KR101684254B1

KR101684254B1 - 갯벌 추출액 및 부식산을 이용한 미세조류 고농도 배양 방법

Info

Publication number: KR101684254B1
Application number: KR1020150189240A
Authority: KR
Inventors: 김시욱; 김근호
Original assignee: 조선대학교산학협력단
Priority date: 2015-12-30
Filing date: 2015-12-30
Publication date: 2016-12-08

Abstract

본 발명은 갯벌 추출액 및 부식산을 이용한 미세조류 고농도 배양 방법에 관한 것으로, 구체적으로 갯벌 추출액 또는 부식산을 첨가한 혼합 배지를 제조하고, 상기 혼합 배지에 미세조류를 배양한 결과, 바이오매스 건조 생산성 및 지질 생산성이 향상되고, 고부가 유효성분 생산성이 향상됨을 확인함으로써, 본 발명의 갯벌 추출액 및 부식산을 이용한 미세조류 고농도 배양 방법은 저비용으로 높은 생산성을 가져 바이오에너지 생산에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

갯벌 추출액 및 부식산을 이용한 미세조류 고농도 배양 방법{Method for high concentration cultivation of microalgae using mud-clay extracts or humic acid}

본 발명은 갯벌 추출액과 부식산을 이용한 담수 및 해수 서식 미세조류의 고농도 배양 방법에 관한 것으로, 바이오디젤 등의 바이오에너지 생산과 다양한 고부가 유용물질 생산 및 상업적 이용을 위한 기술과 관련되어 있다. 특히 본 발명은 갯벌 추출액과 부식산을 이용한 미세조류 내 지방산 조성을 조절하는 기술과도 관련성이 깊다.

미세조류는 현재 지구상에 약 30만 종 이상이 분포된 것으로 보고되고 있어 종 다양성이 매우 뛰어나며, 종에 따라 생리학적 특성과 생장주기 등이 다르므로 다양한 분야에 적용이 가능하다. 특히 미세조류는 최근 바이오에너지, 고부가 유용성분(β-carotinoid, EPA 및 DHA 등)생산, 축산 및 어패류 양식 먹이생물 이용 등 관련 분야 연구 및 개발이 활발히 진행 중이며, 전 세계적으로 이목이 집중되고 있는 생물종이다.

특히, 최근 급속한 산업화와 더불어 막대한 양의 화석연료의 수요 증가로 인한 대기오염과 화석연료의 고갈, 기후변화(지구온난화), 그리고 유가 불안정 등 범지구적으로 해결해야 하는 중요 과제 중 하나이다. 특히, 지구온난화로 인한 급격한 기후 변화는 과도한 산림 벌채와 과도한 화석연료의 사용으로 인해 배출되는 이산화탄소, 메탄, 그리고 이산화질소 등이 유력한 원인으로 보고되었다.

이러한 문제 해결을 위해 전 세계적으로 화석연료를 대체할 수 있는 신재생 에너지와 대체자원 개발 및 연구에 막대한 인력과 비용을 투자하고 있다. 점차적으로 바이오연료의 수요 및 필요성이 증가함에 따라 많은 나라에서 바이오에너지 생산을 위한 생물자원의 수요가 증가하였으며, 특히 담수 혹은 해수에 서식하는 미세조류를 이용한 3세대 바이오연료(3세대 생물자원) 생산이 각광받고 있다.

미세조류가 바이오에너지 생산의 차세대 대안으로 주목받는 이유는 첫째, 식량자원이 아니다. 몇몇 거대 및 미세조류는 식용 및 가공식품으로 이용되지만, 대부분의 미세조류들은 비식용 자원이기 때문에 식용작물과 가격경쟁을 피할 수 있다. 둘째, 옥수수, 대두, 팜(1세대 생물자원) 그리고 목재(2세대 생물자원) 등과 같은 생물자원에 비해 비교적 배양이 쉽다. 대부분의 조류는 광합성 생물로, 이산화탄소, 물, 그리고 빛 에너지만을 이용하여 생장이 가능하기 때문에 비교적 배양이 쉽다. 셋째, 이산화탄소의 고정률이 높다. 이전 연구 결과를 통해 보고된 것처럼, 1, 2세대 생물자원의 이산화탄소 고정률은 각각 4 ~ 10ton/ha이나 미세조류의 이산화탄소 고정률(> 36.7 ton/ha)은 약 6배 이상 우수하다. 넷째, 생물자원의 회수기간이 매우 짧다. 1세대 생물자원은 우리나라의 경우 연간 최대 2회 이상 회수가 어려우며, 목질계(2세대 생물자원)의 경우 앞에서 언급한 바와 같이 최소 8년의 시간이 요구된다. 하지만, 3세대 생물자원인 미세조류는 계절 및 지역에 따른 차이는 있으나 연간 최소 5회에서 최대 20회 이상 회수가 가능하고, 생물학적 개량과 배양기술개발을 통해 보다 많은 생물자원의 회수가 가능하다. 마지막으로 에너지 전환율이 높다. 미세조류의 에너지 전환율은 약 45% 이상으로 1 세대 생물자원(30 ~ 35%)과 2세대 생물자원(20 ~ 25%)보다 10%이상 높은 전환율을 나타낸다. 또한, 미세조류 배양 시 다양한 탄소원(glucose, glycerol and acetic acid 등)첨가를 통해 바이오연료의 생산량 증대가 가능하고, 다양한 생물학적 개량을 통해 바이오연료 생산량 증대와 미세조류 내 다양한 생체분자(탄수화물, 단백질, 지질 그리고 고부가 유용성분 등)의 생산량 증대를 기대할 수 있다.

