后收集细胞。在一些实施方式中，从所收集的细胞分离油脂。在一些实施方式中，从所收集的细胞分离蛋白质。

还可以将本发明的索罗金小球藻藻株以异养的方式进行培养。

在一些实施方式中，本发明的索罗金小球藻藻株置于异养培养基中，并在25-35℃，pH值5-8，以及溶氧浓度20-100％的条件下进行连续补料培养。优选地，所述培养使用改良的Endo培养基。优选地，所述培养在pH值6-7的条件下进行。优选地，所述培养在30℃进行。优选地，所述溶氧浓度为40-60％，更优选40％。在一些实施方式中，所述培养进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12天或更长时间。优选地，所述培养进行6-12天。在优选的实施方式中，所述藻株以OD₇₅₀＝1-16，优选OD₇₅₀＝2-12，更优选OD₇₅₀＝3-9，进一步优选OD₇₅₀＝5-7的接种量置于异养培养基中。在优选的实施方式中，所述方法进一步包括预培养的步骤。

在本发明中，“溶氧浓度”是指培养基中所溶解的氧的量相对于培养条件下培养基中氧的饱和溶解度的百分比。溶氧浓度控制方法是溶氧转速、氧气偶联。具体而言，溶氧转速、氧气偶联的控制方法是：当培养物中的溶氧值低于设定值时通过自动增加搅拌转速，来提高通入气体中氧气在培养物中的溶解，当转速增加至设定最大值而溶氧浓度仍低于设定值时，再通过增加通气(空气和氧气的混合气体)中氧气的比例，来增加溶氧；当培养物中的溶氧浓度高于设定值时通过自动降低通气中氧气的比例，来降低溶氧；当氧气比例降至0，通100％空气时，溶氧浓度仍高于设定值时，再通过自动降低搅拌转速方式进一步降低溶氧浓度，直至降至设定值。

在本发明中，连续补料培养是指在培养的过程中监测培养基中还原糖的含量，当还原糖降至5g/L时，通过补加基础培养基的浓缩液，例如补加25×的基础培养基的浓缩液，以维持藻细胞不断生长。

在一些实施方式中，培养过程中保持搅拌桨以200-600rpm的速度搅拌。

在第三方面，本发明提供对本发明的索罗金小球藻藻株进行培养的方法，包括：

(i)将本发明的藻株进行增殖；

以及任选地，

(iii)收集所培养的细胞。

本发明中，缺氮培养基是指不添加氮源的培养基。

在一些实施方式中，步骤(i)的增殖使用本发明前述的培养方法进行。

在一些实施方式中，在步骤(i)中，所述培养使用改良的Endo培养基。

在一些实施方式中，步骤(ii)中所述缺氮的培养基是缺氮的BG11培养基。在一些实施方式中，步骤(ii)中所述缺氮的培养基是缺氮的改良的Endo培养基。

在一些实施方式中，上述方法包括：

(i)将本发明的藻株以OD₇₅₀＝1-16的接种量置于改良的Endo培养基中，并在25-35℃，pH值5-8，以及溶氧浓度20-100％的条件下连续补料培养；

(ii)将所增殖的索罗金小球藻细胞以OD₇₅₀＝0.2-0.5的接种量加入到反应器中的缺氮的BG11培养基中，在20-30℃，连续光照强度为50μmol m^-2s^-1，pH值5-8，以及通入1-2％CO₂的条件下进行培养，其中培养0-2天后，光照强度改为150μmol m^-2s^-1；

以及任选地，

(iii)收集所培养的细胞。

在步骤(i)中，优选地，所述培养在pH值6-7的条件下进行。优选地，所述培养在30℃进行。优选地，所述溶氧浓度为40-60％，更优选40％。在一些实施方式中，所述培养进行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10天或更长时间。优选地，所述培养进行6-7天。优选地，所述接种量为OD₇₅₀＝8或16。在步骤(ii)中，优选地，pH值为6-7。优选地，所述诱导进行12天。优选地，所述诱导在25℃进行。在一些实施方式中，培养过程中通入含有1-2％CO₂的空气。

在优选的实施方式中，在步骤(i)和(ii)之间进一步包括收集增殖的细胞，并用缺氮培养基进行清洗的步骤。在一些实施方式中，步骤(ii)的培养结束后收集细胞。在一些实施方式中，从所收集的细胞分离油脂。

与本领域已知的小球藻相比，本发明的藻株具有很多优点。

首先，无论以自养还是异养方式培养，本发明所分离的索罗金小球藻藻株与已知的索罗金小球藻藻株相比，生长迅速，并且能达到更高的生物量(如表1和2所示)。此外，本发明的索罗金小球藻藻株在异养条件下培养的糖利用率高，培养结束后无残糖，而已知的小球藻在培养结束后通常有大量残醣(如表2所示)。

