KR101844995B1 - 식물성장 조절제를 이용한 미세조류 바이오매스 생산방법 - Google Patents

식물성장 조절제를 이용한 미세조류 바이오매스 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인돌-3-아세트산(IAA) 및/또는 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH)를 이용한 미세조류의 대량 배양 방법에 관한 것이다. 본 발명의 미세조류 배양 배지 첨가 조성물 및 미세조류 바이오매스 생산 방법을 이용하는 경우, 미세조류의 생장 및 지방산 함량을 크게 증대시킬 수 있고, 그 활용 가능성을 크게 높일 수 있다.

Description

식물성장 조절제를 이용한 미세조류 바이오매스 생산방법{Methods for Preparation of Microalgae Biomass Using the Plant Growth Regulators}
본 발명은 식물성장 조절제를 이용한 미세조류의 대량 배양 방법에 관한 것이다.
최근 원유가격의 급격한 상승으로 생물자원을 활용한 대체 에너지 개발, 특히 바이오연료(바이오에탄올, 바이오디젤, 바이오가스 등)의 생산이 주목 받고 있다. 해수나 담수에 널리 분포하는 광합성 생물인 조류(Algae)로부터 생산되는 바이오연료는 곡물 및 폐목재 등을 사용하는 1, 2 세대 원료보다 단위 면적당 바이오디젤 생산량이 약 130배에 달한다. 따라서, 현재 조류 바이오매스의 대량생산을 위해 형질전환 기술을 이용한 미세조류의 분자적 개량, 무/유기 탄소원, 빛 조건 등을 이용한 최적화 기술이 적용되고 있다.
바이오매스를 이용한 바이오에너지 생산의 주요 쟁점은 비식용작물 이용 및 단위 재배 면적당 높은 생산기술에 있다. 차세대 바이오매스원인 미세조류는 지금까지 폐수(양돈폐수, 하수, 산업폐수 등)의 이용, 무기탄소원으로서 이산화탄소 적용 등 다양한 방법들을 이용한 경제적 바이오매스 생산 연구가 이루어져 왔지만, 바이오에너지 생산단가를 낮추기 위해서는 좀 더 혁신적인 기술이 요구된다.
종래 공개특허공보 제10-2011-0097968호에는 조류의 생물량의 최적 생성 조건 및 오일/지질 생성의 최적 조건이 상이한 점에 기반하여 각각의 유형의 생성을 분리적이고 독립적으로 최적화 시켜 오일, 지질 및 다른 유용한 생성물 전체 생성을 개선시키기 위한 공정 및 시스템을 제공하고 있다.
본 발명에서는 기존 일반 식물성장 호르몬(옥신, 시토키닌, 지베렐린 등)을 이용한 재배 촉진 기술을 미세조류 대량배양 방법으로 접목하고자 한다. 식물성장호르몬은 종류에 따라 빛감광, 세포분열 등의 생물대사에 관여한다. 아직까지 식물호르몬을 이용한 미세조류 배양연구는 단순한 성장테스트만 이루어졌을 뿐 바이오에너지와 관련된 심도 있는 연구가 이루어지지 않았다. 식물성장호르몬을 이용한 미세조류 바이오매스 생산은 제품가격대비 바이오매스 생산효율이 높아 유망한 기술로 판단되며, 그 방법이 용이하여 반응기 배양연구에 쉽게 접목될 수 있다.
본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.
본 발명자들은 미세조류의 생장을 촉진하고, 지방산 함량을 증대시켜 효과적으로 바이오매스를 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 미세조류를 인돌-3-아세트산(IAA) 및/또는 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH) 환경하에서 배양하여 우수한 품질의 바이오매스 생산을 촉진시킬 수 있음을 규명함으로써, 본 발명을 완성하게 되었다.
따라서, 본 발명의 목적은 효율적인 미세조류 바이오매스 생산 방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 바이오매스 생산용 미세조류(microalgae) 배양 배지 첨가 조성물을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음 단계를 포함하는 미세조류 바이오매스 생산 방법을 제공한다:
(a) 인돌-3-아세트산(IAA) 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH) 중 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 배지에 미세조류(microalgae)를 배양하는 단계; 및
(b) 단계 (a)로부터 생산된 미세조류 바이오매스를 회수하는 단계.