미세조류를 이용한 바이오연료(바이오디젤) 및 고부가 유용성분 생산은 배양-회수-파쇄-추출-전환 및 생산 등의 복잡한 과정을 거치게 되며, 이에 따른 각 공정별 요구비용 비중은 약 42, 22, 20 및 16%로 보고된 바 있다. 따라서 미세조류를 이용한 바이오디젤 및 고부가 유용성분 생산에 있어 가장 큰 비중을 차지하는 공정은 배양공정으로 대상 미세조류에 대한 효과적인 배양공정개발이 필수적이다.

고농도 배양을 위해 신규 균주 탐색, 다양한 유기탄소원 첨가, 미세조류의 생물학적 개량 그리고 광생물반응기 개발 등 다양한 분야로 연구가 진행 중이다. 현재 국내외 많은 연구진을 중심으로 미세조류의 생물학적 개량을 통해 미세조류의 생장속도와 목적 유용성분의 생산량을 높이기 위한 다양한 연구가 이루어지고 있으나 클라미도모나스 속(Chlamydomonas sp.), 클로렐라 속(Chlorella sp.) 그리고 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 등과 같은 일부 균주를 대상으로만 이뤄지고 있고, 현재까지 생물학적 개량을 통한 미세조류에 대한 연구는 진행 중이다. 그리고 글루코오스(glucose) 및 글리세롤(glycerol) 등과 같은 다양한 유기 탄소원 첨가를 통한 미세조류의 고농도 배양 방법은 미세조류의 생장속도 및 유효성분 생산량을 단기간에 높이는 좋은 방법이지만 유기 탄소원 첨가로 인한 배양공정의 비용증가를 초래하여 최근 폐유기 탄소원을 미세조류의 고농도 배양을 위한 유기 탄소원으로 이용하고자 하는 다양한 연구를 진행 중이다. 하지만, 폐유기 탄소원을 이용하여 배양된 미세조류를 이용한 식품, 미용 등 고부가 유효성분 생산은 정제 공정이 필수적으로 요구되어 미세조류 배양공정의 비용 증가와 다양한 상업적 적용에 한계가 있다. 또한, 유기 탄소원의 첨가는 단지 미세조류의 생장속도 증가에만 영향을 미치고 미세조류 내 다양한 유효성분 생산에는 별로 영향을 주지 않는다. 마지막으로 미세조류의 고농도 배양을 위해 다양한 형태 및 재질의 개발을 통한 광생물 반응기 개발도 필수적으로 이루어져야 하지만, 미세조류 종별 특이성, 지역 및 기후에 대한 특이성에 따른 적용이 매우 까다로우며 배양공정 비용 절감에 한계가 있다.

지금까지 바이오디젤 생산을 위해 연구된 대표적인 미세조류 종은 담수종으로 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgairs)와 쎄네데스무스 오블리퀴스(Scenedesmus obliquus)가 있고, 해수종으로는 아이소크라이시스 갈바나 (Isochrysis galbana)와 난노클로롭시스 오큐라타(Nannochloropsis oculata)가 있으며, 비교적 높은 생장률과 20 ~ 40% 내외의 지질을 함유하고 있다. 한편 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)과 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)는 다른 미세조류에 비해 높은 지질 함량(>50%)을 갖고 있으나, 생장률이 매우 낮아 바이오매스 및 지질 생산성이 매우 낮다. 이에, 미세조류의 높은 생장률 및 유효성분 생산을 위해 고가의 탄소원 첨가, 배양기 개발 및 배양주변기술 개발 등의 다양한 기술 적용이 필요하다.

이와 관련하여, 현재 미세조류를 에너지원으로 이용하기 위한 많은 연구가 진행되었는데, 일례로 한국공개특허 제2011-0007989 호에는 '오일 생성능을 가지는 미생물을 이용한 지방산 알킬에스테르의 제조방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2000-0000842호에는 '미세조류로부터 탄화수소의 추출방법'이 개시되어 있고, 한국공개특허 제2011-0002951호에는 '폴리하이드록시알카노에이트 생성능을 가지는 미생물을 이용한 하이드록시알카노에이트 알킬에스테르의 제조방법'이 개시되어 있으나, 미생물의 생장 및 유효성분을 증대시키기 위한 저비용, 고효율의 방법은 아직까지 미미한 실정이다.

본 발명은 갯벌 추출액을 기존 미세조류 배지에 첨가하여 미세조류의 생장과 다양한 생체분자 생산을 극대화하고자 한다. 갯벌을 포함한 다양한 토양 추출액은 다양한 금속이온과 유기물을 함유하고 있어 현재 미세조류 뿐만 아니라 다양한 미생물 배양시 이용된다. 특히 갯벌 추출물은 미세조류 배양 시 생장을 촉진 시키는 부식질(humus) 등과 같은 유기물, 비타민 그리고 미량 영양원을 함유하고 있으며 부식질 내 주요 성분인 부식산(humic acid) 및 풀빅산(fulvic acid)은 미량을 첨가할 경우 미생물 생장을 촉진 시키며, Mg, Fe, Na 그리고 Si 등과 같은 미량 금속원소들은 미세조류 내 지질 등의 합성에 긍정적인 효과를 유도함을 확인하였다. 따라서 갯벌 추출액 첨가를 통해 미세조류의 생장을 촉진시킴과 동시에 지질 등의 생체분자 합성을 증가시키고자 한다.

본 발명의 목적은 종래의 미세조류의 고농도 배양 방법에 있어서의 문제점을 해결하고자 하는 것이다. 구체적으로 상기한 과제는 미세조류를 이용한 바이오디젤 및 고부가 유효성분 생산에 있어서 고가의 탄소원을 대체할 수 있는 갯벌 추출액 및 부식산을 이용한 고농도 미세조류 대량배양 방법을 제시함으로써 달성한다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 미세조류 배지에 갯벌 추출액을 첨가한 혼합 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 미세조류 배양 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 미세조류 배지에 부식산을 첨가한 혼합 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 미세조류 배양 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 본 발명의 방법으로 제조된 미세조류를 제공한다.