表1、自养培养小球藻的生长速率与细胞密度比较：

表2、异养培养生长速率、细胞密度与残糖对比：

藻株名称	细胞密度(g/L)	平均生长速率(g/L·h)	培养结束后残糖(g/L)
				原始小球藻(FACHB-2)	54.6	0.37	9.36
普通小球藻(FACHB-8)	41.2	0.35	11.52
				蛋白核小球藻(FACHB-9)	66.4	0.46	8.19
椭圆小球藻(FACHB-40)	60	0.36	2.61
				索罗金小球藻(GT-1)	125.8	0.87	0

其次，本发明的索罗金小球藻藻株能在pH 5的条件下生长。现有的对小球藻生长条件的研究中所采用的pH通常为6.0以上(如表3所示)，可见本发明的索罗金小球藻GT-1具有更好的耐酸特性。

表3、小球藻培养的pH值：

此外，在优化的培养条件下，如对温度、pH、光照强度、培养基中的氮源或者微量元素等条件的优化，已知的小球藻细胞的油脂含量达到细胞干重的30％左右。而本发明的索罗金小球藻GT-1在异养培养条件下，藻细胞总油脂含量达到25.3％，而经过异养培养+自养缺氮培养后，藻细胞总油脂含量达到51.9％。如表4所示。

表4、小球藻中的油脂含量：

种名及编号	油脂含量(％干重)	文献出处
			Chlorella sp.	28～32	Firoz Alam et al.,2015
Chlorella protothecoides SAG 211-7b	24.8～37.5	Izabela Krzeminska et al.,2015
			Chlorella sorokiniana	20～27	Juntila D J et al.,2015
Chlorella sp.	39.3	崔静和刘建国，2012
			Chlorella sorokiniana	13	Zheng et al.,2012
Chlorella minutissima UTEX 2219	4～4.8	Tang et al.,2012
			Chlorella zofingiensis ATCC30412	15	Liu et al.,2011
Chlorella pyrenoidosa SJTU	24	Tang et al.,2011
			Chlorella sp.MP-1	28.82	Mayur M P et al.,2011
Chlorella sp.XQ-200419	17.9-41.0	张桂艳等，2011
			Chlorella vulgaris UTEX 259	38	Liang et al.,2009
GT-1	25.3～51.9	本发明

综上所述，本发明的索罗金小球藻藻株生长迅速，最高生物量可达接近130g/L，并且适应性强，糖利用率高。因此，将本发明的索罗金小球藻藻株用于工业生产可以降低能耗和成本，并且有利于防止污染。同时，本发明的索罗金小球藻藻株含油量高，适合于生产油脂。

发明人还发现，经过缺氮诱导后，在总油脂中，C16:3和C18:3的含量显著升高，并且C18:2也是总油脂的主要成分，C16和C18占总油脂的80％以上。本领域已知，C18:2，即十八碳二烯酸(即，亚油酸)和C18:3，即十八碳三烯酸(即，亚麻酸)具有多种生理功能：亚油酸能影响血压，具有降血压的作用；γ-亚麻酸在临床上的试验结果表明有降血脂作用，可防止血栓形成，还具有防治糖尿病的作用及抗癌活性。亚麻酸主要用于医药、保健食品和功能性饮料领域(黄宝玺等，2009)。另外，γ-亚麻酸具有营养保护作用，可应用于一些洗涤化妆品领域(王萍等,2008)。此外，十六碳脂肪酸和十八碳脂肪酸是合成其它不饱和脂肪酸的前体(孙翔宇等，2012)。

因此，在第四方面，还提供本发明的索罗金小球藻藻株在制备油脂或生物柴油中的用途，本发明的索罗金小球藻藻株在制备不饱和脂肪酸或营养保健品中的用途，以及本发明的索罗金小球藻藻株在制备化合物，如蛋白质，中的用途。本发明还提供包含本发明的索罗金小球藻藻株的细胞和/或细胞提取物的药物组合物、食品组合物、营养补充剂或饲料添加物。

本发明中使用了如下的培养基和溶液：

BG11，含有硝酸钠1.5g/L、磷酸二氢钾0.04g/L、七水硫酸镁0.075g/L、二水氯化钙0.036g/L、柠檬酸0.006g/L、柠檬酸铁铵0.006g/L、EDTA二钠0.001g/L、碳酸钠0.02g/L和微量金属元素混合溶液1mL/L，pH 7；

改良的Endo培养基I，含有葡萄糖20g/L、硝酸钾2g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁5mg/L、氯化钙0.01g/L、A5溶液1mL/L、EDTA二钠3.7mg/L和琼脂15g/L，pH 6.5；

改良的Endo培养基II，含有葡萄糖30g/L、硝酸钾3g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁5mg/L、氯化钙0.01g/L、A5溶液1mL/L和EDTA二钠3.7mg/L，pH 6.5；