본 발명자들은 미세조류의 생장을 촉진하고, 지방산 함량을 증대시켜 효과적으로 바이오매스를 생산할 수 있는 방법을 개발하고자 예의 연구 노력하였다. 그 결과 미세조류를 인돌-3-아세트산(IAA) 및/또는 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH) 환경하에서 배양하여 우수한 품질의 바이오매스 생산을 촉진시킬 수 있음을 규명하였다.
본 명세서 상의 용어 "바이오매스"는 태양 에너지를 이용하여 유기물을 합성하는 식물과 이들을 식량으로 하는 동물, 미생물 등의 생물 유기체를 총칭하며, 더욱 구체적으로 화학적 에너지로 이용되는 생물을 의미한다. 생태학적 측면에서 생물 유기체에 속하는 모든 종 또는 동물과 식물들의 한 종을 서식지의 단위면적 또는 단위 부피 내에서 생체량으로 나타낸것을 의미하고, 생물현존량 또는 생물량이라고도 한다. 특히 "미세조류 바이오매스"는 상술한 바이오매스로 이용될 수 있는 미세조류를 의미한다.
본 발명은 인돌-3-아세트산(IAA) 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH) 중 선택되는 하나 이상을 포함하는 배지에 미세조류(microalgae)를 배양하는 단계 (a); 및 단계 (a)로부터 생산된 미세조류 바이오매스를 회수하는 단계 (b)로 이루어져 있는 바, 본 발명의 내용에 대하여 각 단계별로 더욱 구체적으로 설명하도록 한다.
(a) 인돌-3-아세트산(IAA) 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH) 중 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 배지에 미세조류(microalgae)를 배양하는 단계
본 명세서 상의 용어 "미세조류"는 광합성 색소를 가지고 광합성을 하는 단세포생물들에 대한 통칭으로, 화장품, 제약 산업 및 농식품업에서 이용될 수 있는 생물학적 활성을 갖는 화합물을 공급할 수 있는 잠재력을 가진 광범위한 군을 의미하며 대체 에너지원으로 사용될 수 있는 생물을 의미한다. 상기 미세조류는 특별히 이에 제한되지는 않으나, 본 발명의 인돌-3-아세트산(IAA) 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH) 중 선택되는 하나 이상에 의해 생장이 촉진될 수 있는 미세조류는 모두 포함될 수 있으며, 그 예로 녹조류, 규조류, 남조류, 홍조류, 착편모조류 또는 와편모조류가 있다. 본 발명의 미세조류는 바람직하게는 녹조류에 속하는 미세조류일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속, 또는 오우로코쿠스(Ourococcus) 속의 미세조류일 수 있고, 가장 바람직하게는 세네데스무스 오블리쿠스( Scenedesmus obliquus ), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 또는 오우로코쿠스 멀티스포루스( Ourococcus multisporus)일 수 있다. 녹조류는 색소체가 다량의 엽록소를 가지고 있어 녹색을 띠는 조류로서, 클로로필 a 및 b를 고등식물과 거의 같은 비율로 함유하고 있고, 그 밖에 고등식물과 같은 카로티노이드 색소를 가지는 조류 문의 하나이다. 녹조류에 속하는 미세조류로는 클로렐라(Chlorella) 속, 세네데스무스(Scenedesmus) 속, 두날리엘라(Dunaliella) 속, 클라미도모나스(Chlamydomonas) 속, 해마토코커스(Haematococcus) 속, 보트리오코쿠스(Botryococcus) 속 및 오우로코쿠스(Ourococcus) 속의 미세조류를 예로 들 수 있다. 클로렐라는 녹조류에 속하는 속으로서, 식물 중 가장 오래된 단세포 녹조식물 중 하나로 알려져 있다. 클로렐라는 광합성과 세포 분열이 우수하며 엽록소는 물론, 단백질, 비타민, 미네랄 등 영양소가 풍부하며, 체질 개선과 영양 보급에 도움을 주며 성장 발육에 효과가 있어, 모든 사람들이 안심하고 섭취할 수 있는 천연식품으로 알려져 있다. 또한, 다량의 지질성분을 함유하고 있어서 바이오 연료 연구의 주요 대상 물질로서 연구되고 있다. 클로렐라 속에 속하는 미세조류는 이에 제한되지 않으나, 클로렐라 소로키니아나(Chlorella sorokiniana), 클로렐라 미누티시마(Chlorella minutissima), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 바리아빌리스(Chlorella variabilis), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris), 클로렐라 프로토테고이데스(Chlorella protothecoides), 클로렐라 종(Chlorella sp.), 클로렐라 케스레리(Chlorella kessleri), 클로렐라 루테오비리디스(Chlorella luteoviridis), 클로렐라 스파에리카(Chlorella sphaerica), 클로렐라 피레노이도사(Chlorella pyrenoidosa), 클로렐라 살리나(Chlorella salina), 클로렐라 맥시마(Chlorella maxima) 또는 클로렐라 플라텐시스(Chlorella platensis)일 수 있으며, 바람직하게는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)일 수 있다. 