또한, 본 발명은 미세조류 배지에 갯벌 추출액 및 부식산으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상을 첨가하여 제조된 미세조류 배양 배지를 제공한다.

도 1은 미세조류의 고농도 배양을 위한 갯벌 추출액을 조제하는 과정을 나타내는 도면이다.
도 2는 미세조류의 고농도 배양을 위한 미세조류 별 배지(500 ㎖)와 갯벌 추출액의 혼합 비율(v/v)에 따른 바이오매스 건조 생산량을 나타내는 도면이다.
도 3은 미세조류 별 배지(500 ㎖)와 갯벌 추출액의 혼합 비율(v/v)에 따른 총 지질 함량(%, w/w)을 나타내는 도면이다.
도 4는 미세조류 별 배지(500 ㎖)에 처리한 부식산 첨가량에 대한 바이오매스 건조 생산량을 나타내는 도면이다.
도 5는 미세조류 별 배지(500 ㎖)에 처리한 부식산 첨가량에 대한 총 지질 함량(%, w/w)을 나타내는 도면이다.
도 6는 10 ℓ 관형-광생물반응기에서 미세조류 별 최적 갯벌 추출액 혼합 배지를 이용한 바이오매스 건조 생산량을 나타낸 도면이다.
도 7은 10 ℓ 관형-광생물반응기에서 미세조류 별 최적 부식산 첨가량에 대한 바이오매스 건조 생산량을 나타낸 도면이다.

이하 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 미세조류 배지에 갯벌 추출액을 첨가한 혼합 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 미세조류 배양 방법을 제공한다.

상기 미세조류는 남조류, 녹조류, 홍조류, 은편도조식물문, 클로라라크니오조식물문, 작편보조류, 유클레나식물문, 부등편모조식물문 및 규조류 등일 수 있으며, 클로렐라(Chlorella), 쎄네데스무스(Scenedesmus), 보트리오코커스(Botryococcus), 아이소크라이시스(Isochrysis), 난노클로롭시스 (Nannochloropsis), 패오닥틸럼(Phaeodactylum), 두나리엘라(Dunaliella), 헤마토코커스(Haematococcus) 및 키토세로스 속(Chaetoceros sp.)인 것이 바람직하며, 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgairs), 쎄네데스무스 오블리퀴스(Scenedesmus obliquus), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 아이소크라이시스 갈바나(Isochrysis galbana), 난노클로롭시스 오큐라타(Nannochloropsis oculata), 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum), 두나리엘라 살리나(Dunaliella salina), 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis) 및 키토세로스 속(Chaetoceros sp.)인 것이 더욱 바람직하며, 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 보트리오코커스 브라우니, 아이소크라이시스 갈바나, 난노클로롭시스 오큐라타, 패오닥틸럼 트리코누툼인 것이 가장 바람직하다.

상기 미세조류 배지는 BBM(Bold's Basal medium) 배지, JM 배지(Jaworski's medium), BG11 배지(Blue-Green medium), D(Castenholz) 배지, ASW 배지(Artificial Sea Water medium) 및 f/2 배지를 이용할 수 있으며, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, BBM 배지, JM 배지 및 f/2 배지인 것이 바람직하다.

상기 갯벌 추출액은 개벌 시료를 채취하여, 상온에서 10 내지 14시간 동안 건조한 후 40 내지 80 mesh 채를 이용하여 여과한 다음 증류수와 혼합하여 여과 멸큔하여 제조할 수 있다.

상기 혼합 배지는 미세조류 배지 및 갯벌 추출액을 10:0 내지 0:10의 비율로 혼합하는 것이 바람직하며, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 및 5:5(v/v)로 혼합하는 것이 더욱 바람직하며, 본 발명의 구체적인 실시예에 의하면, 미세조류 배지 및 갯벌 추출액을 6:4(v/v)의 비율로 혼합하는 것이 가장 바람직하다.

상기 혼합 배지는 영양소, 일 예로, 고정 질소원이나 아연, 붕소, 코발트, 구리, 망간 등의 미량 영양소를 포함할 수 있고, 선택적으로 pH를 유지하기 위한 완충액이나 인산염과 같은 구성 성분을 포함할 수 있다. 또한, 상기 배양배지는 아세트산염이나 글루코오스와 같은 고정 탄소원이나 염화나트륨과 같은 염을 포함할 수 있다.

상기 배양은 22 내지 28℃ 온도에서 10 내지 25일 동안 배양하는 것이 바람직하며, 24 내지 27℃ 온도에서 11일 내지 23일 동안 배양하는 것이 더욱 바람직하고, 25 내지 26℃ 온도에서 12 내지 20일 동안 배양하는 것이 가장 바람직하다.

상기 배양은 액체 배지에서 배양될 수 있으며, 상기 액체 배지는 광생물 반응기 내에 함유될 수 있다.

상기 미세조류 배양 방법은 바이오매스 생산성, 지질 생산성 및 고부가 유효성분 생산성이 향상되는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 갯벌 추출액을 조제하여 미세조류 별 배지와 갯벌 추출액을 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 및 5:5(v/v)의 비율로 각각 혼합하여 클로렐라 불가리스 및 쎄네데스무스 오블리퀴스는 12일 동안 배양하고, 아이소크라이시스 갈바나 및 난노클로롭시스 오큐라타는 13일 동안 배양하였으며, 보트리오코커스 브라우니 및 패오닥틸럼 트리코누툼은 20일 동안 각각 배양한 다음 바이오매스 건조 생산량 및 지질 함량을 조사한 결과 6:4(v/v)의 비율로 혼합된 배지에서 기존 배지보다 배양 시간이 단축되고 바이오매스 건조 생산량 및 지질 생산성이 증가함을 확인하였다(도 2 및 도 3 참조).