改良的Endo培养基III，含有葡萄糖30g/L、硝酸钾5g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁5mg/L、氯化钙0.01g/L、A5溶液1mL/L和EDTA二钠3.7mg/L，pH 6.5；

培养基BG11中的微量金属元素混合溶液，含有硼酸2.86g/L、七水硫酸锌0.22g/L、四水氯化锰1.86g/L、二水钼酸钠0.39g/L、五水硫酸铜0.08g/L和硝酸钴0.05g/L；以及

改良的Endo培养基I、II、III中的A5溶液，含有硼酸2.86g/L、七水硫酸锌0.222g/L、四水氯化锰1.81g/L、钼酸钠0.021g/L和二水硫酸铜0.07g/L。

实施例

以下的实施例是为了便于更好地阐释本发明，并非意在限定本发明的范围。如无特殊说明，下述实施例中的实验方法均为常规方法。如无特殊说明，下述实施例中所用的试验材料均为自常规生化试剂商店购买得到。实施例1.索罗金小球藻藻株GT-1的分离和形态学鉴定

收集来自河北省三河市鲍邱河的夏季水样，通过多次划平板(改良的Endo培养基I)的方式进行纯化，最终获得纯系藻株。在显微镜下观察，该藻为单细胞，细胞为圆形或椭圆形，大小在2～6微米之间，色素体周生，杯状，每个色素体具有1个蛋白核(如图1a左侧的P所示)。因此，所分离的藻株鉴定为小球藻属的藻类，命名为GT-1。

实施例2.索罗金小球藻藻株GT-1的分子生物学鉴定

取一定量的对数期生长状态良好的GT-1培养物，通过离心得到藻细胞沉淀，用于提取总DNA。总DNA提取方法按照DNeasy Plant Mini kit试剂盒所要求的步骤进行。总DNA样品设有2个平行，提取完成后，用Nano drop8000测定DNA模板的浓度分别为53.59ng/μL和50.70ng/μL。随后，扩增GT-1的18S rDNA和核糖体rRNA编码区间隔序列(internaltranscribed sequence，ITS)并进行测序和序列分析。

A.18S rDNA

采用如下真核生物18S rDNA扩增通用引物扩增完整的GT-1的18S rDNA序列：

正向引物：5′-AACCTGGTTATCCTGCCAGT-3′(SEQ ID NO:1)；和

反向引物：5′-TGATCCTTCTGCAGGTTCACCTACG-3′(SEQ ID NO: 2)。

PCR扩增的反应体系为20μL，取2μL总DNA为模板。扩增条件如下：94℃预变性10min；94℃变性1min，50℃退火1.5min，72℃延伸2.5min，5个循环；94℃变性1min，56℃退火1.5min，72℃延伸2.5min，30个循环；最后72℃延伸10min。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，电泳条件：电压100V，时间25min。将凝胶电泳检测到的目的条带进行切割回收，然后与载体连接，在感受态细胞中进行转化，最后将混合产物均匀涂在LB培养基的平板上，在37℃培养箱中过夜培养。选取至少5个单克隆进行测序，所得序列如SEQ ID NO:3所示，共1795bp。经比对，其中前面21个碱基为正向引物(与正向引物相比在第10个位点插入了G)，后面25个碱基为反向引物，中间为18S rDNA序列。

将获得的GT-1的18S rRNA序列在NCBI中进行Blast，发现与索罗金小球藻PragA14(序列号：X74001)的相似度最高，为99％(如图2所示)。利用CLC Sequencer Viewer7.5软件对GT-1和PragA14的18S rRNA序列进行比对，发现前者有3个位点缺失(具体为779位点、903位点和1797位点在GT-1中有缺失)，2个位点差异(分别是1361位点和1694位点)，即共有5个位点不同，相似度为99.72％。

将NCBI数据库中索罗金小球藻全部藻株的18S rDNA序列进行比对，去掉差异较大藻株序列。以尖细栅藻(Scenedesmus acuminatus)AB037088的18S rDNA序列为种外群来构建系统发育树。具体而言，利用Mega5.1软件，采用ClustalW软件包对所有序列进行多序列比对，比对参数为默认值。然后根据邻接法(Neighbor-joining)，Test of Phylogeny选用分支法，各分支的重复数为1000，核苷酸替换模式为Maximum Composite Likelihood，构建系统进化树。从进化树上得知目标藻株GT-1与索罗金小球藻PragA14和索罗金小球藻SAG211-31亲缘关系最近(如图3所示)。