세네데스무스는 녹조류에 속하는 한 속으로서, 담수산으로 습원의 물이 괸 곳이나 호수에서 떠다니며 생활하는 소형 녹조식물의 한 속이다. 세네데스무스는 군체의 세포수가 일정하며, 보통 양끝의 세포에서는 털 모양 돌기가 각각 2O개씩 나오며, 몸에 엽록체가 있어 광합성을 하는 특징이 있다. 세네데스무스 속에 속하는 미세조류 역시 이에 제한되지 않으나, 세네데스무스 디모푸스(Scenedesmus dimorphus), 세네데스무스 파리시엔시스(Scenedesmus parisiensis), 세네데스무스 종(Scenedesmus. sp.), 세네데스무스 브레비아쿠레아투스(Scenedesmus breviaculeatus), 세네데스무스 조바이스(Scenedesmus jovais), 세네데스무스 아르마투스(Scenedesmus armatus), 세네데스무스 프라티디스쿠스(Scenedesmus platydiscus), 세네데스무스 아쿠티포르미스(Scenedesmus acutiformis), 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 세네데스무스 서브스피카투스(Scenedesmus subspicatus), 세네데스무스 아르쿠아투스(Scenedesmus arcuatus), 세네데스무스 디스파르(Scenedesmus dispar), 세네데스무스 판노니쿠스(Scenedesmus pannonicus), 세네데스무스 바실리엔시스(Scenedesmus basiliensis), 세네데스무스 히스트릭스(Scenedesmus hystrix), 세네데스무스 쿠아드리카우다(Scenedesmus quadricauda)일 수 있으며, 바람직하게는 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus)일 수 있다. 보트리오코쿠스(Botryococcus)는 녹조류에 속하는 속의 하나이다. 보트리오코쿠스 속에 속하는 미세조류는 이에 제한되지 않으나, 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii), 보트리오코쿠스 칼카레우스(Botryococcus calcareus) 또는 보트리오코쿠스 프로투베란스(Botryococcus protuberans)일 수 있으며, 바람직하게는 보트리오코쿠스 브라우니(Botryococcus braunii)일 수 있다. 오우로코쿠스(Ourococcus)는 녹조류에 속하는 속의 하나이다. 오우로코쿠스 속에 속하는 미세조류는 이에 제한되지 않으나, 오우로코쿠스 멀티스포루스(Ourococcus multisporous), 또는 오우로코쿠스 비카우다투스(Outococcus bicaudatus)일 수 있으며, 바람직하게는 오우로코쿠스 멀티스포루스(Ourococcus multisporous)일 수 있다.
본 발명의 "인돌-3-아세트산(IAA)"은 식물계에 가장 널리 분포하며 극성 이동을 하는 확산형 옥신의 대표적인 예라 할 수 있는 천연 옥신이다. 고등식물에 대한 작용으로서 세포 신장의 촉진이 알려져 있다. 본 발명의 "디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH)"는 종래 식물 생장 조절제로 알려진 물질로서 미세조류에 대한 영향에 대해서는 알려진 바 없는 화학물질이다. 본 발명자들은 DAH의 미세조류에 대한 영향을 최초로 규명하였으며, 일정 농도 이상의 DAH를 이용하는 경우, DAH를 이용하지 않은 대조군에 비하여 오히려 미세조류의 생장이 감소한다는 결과를 도출하여 미세조류 생장 향상을 위한 최적의 DAH 농도 환경을 규명하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 인돌-3-아세트산 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트 중 선택되는 하나 이상의 화합물 농도는 10-8 M 내지 5×10-5 M이다. 본 발명자들은 IAA 및 DAH 중 선택되는 하나 이상의 화합물의 농도가 1×10-4 M 이상인 경우에는 오히려 미세조류의 생장을 감소시키는 결과를 확인하였다. 바람직하게 상기 화합물 농도는 10-8 M 내지 2×10-5 M이고, 더욱 바람직하게는 10-6 M 내지 2×10-5 M 이며, 더욱 더 바람직하게는 5×10-6 M 내지 2×10-5 M이다.