또한, 미세조류 배지에 부신산을 첨가하여 배양한 경우, 1 g/ℓ 부신산을 첨가하였을 때 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 아이소크라이시스 갈바나 및 난노클로롭시스 오큐라타에서 가장 높은 건조 생산량을 나타내었으며, 부식산 첨가량이 증가할수록 미세조류의 바이오매스 당 총 지질 함량이 일정한 증가율을 보임을 확인하였다(도 4 및 도 5 참조)

또한, 앞서 조사된 미세조류 배지와 갯벌 추출액의 최적 혼합 비율 6:4(v/v)로 조제된 배지를 이용하여 10 ℓ 관형-광생물반응기에서 배양한 경우, 앞선 실험보다 1.5 내지 2배 이상 바이오매스 생산량 및 생산성이 증가함을 확인하였으며(도 6 참조), 1 g/ℓ 및 2 g/ℓ의 부식산을 첨가하여 10 ℓ 관형-광생물반응기에서 배양한 경우, 앞서 조사된 바와 같이 부식산을 첨가한 배지에서 기존 배지보다 바이오매스 건조 생산량 및 지질 생산량 3 내지 20 배 증가하였다(도 7 참조).

마지막으로, 갯벌 추출액 혼합 비율에 따라 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 보트리오코커스 브라우니, 아이소크라이시스 갈바나, 난노클로롭시스 오큐라타 및 패오닥틸럼 트리코누툼의 지방산 분석을 분석한 결과, 갯벌 추출액 혼합 비율이 증가함에 따라 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 아이소크라이시스 갈바나의 경우 C16:2 및 C18:2의 지방산 조성이 점차적으로 증가하였으며, 보트리오코커스 브라우니, 난노클로롭시스 오큐라타의 경우 C16~C18의 지방산 조성이 대부분으로 C18:3의 함량이 점차적으로 감소함을 확인함으로써, 본 발명의 미세조류 배지에 갯벌 추출액을 첨가한 혼합 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 미세조류 배양 방법은 미세조류의 바이오매스 건조 생산량 및 지질 생산량을 높여 고농도 미세조류 대량배양 방법으로 유용하게 이용될 수 있다.

또한, 본 발명은 미세조류 배지에 부식산(humic acid)을 첨가한 혼합 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 미세조류 배양 방법을 제공한다.

상기 미세조류는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgairs), 쎄네데스무스 오블리퀴스(Scenedesmus obliquus), 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii), 아이소크라이시스 갈바나(Isochrysis galbana), 난노클로롭시스 오큐라타(Nannochloropsis oculata), 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum), 두나리엘라 살리나(Dunaliella salina), 헤마토코커스 플루비알리스(Haematococcus pluvialis) 및 키토세로스 속(Chaetoceros sp.)인 것이 바람직하다.

상기 부식산은 0.5 내지 5 g/ℓ의 농도로 첨가되는 것이 바람직하며, 0.8 내지 4.5 g/ℓ의 농도로 첨가되는 것이 더욱 바람직하며, 1 내지 4 g/ℓ의 농도로 첨가되는 것이 가장 바람직하다.

또한, 본 명은 미세조류 배지에 갯벌 추출액 및 부식산으로 이루어진 군에서 어느 하나 이상을 첨가하여 제조된 미세조류 배양 배지를 제공한다.

상기 미세조류 및 갯벌 추출액은 10:0 내지 0:10의 비율로 혼합되어 제조되는 것이 바람직하다.

상기 부식산은 0.5 내지 5 g/ℓ의 농도로 첨가되는 것이 바람직하다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예에 의해 상세히 설명한다.

단, 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예 및 실험예에 의하여 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 미세조류 배양

본 발명에서 대상으로 하는 미세조류는 담수종으로 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgairs), 쎄네데스무스 오블리퀴스(Scenedesmus obliquus) 및 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii)이며, 해수종으로는 아이소크라이시스 갈바나(Isochrysis galbana), 난노클로롭시스 오큐라타(Nannochloropsis oculata) 및 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)을 대상으로 하였다.

구체적으로, 본 발명에 사용된 미세조류 클로렐라 불가리스(C. vulgaris CCAP211/11B)와 난노클로롭시스 오큐라타(N. oculata CCAP849/1)는 CCAP(Culture Collection of Algae and Protozoa, UK)에서 구입하였으며, 쎄네데스무스 오블리퀴스(S. obliquus R8)는 Yang Hetong 박사 연구팀(Shandong Academy of sciences, China) 그리고 보트리오코커스 브라우니(B. braunii LB572), 아이소크라이시스 갈바나(I. galbana LB987) 및 패오닥틸럼 트리코누툼(P. tricornutum B2089)는 UTEX (the University of Texas at Austin, USA)에서 각각 분양받아 사용하였다.