由此可见，目标藻株属于索罗金小球藻。

B.ITS序列的扩增及序列分析

索罗金小球藻GT-1的ITS序列的扩增引物如下：

正向引物：5′-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3′(SEQ ID NO:4)；和

反向引物：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′(SEQ ID NO:5)。

PCR扩增的反应体系为40μL，取4μL总DNA作为模板。扩增条件如下：94℃预变性6min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸60s，30个循环；最后72℃延伸10min。用1％琼脂糖凝胶电泳检测其扩增产物，电泳条件：电压170V，时间20min。选取电泳检测后清晰的条带进行测序，所得序列如SEQ ID NO:6所示，共710bp。

通过与GenBank中其他索罗金小球藻藻株UTEX246(ID:KP645223)和UTEX1230(ID：KP645225)的完整ITS序列进行比对，确定目标藻株GT-1的ITS序列各个部分的组成。ITS序列包括ITS1(内部转录间隔区1)、5.8S rDNA和ITS2(内部转录间隔区2)，各部分均为完整序列，详细信息如下：1-14位点为18S rDNA；15-268位点为ITS1；269-427位点为5.8S rDNA；428-661位点为ITS2；662-710位点为28S rDNA。

NCBI数据库中索罗金小球藻全部藻株的ITS序列有35条。其中部分藻株只包含ITS1或ITS2序列。利用CLC Sequence Viewer7软件对全部藻株的ITS序列进行比对。

首先，去掉4条缺少ITS1序列(ID分别为KR905186，KC416207，AY323463和AY323464)的藻株，基于剩余31条的ITS1和5.8S序列，选用蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)Y8-1KJ855064的ITS序列作为种外群构建系统发育树。利用Mega5.1软件，采用ClustalW软件包对所有序列进行多序列比对，比对参数为默认值。然后根据邻接法，Testof Phylogeny选用分支法，各分支的重复数为1000，核苷酸替换模式为Maximum CompositeLikelihood，构建系统进化树(如图4所示)。系统发育树显示GT-1与索罗金小球藻UTEX261亲缘关系最近，因此将两株的ITS全部的序列(ITS1+5.8S+ITS2)做比对。通过CLCSequencer Viewer7.5软件比对得知两者有35个位点缺失，99个位点差异，相似度为79.97％。

再者，去掉6条缺少ITS2序列的序列(ID分别为KM061457、KM061455、KM061454、KM061453、KP347612和KP347611)，基于剩余29条序列的ITS2序列，选用蛋白核小球藻Y8-1KJ855064的ITS序列作为种外群构建系统发育树。利用Mega5.1软件，采用ClustalW软件包对所有序列进行多序列比对，比对参数为默认值。然后根据邻接法，Test of Phylogeny选用分支法，各分支的重复数为1000，核苷酸替换模式为Maximum Composite Likelihood，构建系统进化树，各分支的重复数均为1000。详细系统进化树(如图5所示)。系统发育树显示GT-1与索罗金小球藻CCALA PragA14亲缘关系最近，因此将两株的ITS2序列做比对。通过CLC Sequencer Viewer7.5软件比对得知两者有31个位点缺失，43个位点差异，相似度为71.65％。

将GT-1的ITS序列，提交至NCBI数据库中进行Blast比对，结果显示GT-1与Chlorella sp.ZJU0201的相似度最高(如图6所示)。通过CLC Sequencer Viewer7.5软件将两者进行比对，有1个位点碱基有差异，相似度为99.84％。但Chlorella sp.ZJU0201小球藻只鉴定到属，并未鉴定到种。也就是说，并不能确定Chlorella sp.ZJU0201也为索罗金小球藻，因此，表明本发明中的GT-1藻株的ITS序列具有特异性。

通过以上分析可知本发明的索罗金小球藻ITS具有特异性，与已报道的其他索罗金小球藻藻株存在显著差异。由此可见，GT-1是一株新的索罗金小球藻藻株。

实施例3.索罗金小球藻GT-1的培养方法

A.索罗金小球藻GT-1的自养培养

使用BG11培养基进行自养培养。

索罗金小球藻GT-1可保藏于250mL三角瓶中，保藏的温度为20-30℃，连续光照强度为5μmol m^-2s^-1，将pH值调节至7。

首先将保藏的GT-1接种至柱状反应器内(内径44mm，培养体积0.6L)培养，接种量为光密度OD₇₅₀＝0.4；培养过程中从底部通入含1-2％CO₂的空气搅拌藻液，连续光照强度165μmol m^-2s^-1，培养温度25℃，设置两个平行。

在培养过程中测定培养物中的细胞干重和培养物的OD₇₅₀。

干重测定方法：每天取样约30mL用于测定细胞干重和细胞数量。每天取5-10mL藻液进行真空膜过滤(Glass Microfibre Filter,696,VWR)，再用相同体积的碳酸氢铵(0.5mol/L)溶液冲洗膜两次后把膜放入烘箱(100℃)烘干至恒重，滤膜的增量即为细胞干重。GT-1在柱状反应器(5cm)中的生长曲线(如图7所示)。