본 발명에서의 "배지"는 미세조류의 배양을 위한 적합한 환경을 제공하는 것으로서 종류 공지된 그 어떠한 배지를 이용하는 것도 가능하다. 구체적으로 예를 들어 담수 미세조류에 대하여는 1/2 CHEV Diatom 배지, 1/3 CHEV Diatom 배지, 1/5 CHEV Diatom 배지, 1:1 DYIII/PEA + Gr+ 배지, 2/3 CHEV Diatom 배지, 2X CHEV Diatom 배지, Ag Diatom 배지, Allen 배지, BG-11 배지, BG-11(-N) 배지, Bold 1NV 배지, Bold 3N 배지, Bold's Basal 배지, Botryococcus 배지, Bristol 배지, CHEV Diatom 배지, Chu's 배지, CR1 Diatom 배지, CR1+ Diatom 배지, CR1-S Diatom 배지, Cyanidium 배지, Cyanophycean 배지, Desmid 배지, DYIII 배지, Euglena 배지, HEPES 배지, J 배지, Malt 배지, MES-volvox 배지, Modified Bold 3N 배지, Modified COMBO 배지, Modified Desmidiacean 배지, N/20 배지, Ochromonas 배지, P49 배지, Polytomella 배지, Proteose 배지, Snow Algae 배지, Soil Extract 배지, Soil Extract + Sodium Metasilicate 배지, Soilwater: BAR 배지, Soilwater: GR- 배지, Soilwater: GR-/NH4 배지, Soilwater: GR+ 배지, Soilwater: GR+/NH4 배지, Soilwater: PEA 배지, Soilwater: Peat 배지, Soilwater: VT 배지, Spirulina 배지, Tap 배지, Trebouxia 배지, Volvocacean 배지, Volvocacean-3N 배지, Volvox 배지, Volvox-Dextrose 배지, Waris 배지, Waris+Soil Extract 배지, WC 배지를 이용할 수 있고, 해수 미세조류에 대하여는 1% F/2 배지, 1/2 Enriched Seawater 배지, 1/2 Erdschreiber Medium 배지, 1/2 Soil+Seawater Medium 배지, 1/3 Soil+Seawater Medium 배지, 1/4 ERD 배지, 1/4 Soil+Seawater 배지, 1/5 Soil+Seawater 배지, 2/3 Enriched Seawater 배지, 20% Allen + 80 % ERD 배지, 2X Erdschreiber's 배지, 2X Soil+Seawater 배지, 5% F/2 배지, 5/3 Soil+Seawater Agar 배지, A+ 배지, Artificial Seawater 배지, BG-11 + 1% NaCl 배지, BG-11-1 + .36% NaCl 배지, Bold 1NV:Erdshreiber (1:1) 배지, Bold 1NV:Erdshreiber (4:1) 배지, Bristol-NaCl 배지, Dasycladales Seawater 배지, Enriched Seawater 배지, Erdschreiber's 배지, ES/10 Enriched Seawater 배지, ES/2 Enriched Seawater 배지, ES/4 Enriched Seawater 배지, F/2 배지, F/2+NH4 배지, LDM 배지, Modified 2 X CHEV 배지, Modified 2 X CHEV + Soil 배지, Modified Artificial Seawater 배지, Modified CHEV 배지, Porphyridium 배지, Soil+Seawater 배지, SS Diatom 배지를 이용할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 각각의 배지의 구체적인 조성은 본 명세서 상의 일 실시예 또는 http://www.utex.org/media.aspx를 통해 확인할 수 있다. 본 발명의 특징은 미세조류 바이오매스 생산을 위해 식물 생장 조절제인 IAA 및/또는 DAH를 이용하는 데에 있는 바, 상술한 배지의 종류에는 제한이 없고, 미세조류에 대한 배양 환경을 제공하는 그 어떠한 배지에 대해서라도 IAA 및/또는 DAH를 추가로 포함시키고 이러한 배지에 미세조류를 배양함으로써, 미세조류의 생장 및 지방산 함량을 극대화 시킬 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 배지에 포함되는 화합물은 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH)이다. 특정의 일 실시예를 통해 본 발명자들은 DAH를 이용하는 경우, 무처리 대조군에 비하여 2.5 배의 생장 향상 효과를 보여, IAA가 1.9 배의 생장 향상 효과를 보이는 것에 비하여도 더 높은 생장 향상 효과를 보였다.