담수종인 클로렐라 불가리스(C. vulgaris CCAP211/11B)와 세네데스무스 오블리퀴스(S. obliquus R8)는 BBM(Bold's Basal medium), 보트리오코커스 브라우니(B. braunii LB572)는 JM 배지(Jaworski's medium) 그리고 아이소크라이시스 갈바나(I. galbana LB987), 난노클로롭시스 오큐라타(N. oculata CCAP849/1) 및 패오닥틸럼 트리코누툼(P. tricornutum B2089)는 f/2 배지를 이용하여 종균 및 전배양하였다. 배양조건은 6종 미세조류 모두 25℃에서 100 μmol/m²/s의 빛을 12시간을 주기(12h:12h/light:dark)로 공급하였다. 각 미세조류에 일정한 빛을 공급하기 위해 형광등을 이용하였으며, 빛의 세기는 형광등의 개수와 시료와의 거리로 빛의 세기를 조절하였다. 상기 조건에서 클로렐라 불가리스(C. vulgaris CCAP211/11B)와 쎄네데스무스 오블리퀴스(S. obliquus R8)은 12일, 아이소크라이시스 갈바나(I. galbana LB987) 그리고 난노클로롭시스 오큐라타(N. oculata CCAP849/1)는 13일 그리고 보트리오코커스 브라우니(B. braunii LB572) 및 패오닥틸럼 트리코누툼(P.tricornutum B2089)는 20일 동안 각각 배양하였다.

< 실시예 2> 갯벌 추출액 조제

미세조류 별 갯벌 추출액을 첨가한 혼합 배지 조제를 위해 사용한 갯벌시료는 전라남도 여수시 소라면 사곡리 1193-2번지 근처에서 채취하였으며, 채취한 갯벌은 12시간 동안 상온에서 건조 후 60 mesh 채를 이용하여 여과하였다. 여과한 갯벌 약 100 g을 600 ㎖의 증류수에 혼합하여 0.45 μm GF/C filter(Pall, USA)와 0.2 μm membrane filter(Pall, USA)를 순차적으로 이용하여 여과멸균 후 일정 비율로 미세조류 별 최적 배지와 혼합하여 사용하였다. 도 1에서 상기 갯벌 추출액 조제 과정을 간략히 나타내었다(도 1).

< 실시예 3> 갯벌 추출액 혼합 배지 조제를 위한 갯벌 추출액의 특성 조사

갯벌의 특성을 파악하기 위해 갯벌 내 존재하는 금속이온 농도 및 유기물의 농도를 조사하였다.

구체적으로, 채취한 갯벌을 상기 실시예 2 및 도 1과 같은 방법으로 조제한 갯벌 추출액을 ICP-MS(Perkin Elmer, Elan DRCII, USA)를 통해 Zn, Fe, K 그리고 Si 등 9종의 금속이온 농도를 분석하고, 갯벌 내 존재하는 유기물(부식질)의 농도를 조사하기 위해 TOC(TOC 5000, Shimadzu, Japan) 및 CODcr 분석을 수행하였다, 특히 CODcr 분석은 Uv-Visible Spectrophotometer(Du 800, Beckman coulter, U.S.)를 이용하여 흡광도(Absorbance) 620 nm와 420 nm에서 각각 glucose를 이용한 검량곡선 작성 후 갯벌 추출액의 COD의 농도를 측정하였다.

그 결과 하기 표 1 및 표 2에 나타난 바와 같았으며, 하기 결과를 토대로 갯벌 추출액 첨가에 따른 6종 미세조류의 바이오매스 및 지질의 생산에 미치는 영향인자를 파악하였다.

갯벌의 금속이온 농도 분석

㎎/㎏	Zn	Fe	K	Ca	Mg	Mn	Si	Na	Cu
갯벌	95.8	1741.9	2744.6	948.1	2626.4	305.7	97.8	41.6	16.5

갯벌의 유기물 농도 측정

㎎/ℓ	TOC	CODcr
갯벌	338.6	55.4

< 실험예 1> 최적 갯벌 추출액 혼합 비율에 따른 미세조류 별 바이오매스 건조 생산량 및 지질 함량 조사

갯벌 추출액 혼합 배지 조제를 위한 최적 혼합 비율을 조사하기 위해 혼합 비율에 따른 미세조류 별 바이오매스 건조 생산량 및 지질 함량을 조사하였다.

구체적으로, 1 ℓ 플라스크에 상기 <실시예 1>의 미세조류 별 배지 각각과 <실시예 2>의 갯벌 추출액을 10:0, 9:1, 8:2, 7:3, 6:4 및 5:5(v/v)의 비율로 혼합하여 <실시예 1>의 배양 조건으로 클로렐라 불가리스 및 쎄네데스무스 오블리퀴스는 12일 동안 배양하고, 아이소크라이시스 갈바나 및 난노클로롭시스 오큐라타는 13일 동안 배양하였으며, 보트리오코커스 브라우니 및 패오닥틸럼 트리코누툼은 20일 동안 각각 배양하였다.

그런 다음, 상기 각 미세조류 배양 후 바이오매스 건조 생산량 조사는 100 ㎖의 미세조류 배양액을 0.8 ㎛ 유리 여과막(Pall, USA)를 이용하여 여과 후 105℃에서 8시간 동안 건조기(Advantec, FUW234PA, Japan)에서 건조하고, 미량저울(Ohaus, Explorer EX623)을 이용하여 여과지의 무게를 측정하여 여과지 무게의 여과 전/후 무게의 차를 미세조류 별 바이오매스 건조 생산량 값으로 하였다. 또한, 미세조류 별 지질 함량 조사를 위해 미세조류 배양액을 5,000 x g 에서 10분 동안 원심분리 (Beckman Coulter, Avanti J-E, USA)후 상등액을 제외한 침전된 시료를 회수하여 -30℃에서 동결시킨 시료를 -50℃ 및 진공조건에서 시료를 동결건조 하였다. 건조된 시료 1 g을 200 ㎖의 증류수에 혼합하여 10 kHz에서 5분 동안 초음파 파쇄기 (Sonifier 250, Branson, USA)를 이용하여 시료를 파쇄한 후 chloroform-methanol(2:1, v/v) 용액과 파쇄된 시료를 분별깔대기에서 혼합 후 지질을 추출하였다(Folch et al. 1957). 1시간 후 chloroform 층을 받아 회전 증발 농축기(Buchi, Rotavapor R-205, Switzerland)를 이용하여 chloroform을 제거 후 미세조류의 지질만을 회수하여 미량 저울로 측량 후 미세조류 별 지질의 함량(%, w/w)및 생산량을 산출하였다.