OD₇₅₀测定方法：每日从微藻培养液中取约3mL藻液，使用DR-6000(HACH)分光光度计测定750nm处OD值。

通过以上测定方法得知索罗金小球藻GT-1在如上所述的自养条件下柱状反应器中培养至第11天时，干重可达到3.52g/L，OD₇₅₀值达到7.83。

B.索罗金小球GT-1的异养培养

将改良的Endo培养基I上保藏的GT-1接种于改良的Endo培养基II中进行预培养；将预培养物接种于改良的Endo培养基III进行培养。

首先进行预培养。具体而言，用接种环从平板上挑取1个单克隆或从液体保藏的GT-1挑取1接种环藻细胞接入15ml改良的Endo培养基II(50ml摇瓶)；放在摇床上黑暗培养，温度25℃，转速180rpm，培养5天；按1％接种量转入100ml培养基(250ml摇瓶)，培养4天；再按1％接种量转入300ml培养基(1000ml摇瓶)中培养4天，获得OD₇₅₀＝20-25的预培养物。

然后用发酵罐进行培养。具体而言，利用7.5L发酵罐(BioFlo310，New BrunswickScientific，US)对索罗金小球藻进行培养，将预培养物调整浓度后取300ml，接入装有2.5L改良的Endo培养基III的发酵罐，接种后初始OD₇₅₀为2(生物量0.8～0.9g/L)。培养参数具体为：温度25℃，pH为7.0±0.1，溶氧为40％，溶氧控制模式为溶氧与转速偶联，转速为200～600rpm，通气量为2.8L/min。当还原糖降至5g/L时，通过补加25×基础培养基(即改良的Endo培养基III)的浓缩液，维持藻细胞不断生长，葡萄糖控制在0～30g/L的范围内。培养过程中用1M HCl和1M NaOH调节pH。

培养过程中的还原糖和生物量通过以下方法进行检测。

(1)还原糖：还原糖检测试剂盒(仪器：三诺安稳血糖仪；试纸条：三诺安稳C06)。培养物离心取上清，稀释0～10倍

(2)生物量：GF/C膜抽滤法。对于不同样品而言，具体操作如下。接种后的样品：取5ml抽滤；生物量≦50g/L的样品：取1ml抽滤；50g/L<生物量≦100g/L的样品：取1ml稀释至5倍再取1ml稀释后的培养物抽滤；生物量>100g/L的样品：取1ml稀释至10倍再取1ml稀释后的培养物抽滤。洗液为0.5M碳酸氢铵，用量为50ml/膜。

结果显示，在培养至第6天时可达到最高生物量为125.8g/L，其生长曲线如图8所示。该生物量比目前国内外报道的同种小球藻高出很多。

此外，还对索罗金小球藻GT-1的耐酸性进行了初步研究，发现其在pH5.0培养条件下仍能存活，并能较好生长，异养培养144h(6天)其细胞密度可达42.6g/L。

实施例4.在缺氮培养基中培养索罗金小球藻GT-1

GT-1细胞先进行异养培养然后在缺氮培养基中进行自养培养，获得的培养物用于生化组成分析。具体培养条件为：取异养培养中后期的培养物15ml至50ml离心管中，3000×g离心5min，弃上清，用无氮源BG11培养基悬浮清洗3次，最后用无氮BG11培养基再次悬浮并测定其光密度(OD₇₅₀)。取OD₇₅₀＝0.5的GT-1悬浮液，接种到柱式反应器中(内径44mm，培养体积0.8L)，培养基为缺氮BG11，在缺氮培养基中培养12天时收获，收获的OD₇₅₀＝1.6。培养过程中温度为25℃，通入1-2％的CO2培养，起始阶段，为避免突然换到强光环境导致藻死亡，光照强度起初为50μmol m^-2s^-1，待培养0-2天，藻适应后，将光照强度调整为150μmol m^-2s^-1继续进行光照培养。GT-1在该条件下在第3天达到最大生物量为0.8g/L，之后慢慢下降，具体的生长曲线(如图9所示)。

实施例5.索罗金小球藻GT-1细胞中的化合物含量分析

收获实施例3和4中所培养的GT-1细胞并进行真空冷冻干燥，然后进行如下分析。

A.碳水化合物组成分析

取真空冷冻干燥的GT-1细胞，加入冰乙酸，80℃水浴20分钟，加入丙酮，1,000g离心10分钟，弃上清，向沉淀中加入4M的三氟乙酸，沸水浴4小时。10,000g离心3min，取上清液与硫酸苯酚显色剂混匀，沸水浴中20分钟，测490nm处的吸光值。用葡萄糖作为标准品，根据标准曲线计算GT-1细胞中总碳水化合物的含量在异养培养时为17.1％，在自养缺氮培养后，含量高达36.5％(如图10所示)。

