KR102647564B1 - 루테인 및 올레산을 생산하는 신규한 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 aqys21 미세조류와 이의 배양방법 - Google Patents

루테인 및 올레산을 생산하는 신규한 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 aqys21 미세조류와 이의 배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류와 이의 배양방법에 관한 것으로, 루테인과 올레산을 생산하는 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 미세조류를 제공하고 가장 최적화된 배양조건을 이용해 루테인과 올레산을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하며 건강기능식품 조성물, 의약품, 바이오연료, 사료, 화장품 및 의약품 원료로서의 가능성을 제공할 수 있다.

Description

루테인 및 올레산을 생산하는 신규한 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류와 이의 배양방법{Lutein and oleic acid-producing novel microalgae of Asterarcys quadricellulare AQYS21 and its culturing method}
본 발명은 루테인 및 올레산을 생산하는 신규한 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류와 이의 배양방법을 제공한다.
카로티노이드는 노란색, 주황색, 빨간색에 이르는 부가가치가 높은 유기색소로서 항산화, 항염증, 항비만의 높은 효능을 가진 생리활성물질이다. 카로티노이드는 음식, 사료, 건강기능식품과 화장품 산업의 첨가물로 활용되고 있다. 카로티노이드는 화학 합성에 의해 생산이 가능하나, 인공 첨가제 사용 제한의 규제가 심화됨에 따라 그 중요성이 점차 증대되고 있으며, 이 중 루테인은 크산토필 계열의 카로티노이드로서 안구보호, 높은 항산화 및 항염증 활성을 가지므로 의료 분야에서 주목할 만한 유용성분으로 여겨지고 있다. 현재 루테인의 유일한 상업적 공급원으로는 금잔화(Marigold flower) 꽃잎이 활용되고 있으나, 육상식물의 경우 넓은 경작지를 필요로 하며 낮은 수율과 계절의 변화 등 다양한 제한점을 나타내므로 대체 가능한 고효율 천연자원을 개발하는 것이 필요한 실정이다. 따라서 금잔화 꽃잎보다 단위 면적당 생산성이 높고, 계절의 영향 없이 연중 생산이 가능한 미세조류 바이오매스가 경제적인 루테인 생산을 위한 유망 소재로 떠오르고 있다.
올레산(oleic acid, C18:1)은 1 개의 이중 결합을 포함하는 단일불포화지방산(Mono-unsaturated fatty acid)으로 오메가-9 지방산으로도 불리며 다양한 건강 효과를 갖는 것으로 알려져 있다. 올리브 오일의 주성분으로도 알려진 올레산은 강력한 항산화 작용을 나타내어 세포 손상을 예방하고 면역력을 향상시킬 뿐 아니라, 혈압 강하 및 혈액순환 개선 등에 좋은 효능을 나타내어 인체의 심장 건강을 보호하는 기능을 갖는 것으로 알려져 있다. 뿐만 아니라 올레산은 나쁜 콜레스테롤(LDL)을 낮추고 좋은 콜레스테롤(HDL)을 높이는 효과가 있으며, 이를 통해 동맥경화를 예방하고, 혈관과 심장 건강을 유지하는 데 도움이 줄 수 있다. 그 밖에도 올레산은 면역력 강화, 감염예방, 기억력 강화, 관절염 예방, 갱년기 증상 완화, 소화기능 개선, 피부 개선 및 항비만 효능 등 상당히 다양한 효능을 나타내는 것으로 알려져 있다. 또한 올레산(Oleic acid, C18:1)은 고품질의 바이오디젤을 생산할 수 있는 주성분으로 바이오디젤의 산화 안정성과 세탄가(cetane number) 등에 영향을 줄 수 있다.
미세조류는 현미경적 크기의 광합성을 하는 작은 생물로 정의되며, 인간과 동물에 유익한 카로티노이드 및 지방산과 같은 고부가 영양 성분과 생리활성물질을 다량 포함하고 있어, 지구 생태계의 주요 영양 공급원으로 1차생산자 역할을 담당한다. 이러한 미세조류는 육상식물에 비해 광합성 효율이 매우 높아 생장이 빠르고 공간 제약이 덜하므로 대량 재배를 하더라도 지속가능성이 높다는 장점이 있다.
따라서, 성장이 빠르고 산업적으로 유용한 물질을 생산할 수 있는 다양한 미세조류를 신규로 발굴하여 이를 바이오에너지, 건강기능식품, 양식생물의 먹이사료, 친환경생육촉진제 등으로 활용하기 위한 노력이 필요한 실정이다.
1. 대한민국 등록특허 제10-1548207호 (2015.01.09 공개)
본 발명의 목적은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 (1) KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)를 배양배지에 접종하는 단계; 및 (2) 상기 배양배지에 접종한 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)를 빛이 있는 광조건하 25℃ 내지 32℃에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 광조건은 광도 190 내지 195μmol·m-2·s-1의 빛을 처리하는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21) 배양방법을 제공하는 데에 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21), 이의 배양체, 배양체 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 카로티노이드 또는 지방산 생산 증진용 조성물을 제공하는 데에 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)을 제공한다.
또한, 본 발명은 (1) KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)를 배양배지에 접종하는 단계; 및 (2) 상기 배양배지에 접종한 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)를 빛이 있는 광조건하 25℃ 내지 32℃에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 광조건은 광도 190 내지 195μmol·m-2·s-1의 빛을 처리하는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21) 배양방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21), 이의 배양체, 배양체 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 카로티노이드 또는 지방산 생산 증진용 조성물을 제공한다.
본 발명은 신규한 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류와 이의 배양방법에 관한 것으로, 루테인과 올레산을 생산하는 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 미세조류를 제공하고 가장 최적화된 배양조건을 이용해 루테인과 올레산을 효율적으로 생산하는 방법을 제공하며 건강기능식품 조성물, 사료, 화장품 첨가제로서 가능성을 제시할 수 있다.
도 1은 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21를 채집한 지역의 좌표를 나타낸 결과이다.
도 2는 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21의 집락(colony)를 형성시켜 순수분리를 진행하고, 이를 액체배지로 배양한 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21의 형태를 광학현미경과 주사전자현미경 및 투과전자현미경으로 확인한 결과이다.