그 결과 도 2에 나타난 바와 같이, 10:0(v/v)의 혼합 비율(대조군, 미세조류 별 기존 배양 배지)에서 배양한 결과, 클로렐라 불가리스와 쎄네데스무스 오블리퀴스는 12일 동안 배양하여 1.76 g/ℓ과 2.31 g/ℓ의 바이오매스 건조 생산량을 나타내고, 아이소크라이시스 갈바나, 난노클로롭시스 오큐라타는 13일 동안 배양한 결과 0.95 g/ℓ와 1.69 g/ℓ의 바이오매스 건조 생산량을 나타내었으며, 보트리오코커스 브라우니 및 패오닥틸럼 트리코누툼은 20일 동안 배양하여 0.79 g/ℓ 및 0.94 g/ℓ의 바이오매스 건조 생산량을 나타내었다. 또한, 6:4(v/v)의 비율로 혼합된(배지:갯벌 추출액) 혼합 배지에서 6종 미세조류의 바이오매스 건조 생산량은 클로렐라 불가리스와 쎄네데스무스 오블리퀴스가 7일 동안 4.37 g/ℓ 및 3.51 g/ℓ로 나타났고, 보트리오코커스 브라우니는 10일 동안 6.34 g/ℓ로 나타났으며, 아이소크라이시스 갈바나, 난노클로롭시스 오큐라타는 8일 동안 배양하여 2.66 g/ℓ 및 3.51 g/ℓ으로 나타났다. 그리고 패오닥틸럼 트리코누툼은 10일 동안 12.04 g/ℓ로 가장 높은 바이오매스 건조 생산량을 보였으며, 기존 배지에서의 배양시간보다 단축되어 모든 미세조류 종의 바이오매스 건조 생산량 및 지질의 생산성은 매우 증가하였다(도 2).

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 갯벌 추출액이 증가함에 따라 미세조류 내 지질 함량은 증가하였다(도 3). 따라서 갯벌 추출액 첨가에 따라 각 미세조류의 바이오매스 건조 생산량 및 지질의 생산량 증가에 좋은 영향을 미치는 것으로 조사되었다. 특히 갯벌 내 존재하는 유기물(부식질)로 인해 모든 미세조류의 바이오매스 건조 생산량 증가에 큰 영향을 미치는 것으로 판단된다.

< 실험예 2> 부식산 첨가량에 따른 미세조류 별 바이오매스 건조 생산량 및 지질 함량 조사

갯벌 추출액 내 존재하는 유기물 특히 부식산이 미세조류의 바이오매스 건조 생산량에 미치는 영향을 알아보기 위해 실시하였다.

구체적으로, 토양(갯벌 포함)내 존재하는 유기물 중 부식산(Humic acid)은 식물 및 다양한 미생물의 생장 촉진에 효과적으로 알려져 있다. 1 ℓ 플라스크에서 상기 <실시예 1>의 미세조류의 배지 500 ㎖에 부식산(Sigma-aldrich, U.S.)을 0, 0.1, 0.5. 1.0, 2.0, 5.0 및 10.0 g을 각각 첨가하여 바이오매스 건조 생산량 및 지질의 생산량을 상기 <실험예 1>와 동일한 방법으로 조사하였다.

그 결과 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 아이소크라이시스 갈바나 그리고 난노클로롭시스 오큐라타의 경우 0.5 g의 부식산을 첨가하였을 때 각각 4.47 g/ℓ, 3.66 g/ℓ, 2.15 g/ℓ 및 3.39 g/ℓ로 가장 높은 바이오매스 건조생산량을 나타내었으며, 6:4(v/v) 비율의 갯벌 추출액 혼합 배지와 비슷한 바이오매스 건조 생산량을 나타내었다(도 4 및 도 5). 하지만, 보트리오코커스 브라우니 및 패오닥틸럼 트리코누툼은 1.0 g의 부식산을 첨가하였을 때 8.6 g/ℓ 및 13.1 g/ℓ로 갯벌 추출액 혼합배지보다 높은 바이오매스 건조 생산량을 나타내었다(도 4 및 도 5). 하지만, 부식산이 배지 내 1.0 내지 2.0 g 이상 첨가되었을 때 6종의 미세조류 모두 생장이 제한되었으며, 10.0 g의 부식산이 첨가되면 모든 미세조류 종의 생장은 불가하였다(도 4 및 도 5).

또한, 부식산의 첨가에 따른 각 미세조류의 총 지질 함량의 변화를 확인한 결과, 부식산의 첨가량이 증가할수록(0.1 내지 5.0 g) 6종 미세조류의 바이오매스 1 g 당 총 지질의 함량은 일정한 증가율을 보였다. 하지만, 클로렐라 불가리스 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 아이소크라이시스 갈바나 및 난노클로롭시스 오큐라타의 경우 1.0 g/ℓ, 보트리오코커스 브라우니 및 패오닥틸럼 트리코누툼의 경우 2.0 g/ℓ이상의 부식산이 첨가될 경우 미세조류의 지질의 생산량 및 생산성은 감소하였다.