B.蛋白质组成分析

取真空冷冻干燥的GT-1细胞，加入1M的NaOH，于80℃水浴10分钟。在4℃下12000g离心30分钟。将上清转移到一个新的离心管内，重复NaOH提取步骤两次，合并所有提取的上清液。按G-Biosciences蛋白浓度测定试剂盒说明书，测得异养培养的藻细胞蛋白质含量为21.9％，而自养缺氮诱导的藻细胞蛋白质含量只有8.7％(如图11所示)。

C.脂肪酸组成分析

取真空冷冻干燥的GT-1细胞，依次加入氯仿:甲醇(2:1，v/v)、5％HCl和十三酸，混匀后85℃甲酯化一小时，转甲酯完成后，给每个样品中加入1mL的正己烷混匀，静置分层。取上层相到GC上样瓶中，加入十五烷做内标，混匀上样。外标物为37种脂肪酸混标(SigmaAldrich，#18919-1AMP)。所用仪器是安捷伦的7890B-5977A，柱子为HP-88 60m x 0.25mmID x0.2μm FT。上样量为1μl，分流比为20：1，进样口温度为250℃，流速为1ml/min。柱温50℃，2min；25℃/min升为175℃保持5min；7℃/min升至210℃后保持2min；2℃/min升为230℃保持1min。质谱检测器：离子源温度为230℃，四级杆温度为150℃，扫描范围30～400。

异养培养和自养缺氮培养的藻细胞总脂含量分别为25.3％和51.9％(如图12所示)。GT-1在异养培养时，可检测到8种脂肪酸，在自养缺氮时，除了异养条件下检测到的8种脂肪酸，还检测到C16:1和C18:1-cis这两种脂肪酸。在两种培养条件下，C16:3、C18:1-trans、C18:2和C18:3这四种脂肪酸均为最主要的脂肪酸组分，可占到总脂肪酸含量的80％以上。在自养缺氮后，C16:3和C18:3含量较自养培养时显著增多(如图13所示)。

实施例6.在缺氮条件下培养的索罗金小球藻GT-1的形态学分析

上述各实施例的结果显示索罗金小球藻GT-1的细胞具有生长速度快且生物量高的特点，其油脂含量可达细胞干重的50％以上。在自养缺氮诱导的条件下，细胞内的淀粉含量降低而油脂含量明显升高。

为了验证以上结论，将索罗金小球藻GT-1细胞分别在BG11培养基和缺氮的BG11培养基上进行培养，分别在第4天和第7天取样，利用透射电镜方法对样品细胞的内部结构进行分析。以期从细胞内部的超微结构，主要是淀粉和油滴的形态和数量上，对假设进行验证。

实验方法：

(1)扩种方法：配制BG11液体培养基，将藻种转接于250mL锥形瓶中，具体为80mL新鲜培养基加入1mL的藻液，3个平行，培养温度为21℃，光照强度为50μmol m^-2s^-1，培养7天后作为藻种。

(2)柱状反应器中培养方法：配制BG11和缺氮的BG11液体培养基，将藻种接种至柱状反应器内培养，具体为150mL新鲜培养基加入50mL的藻液，每种培养基设有2个平行。培养温度为24℃，光照强度为150μmol m-2s-1。用BG11培养基培养的细胞，在第4天进行取样，2个平行；用缺氮的BG11培养基培养的细胞，在第7天进行取样，2个平行。在取样后均用4％戊二醛对样品进行固定，保存在4℃冰箱中，最后进行透射电镜成像。

(3)透射电镜方法：

a)取材与前固定：取新鲜样品，用戊二醛固定液固定1-4h，戊二醛固定液浓度为2.5％，pH为7.0；

b)漂洗与后固定：用0.1mol/L PBS缓冲液漂洗3次，每次15min，然后用1％锇酸固定液(0.1mol/L PBS缓冲液配制，pH 7.0)在室温下固定3-4h，再用缓冲液漂洗3次，每次15min；

c)脱水：30％，50％，70％，80％，90％，100％乙醇各30min，100％乙醇：100％丙酮(1:3,1:1,3:1)各30min，100％丙酮两次，每次30min；

d)包埋剂的渗透与聚合：所用包埋剂为Epon812环氧树脂，脱水后的样品再经以下溶剂渗透：

丙酮：包埋剂＝1:1 渗透1h，

丙酮：包埋剂＝1:3 渗透1h，

纯包埋剂渗透24h或过夜，

然后将渗透好的样品转入胶囊中进行包埋，在60℃聚合器中聚合48h后便得到包埋块；

e)切片：用莱卡U7超薄切片机切片，切片厚度为70纳米；

f)双染色：用醋酸铀(2％)与柠檬酸铅双染色；以及

g)电镜观察。

实验结果：

用BG11培养基培养的细胞的透射电镜结果如图14所示。从A、B、D和F可看出细胞形态为圆形或椭圆形。A显示细胞的内部的蛋白核、淀粉粒和细胞核；B显示细胞内淀粉粒数量明显增多及由淀粉粒包裹的蛋白核；C显示细胞内详细的蛋白核结构，是由两个半月形的结构组成；D显示细胞内较多的淀粉粒和少量油滴；E为正在分裂的细胞，显示细胞内部的色素体(叶绿体)、淀粉粒及细胞核，淀粉粒镶嵌在色素体中；F显示细胞的群体形态。