본 발명의 일 구체예에 있어서, 본 발명의 미세조류는 녹조류(Chlorophyta)이다.
본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 미세조류는 세네데스무스(Scenedesmus) 속, 클로렐라(Chlorella) 속 및 오우로코쿠스(Ourococcus) 속으로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 다른 일 구체예에 있어서, 본 발명의 미세조류는 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 및 오우로코쿠스 멀티스포루스(Ourococcus multisporus)로 구성된 군으로부터 선택된다.
본 발명의 단계 (a)에서의 배양은 종래 미세 조류의 배양에 적합한 환경 조건하에서의 배양이기만 하면 특별히 제한되지 않고, 이에 추가적으로 IAA 및/또는 DAH의 첨가 만으로도 미세조류의 생장 및 지방산 함량을 크게 증가시킬 수 있다. 구체적으로 예를 들면, 본 발명의 단계 (a)에서의 배양은 광생물 반응기 또는 플라스크 내에서 이루어질 수 있으며, 배양온도 25-29℃, 초기 pH 6-7, 광량 50-100 μmol/m2-sec 및 수중 에어레이션(aeration) 조건에서 배양할 수 있고, 추가적으로 LED(Light Emitting Diode)가 설치된 연속식 반응기에서도 배양할 수 있다.
(b) 단계 (a)로부터 생산된 미세조류 바이오매스를 회수하는 단계
본 발명의 바이오매스는 배양된 미세조류의 건조물 또는 건조물의 분해물이며, 구체적으로 미세조류의 건조물의 분쇄물의 형태로 회수될 수 있다. 더욱 구체적으로 미세조류를 동결건조시킨 그 자체 또는 이의 분쇄물의 형태인 바이오매스를 얻을 수 있다.
본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 인돌-3-아세트산(IAA) 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH) 중 선택되는 하나 이상의 화합물을 포함하는 바이오매스 생산용 미세조류(microalgae) 배양 배지 첨가 조성물을 제공한다.
본 명세서 상의 용어 "미세조류 배양 배지 첨가 조성물"은 상술한 미세조류 배양용 배지에 대하여 미세조류의 생장 및 지방산 함량을 향상시키기 위해 첨가 하기 위한 추가적인 조성물을 의미한다. 본 발명의 조성물은 IAA 및/또는 DAH를 포함하며, 이에 대해서는 본 발명의 다른 일 양태인 미세조류 바이오매스 생산 방법에 대한 상세한 설명을 통해 충분히 설명하였다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 본 발명의 인돌-3-아세트산 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트 중 선택되는 하나 이상의 화합물은 10-8 M 내지 5×10-5 M 농도로 배지에 첨가될 수 있고, 바람직하게는 5×10-6 M 내지 2×10-5 M 농도로 배지에 첨가된다.
본 발명인 조성물은 상술한 미세조류 바이오매스 생산 방법의 단계 (a)에서 사용될 수 있고, 중복되는 내용에 대하여는 본 명세서 기재의 과도한 복잡성을 피하기 위해 생략하도록 한다.
본 발명의 특징 및 이점을 요약하면 다음과 같다:
(a) 본 발명은 효율적인 미세조류 바이오매스 생산 방법을 제공한다.
(b) 본 발명은 바이오매스 생산용 미세조류(microalgae) 배양 배지 첨가 조성물을 제공한다.
(c) 본 발명의 미세조류 배양 배지 첨가 조성물 및 미세조류 바이오매스 생산 방법을 이용하는 경우, 미세조류의 생장 및 지방산 함량을 크게 증대시킬 수 있고, 그 활용 가능성을 크게 높일 수 있다.
도 1은 IAA 및 DAH의 구조식 및 IAA 또는 DAH를 이용하여 미세조류를 배양한 경우의 미세조류의 향상된 생장 결과에 대한 사진을 나타낸다.
도 2는 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus)에 대한 IAA(도 2의 (A)) 및 DAH(도 2의 (B))의 영향을 나타낸다.
도 3은 IAA 또는 DAH의 농도에 따른 지방산 조성의 변화를 나타낸다. SFA는 포화 지방산, MUFA는 단일불포화 지방산, PUFA는 폴리불포화 지방산을 나타낸다.
도 4는 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris)에 대한 IAA(도 4의 (A)) 및 DAH(도 4의 (B))의 영향을 나타낸다.