< 실험예 3> 6:4(v/v) 혼합비율의 갯벌 추출액 혼합 배지를 이용한 10 ℓ 관형- 광생물반응기에서 6종 미세조류의 바이오매스 건조 생산량 및 지질 생산량 조사

상기 <실험예 1>에서 조사된 된 갯벌 추출액의 최적 혼합비율 6:4(v/v)로 조제된 배지에서 10 ℓ 관형-광생물반응기를 이용하여 6종의 미세조류별 바이오매스 건조 생산량 및 생산성을 조사하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 1>에서는 갯벌 추출액의 최적 혼합비율 1 ℓ 플라스크 규모에서 실시하였으나, 최적화된 조건에서 대량생산을 위해 관형-광생물반응기(Tubular-photobioreactor)를 제작하여 사용하였다. 관형-광생물반응기는 pyrex glass 재질로 반응기 직경 15 cm, 길이 70 cm로 반응기의 총 부피 12 ℓ scale(working volume : 10 ℓ)로 제작하여 사용하였다. 또한 관형-광생물반응기는 가로 방향으로 눕혀 사용하였으며 본 발명에서는 일반 에어펌프를 이용하여 0.2 ㎛ air filter에 에어를 통과시킨 후 flow meter로 0.05 vvm의 유속으로 조절하여 반응기에 주입하였다. 배양 조건은 상기 <실시예 1>과 동일하게 25℃에서 100 μmol/m²/s의 빛을 12시간을 주기(12h:12h/light:dark)로 공급하여 6종 미세조류 모두 10일 동안 배양하였으며, 상기 <실험예 1>와 동일한 방법으로 바이오매스 건조 생산량 및 지질 생산량을 조사하였다.

그 결과 도 6에 나타난 바와 같이, 클로렐라 불가리스는 6.82 g/ℓ 및 0.97 g/ℓ/d, 쎄네데스무스 오블리퀴스는 7.75 g/ℓ 및 1.11 g/ℓ/d, 보트리오코커스 브라우니는 9.11 g/ℓ 및 0.91 g/ℓ/d 아이소크라이시스 갈바나의 경우 5.20 g/ℓ 및 0.65 g/ℓ/d, 난노클로롭시스 오큐라타는 6.94 g/ℓ 및 0.86 g/ℓ/d 그리고 패오닥틸럼 트리코누툼은 18.49 g/ℓ 및 1.85 g/ℓ/d로 각각 조사되었으며, 1 ℓ 플라스크에서 동일한 조건보다 약 1.5 내지 2배 이상 바이오매스 생산량 및 생산성이 증가하였다(도 6). 이는 광생물반응기의 경우 플라스크보다 미세한 크기의 공기(혹은 이산화탄소)의 안정적인 공급이 미세조류 생장에 효과적이며, 반응기 내 미세조류의 원활한 혼합으로 인해 광합성 효율의 극대화가 가능한 것으로 판단하였다. 그리고 미세조류 별 지질 함량의 경우 큰 변화는 없었으나, 모든 미세조류의 바이오매스 생산량 상승으로 인해 10 ℓ 관형-광생물반응기에서 클로렐라 불가리스는 2.05 g/ℓ 및 0.29 g/ℓ/d, 쎄네데스무스 오블리퀴스는 2.70 g/ℓ 및 0.39 g/ℓ/d, 보트리오코커스 브라우니는 4.86 g/ℓ 및 0.49 g/ℓ/d, 아이소크라이시스 갈바나의 경우 1.96 g/ℓ 및 0.24 g/ℓ/d, 난노클로롭시스 오큐라타는 1.87 g/ℓ 및 0.23 g/ℓ/d 그리고 패오닥틸럼 트리코누툼은 9.87 g/ℓ 및 0.99 g/ℓ/d로 모두 약 1.5 내지 2배 증가하였다(도 6).

상기 실시예에서 조사된 6:4(v/v)의 갯벌 추출액 혼합 배지에서 6종 미세조류의 바이오매스 건조 생산량의 경우 기존 배지에서의 바이오매스 건조 생산량 및 지질 생산량 보다 3 내지 20 배 증가하였다(도 6).

< 실험예 4> 최적 부식산 농도가 첨가된 혼합 배지를 이용한 10 ℓ 관형- 광생물반응기에서 6종 미세조류의 바이오매스 건조생산량 및 지질 생산량 조사

상기 <실험예 2>에서 실시된 결과에 따라 부식산이 첨가된 혼합 배지를 이용한 10 ℓ 관형-광생물반응기에서 6종 미세조류의 바이오매스 생산량 및 생산성을 조사하고 갯벌 추출물 혼합배지의 결과와 비교하였다.

구체적으로, 상기 <실험예 3>과 동일한 10 ℓ 관형-광생물반응기를 이용하여 동일한 방법으로 배양하였으며, 6종의 미세조류 각각의 배지에 10 g 또는 20 g의 부식산을 첨가하여 <실험예 1>와 동일한 방법으로 조사하였다. 상기 <실험예 2>의 실험에서 1 ℓ규모의 실험으로 각 미세조류 별 바이오매스 생산량 증대에 가장 효과적인 부식산 첨가량이 1.0 및 2.0g으로 조사되었고, 본 실험에서는 앞선 실험 결과를 바탕으로 10 ℓ 규모로 실시하여, <실험예 2>의 부식산 양 보다 10배 증가된 부식산을 첨가하였다.