从图14可以看出，索罗金小球藻GT-1细胞在BG11培养基中培养3 天后细胞内淀粉粒的数量较多，有时可占满整个细胞，淀粉粒一般镶嵌在色素体内。细胞内部一般有1个蛋白核，其是由两个半月形的结构组成。有的细胞内有少量的油滴。对于新分裂的细胞，细胞核所占比例较大，色素体清晰可见，并且其中含有少量的淀粉粒。

用缺氮的BG11培养基培养的细胞的透射电镜结果如图15所示。A显示细胞为圆形，含有较多的油滴和淀粉粒；B显示细胞内部的蛋白核、淀粉粒和油滴；C显示细胞内含有大量的油滴和极少的淀粉粒；D显示刚分裂的细胞内同样含有淀粉粒和较多的油滴。

从图15可以看出，索罗金小球藻GT-1细胞在缺氮的BG11培养基中培养6天后细胞内部的油滴数量明显增多，有的细胞内部绝大部分都是油滴(如图15的C)。细胞内淀粉粒的数量有的细胞内较多，有的细胞内较少，但相比正常BG11培养基培养的细胞，淀粉粒数量总体在降低。另外，对于刚分裂的细胞内同样可观察到较多的油滴(如D)。

通过对索罗金小球藻GT-1细胞在BG11培养基和缺氮的BG11培养基培养后所获得的透射电镜结果对比分析可知，在BG11培养基中，细胞内淀粉粒的数量相对较多，有的细胞内含有少量的油滴；在缺氮的BG11培养基中，虽然有的细胞内淀粉粒的数量仍较多，但细胞内油滴的含量显著增多，即使是在刚分裂的细胞内也可看到明显的油滴。上述实验及电镜图像，从细胞内部的超微结构证明了，本发明索罗金小球藻GT-1细胞在缺氮条件下培养后，其中的油脂大量积累。

参考文献：

1.Firoz A,Saleh M,Harun C.Third generation biofuel from Algae.2015,Procedia Engineering,105:763-768.

2.Mayur M.Phukan a,Rahul S.Chutia b,B K Konwar a,R Kataki.MicroalgaeChlorella as a potential bio-energy feedstock.2011,Applied Energy 88:3307-3312.

3.Izabela K,Agata P,Artur N,Diana S,Jacek W.Alterations of the lipidcontent and fatty acid profile of Chlorella protothecoides under differentlight intensities.2015,Bioresource Technology,196:72-77.

4.Liang Y,Sarkany N,Cui Y.Biomass and lipid productivities ofChlorella vulgaris under autotrophic,heterotrophic and mixotrophic growthconditions.2009,Biotechnol.Lett.31:1043–1049.

5.Zheng Y,Chi Z,Lucker B,Chen S.Two-stage heterotrophic andphototrophic culture strategy for algal biomass and lipid production.2012,Bioresour.Technol.,103:484–488.

6.Liu J,Huang J,Sun Z,Zhong Y,Jiang Y,Chen F.Differential lipid andfatty acid profiles of photoautotrophic and heterotrophic Chlorellazofingiensis:assessment of algal oils for biodiesel production.2011,Bioresour.Technol.,102:106–110.

7.Tang D,Han W,Li P,Miao X,Zhong J.CO2biofixation and fatty acidcomposition of Scenedesmus obliquus and Chlorella pyrenoidosa in response todifferent CO2levels.2011,Bioresour.Technol.102:3071–3076.

8.Tang H,Chen M,Ng K Y,Salley S O.Continuous microalgae cultivationin a photobioreactor.2012,Biotechnol.Bioeng.109:2468–2474.

9.Mayur M P,Rahul S C,B K Konwar,R Kataki.Microalgae Chlorella as apotential bio-energy feedstock.2011,Applied Energy,88:3307-3312.