도 5는 오우로코쿠스 멀티스포루스(Ourococcus multisporus)에 대한 IAA(도 5의 (A)) 및 DAH(도 5의 (B))의 영향을 나타낸다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.
실시예
실시예 1: 화학 물질(chemicals)
본 발명에서 이용된 모든 화학 물질은 분석 등급(analytical grade)이었다. 인돌-3-아세트산(IAA) 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH)(순도>99.9%)를 Sigma-Aldrich 사 및 Henan Sun Biotechnology Co.Ltd로부터 각각 구입하였다. 다른 화학 물질들은 덕산 사로부터 얻었다.
실시예 2: 조류 균주, 배양 조건, 접종원(inoculum) 제조 및 파이토호르몬(phytohormone) 스톡 제조
미세조류 Scenedesmus obliquus GU732418의 짧은 배가시간(doubling time) 및 높은 바이오매스 생산성, 폐수(예를 들어 산업폐수, 양돈장폐수 및 농축 폐수) 독성에 대한 저항성, 넓은 범위의 최적 생장 온도(14℃-30℃) 및 18.8% 및 48% 사이의 건조 세포 중량(dry cell weight, DCW)(McGinn et al., 2012)에 걸친 지질 함량을 고려하여 본 발명에서 이용하였다. s. obliquus는 바이오디젤 생산을 위한 최적의 후보 중 하나로 여겨져왔다(Gouveia and Oliveira, 2009). 10% 농도의 접종부피(Vinoculum/Vmedia)를 100 mL의 BBM(Bold's Basal Medium)을 함유하는 250 mL의 에를렌마이어(erlenmeyer) 플라스크에 첨가시켰다. 미세조류 세포들을 진탕 배양기(shaking incubator)에서, 2주 동안 45-50 μmol photon m2/s인 백색 형광의 지속 조명 하에서 150 rpm 및 27℃ 조건에서 배양시켰다. 현탁액을 분광광도계(Hach DR/4000, Loveland)를 이용하여 측정된 680 nm의 광학 밀도(OD)에서 1.0 흡광(absorbance)으로 조정하였고, 접종원으로 이용하였다. IAA 및 DAH의 스톡 용액을 증류수를 이용하여 10-3, 10-4, 10-5 및 10-6 M로 제조하였고, 각각의 스톡 용액 1.0 mL를 100 mL의 BBM 배지에 첨가시켜 10-4, 10-5, 10-6, 10-7 및 10-8 M 농도를 얻어 실험에 이용하였다.
실시예 3: 세포 생장의 측정
각각의 250 mL 에를렌마이어 플라스크 내의 0 M-10-5 M의 IAA 및 DAH를 포함하는 100 mL BBM을 1mL의 현탁 배양액(OD680=1.0)으로 접종하였고, 27℃, 150 rpm 조건으로 45-50 μmol photon m2/s 강도의 백색 형광 하에서 6일 동안 진탕 배양기(shaker incubator)로 배양시켰다.
OD680 농도에서의 변화에 따라 생장을 관찰하였다. OD680 값들은, 다중 데이터 분석 후 얻어 하기 계산식 1에 의해 계산된 OD680 및 세포 수(세포/mL) 사이의 선형 관계에 기초하여 세포 수(세포/mL)로 전환시켰다:
[계산식 1]
세포 수(세포/mL)=12.813×OD680-0.0782 (R2=0.989)
하기 계산식 2(Jiang et al., 2011)에 나타낸 지수 함수에 대해 세포 수를 대입함으로써 구체적인 생장률(μ)를 계산하였다:
[계산식 2]
μ=(ln N 2 -ln N 1 )/(t2-t1)
상기 N 1 및 N 2 는 각각 시간 t 1 및 t 2 에서의 mL 당 세포 수로 정의된다.