그 결과 도 7에 나타난 바와 같이, 10 g의 부식산에서 클로렐라 불가리스는 7.25 g/ℓ 및 1.04 g/ℓ/d, 쎄네데스무스 오블리퀴스는 6.95 g/ℓ 및 0.99 g/ℓ/d, 아이소크라이시스 갈바나의 경우 5.01 g/ℓ 및 0.63 g/ℓ/d 그리고 난노클로롭시스 오큐라타는 7.62 g/ℓ 및 0.95 g/ℓ/d의 바이오매스 생산량으로 조사되었다(도 7). 20 g의 부식산에서 보트리오코커스 브라우니는 10.54 g/ℓ 및 1.05 g/ℓ/d, 패오닥틸럼 트리코누툼는 21.07 g/ℓ 및 2.11 g/ℓ/d로 각각 조사되었다(도 7). 또한, 10 ℓ 관형-광생물반응기에서 갯벌 추출물 혼합배지와 부식산이 첨가된 배지에서의 6종 미세조류의 바이오매스 건조 생산량 변화는 크지 않았다(도 7).

6종 미세조류의 부식산 첨가에 따른 지질의 생산량 및 지질의 함량 변화를 조사한 결과, 1 ℓ플라스크 상에서의 변화와 유사하였으며, 클로렐라 불가리스는 1.84 g/ℓ 및 0.26 g/ℓ/d, 쎄네데스무스 오블리퀴스는 2.36 g/ℓ 및 0.34 g/ℓ/d, 보트리오코커스 브라우니는 5.48 g/ℓ 및 0.58 g/ℓ/d 아이소크라이시스 갈바나의 경우 1.84 g/ℓ 및 0.23 g/ℓ/d, 난노클로롭시스 오큐라타는 2.10 g/ℓ 및 0.26 g/ℓ/d 그리고 패오닥틸럼 트리코누툼은 11.1 g/ℓ 및 1.11 g/ℓ/d로 각각 조사되었다.

본 실시예에서 조사된 부식산 첨가량에 따라 6종 미세조류의 바이오매스 건조 생산량의 경우 상기 <실험예 3>과 마찬가지로 기존 배지에서의 바이오매스 건조 생산량 및 지질 생산량 보다 3 내지 20 배 증가하였다.

< 실험예 5> 갯벌 추출액 혼합 비율에 따른 6종 미세조류 별 지방산 분석

갯벌 추출액 혼합 비율에 따라 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 보트리오코커스 브라우니, 아이소크라이시스 갈바나, 난노클로롭시스 오큐라타 및 패오닥틸럼 트리코누툼의 지방산 분석(C14 ~ C22)을 실시하였다.

구체적으로, 각 미세조류의 C14 - C22 지방산을 분석하기 위해 기존에 공지된 실험방법(Metcalfe-Schmitz et al., 1966)에 따라 수행하였다. 갯벌 추출액 혼합 비율에 따라 배양된 각각의 미세조류 시료를 메틸화(methylation) 후, Gas chromatography(GC-2010 Plus, Shimadzu, Japan)를 이용하여 분석하였다. 또한, GC를 이용한 지방산 분석을 위해 art-2560 capillary column(length 100 m, 0.25 mm ID, 0.25 ㎛ film thickness) 및 FID(flame ionization detector)를 이용하였으며, GC의 시료 주입구의 온도는 260℃, column 오븐의 초기에 5분 동안 140℃를 유지한 후 분당 4℃씩 220℃까지 증가시켜 15분 동안 유지하였다. 그리고 FID 검출기의 온도는 260℃로 유지하였다.

그 결과 갯벌 추출액 혼합 비율이 증가함에 따라 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 아이소크라이시스 갈바나의 경우 C16:2 및 C18:2의 지방산 조성이 점차적으로 증가하였으며, 보트리오코커스 브라우니, 난노클로롭시스 오큐라타의 경우 C16~C18의 지방산 조성이 대부분으로 C18:3의 함량이 점차적으로 감소하였다. 상기 5종의 미세조류의 경우 갯벌 추출액 함량이 증가함에 따라 비교적 긴사슬의 지방산(> C20)의 함량은 감소하였다. 하지만 패오닥틸럼 트리코누툼은 갯벌 추출액 함량이 증가함에 따라 포화지방산 함량은 감소하고 불포화지방산 특히 omega-3에 해당하는 지방산인 EPA 및 DHA의 함량이 C14~22의 지방산 중 40% 까지 증가하였다.

따라서 본 실시예에 따라 클로렐라 불가리스, 쎄네데스무스 오블리퀴스, 보트리오코커스 브라우니, 아이소크라이시스 갈바나, 난노클로롭시스 오큐라타의 경우 바이오디젤 생산에 적합한 지질 생산성 및 지방산의 함량을 함유하며, 패오닥틸럼 트리코누툼의 경우 고부가 유효생산물인 EPA 및 DHA생산에 보다 적합한 것으로 조사되었다.

Claims

미세조류 배지 및 갯벌 추출액을 7:3 내지 1:1의 부피비로 혼합한 배지에서 배양하는 단계를 포함하되,
상기 미세조류는 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 또는 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)인 것을 특징으로 하는 배양 방법.
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제 1항에 있어서, 상기 배양은 22 내지 28℃ 온도에서 10 내지 25일 동안 배양하는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양 방법.
제 1항에 있어서, 상기 미세조류 배양 방법은 바이오매스 생산성, 지질 생산성 및 고부가 유효성분 생산성이 향상되는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양 방법.
미세조류 배지에 부식산(humic acid)을 0.5 내지 2.0 g/ℓ의 농도로 첨가한 혼합 배지에서 배양하는 단계를 포함하되,
상기 미세조류는 보트리오코커스 브라우니(Botryococcus braunii) 또는 패오닥틸럼 트리코누툼(Phaeodactylum tricornutum)인 것을 특징으로 하는 미세조류 배양 방법.
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제 6항에 있어서, 상기 미세조류 배양 방법은 바이오매스 생산성, 지질 생산성 및 고부가 유효성분 생산성이 향상되는 것을 특징으로 하는 미세조류 배양 방법.
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