10.Juntila D J,Bautista M A,Monotilla W.Biomass and lipid productionof a local isolate Chlorella sorokiniana under mixotrophic growthconditions.2015,Bioresour.Technol.,http://dx.doi.org/10.1016/ j.biortech.2015.03.098。

11.张桂艳，温小斌，梁芳，欧阳峥嵘，耿亚红，梅洪，李夜光。重要理化因子对小球藻生长和油脂产量的影响。《生态学报》2011，31(8)：2076-2085。

12.崔静，刘建国。产油微藻的筛选评价与诱导油脂积累研究。2012，中国科学院研究生院(海洋研究所)，硕士毕业论文。

13.黄宝玺，王大为，王金凤。多不饱和脂肪酸的研究进展。《农产品加工业》2009，8：26-30。

14.王萍，张银波，江木兰。多不饱和脂肪酸的研究进展。《中国油脂》2008，12：42-46。

15.孙翔宇，高贵田，段爱莉，顾浩峰，李冰，薛骞。多不饱和脂肪酸的研究进展。《食品工业科技》2012，7：418-423。

Claims

1.索罗金小球藻(Chlorella sorokiniana)藻株GT-1，以保藏号CGMCC No.11801保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。

2.一种以自养方式培养索罗金小球藻的方法，包括将权利要求1的藻株置于培养基中，并在20-30℃，连续光照强度为150-200μmol m^-2s^-1，pH值5-8，以及通入CO₂的条件下培养。

3.根据权利要求2的方法，其中所述培养基为BG11培养基。

4.根据权利要求2或3的方法，其中所述培养在pH值6-7的条件下进行。

5.根据权利要求2或3的方法，其中所述培养进行6-12天。

6.一种以异养方式培养索罗金小球藻的方法，包括将权利要求1的藻株置于异养培养基中，并在25-35℃，pH值5-8，以及溶氧浓度20-100％的条件下进行连续补料培养。

7.根据权利要求6的方法，其中所述异养培养基为改良的Endo培养基III，所述改良的Endo培养基III含有葡萄糖30g/L、硝酸钾5g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁5mg/L、氯化钙0.01g/L、A5溶液1mL/L和EDTA二钠3.7mg/L，pH 6.5，所述A5溶液含有硼酸2.86g/L、七水硫酸锌0.222g/L、四水氯化锰1.81g/L、钼酸钠0.021g/L和二水硫酸铜0.07g/L。

8.根据权利要求6或7的方法，其中所述培养在pH值6-7的条件下进行。

9.根据权利要求6或7的方法，其中所述培养在30℃进行。

10.根据权利要求6或7的方法，其中所述溶氧浓度为40-60％。

11.根据权利要求6或7的方法，其中所述培养进行6-12天。

12.根据权利要求6或7的方法，其中所述藻株以OD₇₅₀＝1-16的接种量置于异养培养基中。

13.根据权利要求6或7的方法，进一步包括预培养的步骤。

14.根据权利要求2、3、6或7的方法，进一步包括收集细胞并从所收集的细胞分离蛋白质或油脂的步骤。

15.一种对索罗金小球藻进行培养的方法，包括：

(i)将权利要求1的藻株进行增殖；

以及任选地，

(iii)收集所培养的细胞。

16.根据权利要求15的方法，其中步骤(i)的增殖使用权利要求2-13任一项的方法进行。

17.根据权利要求15或16的方法，其中所述缺氮培养基是缺氮的BG11培养基。

18.根据权利要求15或16的方法，其中所述缺氮培养基是缺氮的改良的Endo培养基III，所述改良的Endo培养基III含有葡萄糖30g/L、硝酸钾5g/L、磷酸二氢钾1g/L、七水硫酸镁1g/L、七水硫酸亚铁5mg/L、氯化钙0.01g/L、A5溶液1mL/L和EDTA二钠3.7mg/L，pH 6.5，所述A5溶液含有硼酸2.86g/L、七水硫酸锌0.222g/L、四水氯化锰1.81g/L、钼酸钠0.021g/L和二水硫酸铜0.07g/L。

19.根据权利要求17的方法，其中步骤(ii)中将所述细胞以OD₇₅₀＝0.1-0.5的接种量置于缺氮的BG11培养基中，并在20-30℃，连续光照强度为50μmol m^-2s^-1，pH值5-8，以及通入CO₂的条件下进行培养，其中培养0-2天后，光照强度变为150μmol m^-2s^-1。

20.根据权利要求15或16的方法，其中步骤(ii)中的pH值为6-7。

21.根据权利要求15或16的方法，在步骤(i)和(ii)之间进一步包括收集增殖的细胞，并用缺氮培养基进行清洗的步骤。

22.根据权利要求15或16的方法，进一步包括收集细胞并从所收集的细胞分离油脂的步骤。

23.权利要求1的藻株在制备油脂或生物柴油中的用途。

24.权利要求1的藻株在制备不饱和脂肪酸中的用途。

25.权利要求1的藻株在制备营养保健品中的用途。

26.权利要求1的藻株在制备蛋白质中的用途。

27.一种组合物，其包含权利要求1的藻株的细胞和/或其提取物，所述组合物是药物组合物或食品组合物。

28.一种组合物，其包含权利要求1的藻株的细胞和/或其提取物，所述组合物是营养补充剂。

29.一种组合物，其包含权利要求1的藻株的细胞和/或其提取物，所述组合物是饲料添加物。