실시예 4: 지방산 분석
종래 알려진 방법(Lepage and Roy, 1984)을 변형시켜 이용하여 지방산을 분석하였다. 클로로포름 및 메탄올의 혼합물(2:1, v/v) 2.0 mL를 새로이 준비하였고, 10 mg의 동결-건조 바이오매스를 완전히 용해시키는데 이용하였다. 추가적으로 내부 표준 및 메틸기전이 시약을 함유하는 클로로포름 1.0 mL를 첨가시켰다. 10 mL 파이렉스 튜브로 함유물들을 이동시켰고, 100℃에서 10분간 배양시켰으며, 1.0 mL 탈이온수를 첨가함으로써 두 상으로 분리시켰다. 격렬하게 10분간 혼합시켜 4000 rpm에서 10분간 원심분리시킨 후, 클로로포름 층을 피하 일회용 폴리프로필렌 주사기를 이용하여 튜브의 바닥으로부터 다른 튜브로 이동시켰고, 0.2 μm PVDF(polyvinylidene fluoride) 주사기 마이크로필터를 이용하여 충분히 필터링시켰다. 필터링한 용액 내의 지방산 메틸 에스터(Fatty acid methyl esters, FAMEs)를 FID(flame ionization detector) 및 HPINNO 왁스 모세관 컬럼을 갖춘 애질런트(Agilent) 6890 가스 크로마토그래피(Agilent Technologies 사)를 이용하여 정량하였다. 각각의 실험을 2회씩 수행하였고, 평균 값을 계산하였다.
실시예 5: 다양한 미세조류에의 적용
Chlorella vulgaris 및 Ourococcus multisporus를 포함하는 다른 미세조류 종들에 대한 DAH 및 IAA의 효과를 10-4 내지 10-8 M 농도에서 실험하였다. 세포 생장과 관련하여 실시예 3의 방법에 따라 실험을 진행하였다.
실험 결과
1. 미세조류 생장 상의 IAA 및 DAH의 효과
6일간 BBM 상에서 배양된(IAA 및 DAH 10-5 M의 부존재 또는 존재하에서) 배양물의 이미지는 세포 브로스의 고유의 색 변화를 보였고, 이는 IAA 또는 DAH의 영향 하에서 강화된 미세조류 생장을 나타낸다(참조: 도 1). S. obliquus 생장 상의 IAA 또는 DAH의 농도별(10-8 M-10-4 M) 효과를 도 2에 나타내었다. 도 1의 (A)는 IAA의 처리에 대한 결과를 나타내고, 도 1의 (B)는 DAH 처리에 대한 결과를 나타낸다. 미세조류 생장은 10-8 M에서부터 10-5 M까지 IAA 또는 DAH 농도의 증가에 따라 증가하는 경향을 보였으나, 10-4 M에서는 미세조류의 생장이 대조군에 비해 오히려 감소하는 것이 관찰되었다. 미세조류의 생장에 대한 IAA 및 DAH의 영향은 통계적으로 유의하였다(P<0.0001). 실험 마지막(6일째)에 10-5 M IAA는 17.7×106 세포/mL의 최대 생장을 뒷받침하였고, 이는 대조구(9.5×106 세포/mL)에 비하여 1.9 배로 생장을 향상시켰다(참조: 도 2의 (A)). DAH는 최근 식물 생장 및 재생산을 강화시키는 새로운 파이토호르몬으로 보고되었으나(Jiang et al., 2012; Chen et al., 2013), 미세조류의 생장에 대한 효과는 알려진바 없었다. 10-5 M 농도의 DAH는 23.5×106 세포/mL로서 대조군과 비교하여 2.5 배 더 높은 생장을 보였다(참조: 도 2의 (B)). Duncan's multiple range test(P<0.05)는 10-5 M의 IAA 및 DAH 하에서 미세조류 생장이 대조구에 비하여 통계적으로 유의하게 증가되었음을 보였다.
2. 지방산 함량에 대한 IAA 및 DAH의 영향
지방산은 미세조류 지질의 주요한 성분이고, 이의 조성 및 생산성이 바이오디젤 생산에 대한 잠재적인 척도로서 이용되어 왔다(Huerlimann et al., 2010).
IAA 및 DAH 호르몬을 이용하여 배양한 S. obliquus의 바이오연료로서의 가능성을 알아보기 위하여 식물성장호르몬의 종류 및 농도에 따른 미세조류의 지방산 함량 및 구성 성분의 변화를 분석하였다. 연구결과, IAA 및 DAH 두 호르몬을 이용한 경우 모두 10-5 M 조건에서 최대(100 mg/g-DCW) 지방산 함량이 나타났다. 지방산 조성의 경우, 식물성장호르몬이 증가할수록 포화지방산(C10:0, C14:0, C16:0, C18:0 및 C20:0)이 감소하였으며, 불포화지방산(C16:1, C18:1n9c, C18:2n6c, C18:3n6 및 C18:3n3)이 증가하였다. 좀더 상세히, IAA 및 DAH 두 호르몬 내 10-5 M 조건에서 불포화 지방산이 각각 7% 및 12% 증가하였다. 불포화지방산은 상온에서 유동성을 가짐으로서 바이오디젤로 전환 시 저온유동성이 높아 겨울철에도 사용이 가능한 장점이 있다(참조: 표 1 및 도 3).
FAME 생산
(mg/g DCW)
 대조군
 IAA (M)
 DAH (M)
10-8 10-7 10-6 10-5 10-8 10-7 10-6 10-5
카프르산
(C10:0)		 0.00 0.30 0.00 0.00 0.00 0.00 0.33 0.52 0.51
미리스트산 (C14:0) 0.35 0.32 0.34 0.34 1.70 0.31 0.35 0.33 0.31
팔미트산 (C16:0) 16.02 14.34 14.51 14.17 13.90 15.32 15.46 14.97 13.03
팔미톨레산
(C16:1)		 0.65 0.66 0.64 0.67 0.00 0.71 0.70 0.72 1.05
스테아르산 (C18:0) 0.51 0.46 0.41 0.57 0.81 0.43 0.41 0.48 0.56
올레산
(C18:1n9c)		 7.77 6.85 0.00 7.04 5.90 7.30 7.41 6.90 7.62
리놀레산 (C18:2n6c) 10.05 10.19 11.14 10.64 11.96 13.85 13.25 10.62 18.65
g-리놀렌산 (C18:3n6) 0.85 1.05 1.16 1.01 1.06 1.12 1.09 0.92 1.12
a-리놀렌산 (C18:3n3) 7.62 9.43 12.43 10.75 17.49 12.20 11.91 9.12 14.56
아라키딘산 (C20:0) 1.13 1.27 0.99 0.85 1.33 1.24 0.78 2.22 2.01
기타 34.55 30.37 41.41 34.07 45.83 38.74 37.99 31.28 38.49
3. 다양한 미세조류에 대한 적용 효과
S. obliquus외의 다른 미세조류 종에 본 발명의 방법이 적용 가능한지 확인을 위해 Chlorella vulgaris 및 Ourococcus multisporus의 생장에 대한 DAH 및 IAA의 농도별 영향을 실험하였다. DAH 및 IAA 모두 10-4 M 농도에서 Chlorella vulgaris 및 Ourococcus multisporus 모두의 생장이 억제되었고, 대조구 값 이하로 감소되었다. 10-5 M의 DAH 및 IAA가 최적의 농도로 관찰되었고, DAH 및 IAA는 각각 대조구에 비하여 Chlorella vulgaris의 생장을 1.8배 및 1.5배 향상시켰고, Ourococcus multisporus의 생장을 1.9배 및 1.6배 향상시켰다(참조: 도 4 및 도 5).
이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

Claims (9)

  1. 다음 단계를 포함하는 미세조류 바이오매스 생산 방법:
    (a) 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH); 또는 인돌-3-아세트산(IAA) 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH)를 포함하는 배지에 미세조류(microalgae)를 배양하는 단계; 및
    (b) 단계 (a)로부터 생산된 미세조류 바이오매스를 회수하는 단계.
  2. 제 1 항에 있어서, 상기 인돌-3-아세트산 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트 중 선택되는 하나 이상의 화합물의 농도는 10-8 M 내지 5×10-5 M인 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 2 항에 있어서, 상기 농도는 5×10-6 M 내지 2×10-5 M 인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 제 1 항에 있어서, 상기 미세조류는 녹조류(Chlorophyta)인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1 항에 있어서, 상기 미세조류는 세네데스무스(Scenedesmus) 속, 클로렐라(Chlorella) 속 및 오우로코쿠스(Ourococcus) 속으로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1 항에 있어서, 상기 미세조류는 세네데스무스 오블리쿠스(Scenedesmus obliquus), 클로렐라 불가리스(Chlorella vulgaris) 및 오우로코쿠스 멀티스포루스(Ourococcus multisporus)로 구성된 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH); 또는 인돌-3-아세트산(IAA) 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트(DAH)를 포함하는 바이오매스 생산용 미세조류(microalgae) 배양 배지 첨가 조성물.
  9. 제 8 항에 있어서, 상기 인돌-3-아세트산 및 디에틸 아미노에틸 헥사노에이트 중 선택되는 하나 이상의 화합물은 5×10-6 M 내지 2×10-5 M 농도로 배지에 첨가되는 것을 특징으로 하는 조성물.
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