도 4는 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21의 TufA 유전자부위의 유전학적 계통수를 분석한 결과이다.
도 5는 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21를 다양한 농업용 관주비료에 배양하여 일일성장 분석을 통해 스크리닝 한 결과와 스크리닝을 통해 선별된 관주비료를 농도별로 처리한 후 7일간 광배양 했을 때 나타난 미세조류의 성장변화 결과이다.
도 6은 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21의 최적배양 온도와 광도 조건을 확인한 결과이다.
도 7은 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21의 광합성 색소를 고성능액체크로마토그래피(HPLC-DAD)로 분석하여 확인한 크로마토그램 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21의 주요 생산 색소가 루테인임을 DAD 스펙트럼으로 확인한 결과이다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
본 발명은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)을 제공한다.
상기 미세조류는 네오잔틴(neoxanthin), 비올라잔틴(violaxanthin), 안테라잔틴(antheraxanthin), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeazanthin), 클로로필-a(chlorophyll-a), 클로로필-b(chlorophyll-b), α-카로틴(α-carotene) 및 β-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 생산할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 미세조류는 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linoleic acid) 및 알파-리놀렌산(alpha-linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 생산할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한 본 발명은 (1) KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)를 배양배지에 접종하는 단계; 및 (2) 상기 배양배지에 접종한 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)를 빛이 있는 광조건하 25℃ 내지 32℃에서 배양하는 단계를 포함하며, 상기 광조건은 광도 190 내지 195μmol·m-2·s-1의 빛을 처리하는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21) 배양방법을 제공한다.
상기 (1) 단계의 배양배지는 농업용 비료를 포함할 수 있다.
상기 농업용 비료는 질소(N), 인(P) 및 칼륨(K)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양방법은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)의 네오잔틴(neoxanthin), 비올라잔틴(violaxanthin), 안테라잔틴(antheraxanthin), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeazanthin), 클로로필-a(chlorophyll-a), 클로로필-b(chlorophyll-b), α-카로틴(α-carotene) 및 β-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생산을 증가시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
상기 배양방법은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)의 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linoleic acid) 및 알파-리놀렌산(alpha-linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생산을 증가시킬 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21), 이의 배양체, 배양체 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 카로티노이드 또는 지방산 생산 증진용 조성물을 제공하며, 상기 카로티노이드는 네오잔틴(neoxanthin), 비올라잔틴(violaxanthin), 안테라잔틴(antheraxanthin), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeazanthin), 클로로필-a(chlorophyll-a), 클로로필-b(chlorophyll-b), α-카로틴(α-carotene) 및 β-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니고, 상기 지방산은 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linoleic acid) 및 알파-리놀렌산(alpha-linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예 등을 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예 등은 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예 등에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예 등은 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.
<실시 예 1> 미세조류의 채집
미세조류는 도 1과 같이, 지도에서 보이는 전라남도 여수시 만성리 해변 근처의 기수지역(좌표: 34°46'27.1"N 127°44'43"E)에서 분리하였으며, 채집당시 염분은 15.3psu, 수온은 23.2℃를 유지하고 있었다.
<실시 예 2> 미세조류의 동정
삭제
삭제
1. 배양
미세조류의 분리는 1.5% 한천을 포함하는 BG-11 배지로 고체 한천배지를 만들고, 확보한 해수 100μL를 한천배지 위에 도말하여 형성된 집락(colony)을 3반복으로 도말하여 무균상태로 분리를 하였으며, 깨끗하게 형성된 집락을 BG-11 액체 배지로 옮긴 후 배양체를 유지하였다. 도 2와 같이, 미세조류는 도말법을 이용하여 단일콜로니(Single colony)로 분리하였고 (도 2A), 배양액에 박테리아에 의한 오염이 있는지 확인하기 위해, 박테리아 배양배지(LB)에 100μL의 미세조류 배양액을 도말하여 48시간 배양 결과, 박테리아가 검출되지 않았으며 (도 2B), 이를 통해 순수분리가 된 것을 확인하였다. 또한 BG-11 액체 배지로 옮겨 배양한 결과, 초록색으로 성장이 잘 일어나는 것을 확인하였다 (도 2C, 2D).
2. 형태학적 동정
분리한 미세조류는 도 3과 같은 형태학적 특징을 나타내었다. 도 3에 따르면, 광학현미경으로 미세조류를 관찰했을 때 원형 또는 타원형의 모양을 나타냈고, 세포마다 1개의 피레노이드를 가지고 있었으며, 1개의 세포내에서 4~8개의 자가포자(autospore)가 관찰되었다. 또한 크기는 약 9~18 μm의 다양한 크기를 나타냈다. 주사전자현미경(SEM, scanning electron microscope)으로 미세조류를 관찰하였을 때, 세포 표면에 자오선을 나타냈으며, 투과전자현미경(TEM, transmission electron microscope)으로 관찰하였을 때, 1개의 피레노이드(P, pyrenoid)를 전분(S, starch)이 감싸고 있었으며, Parietal cup 모양의 엽록체를 갖고 있어 전형적인 아스테라시스 쿼드리셀룰라레의 형태적 특징을 가짐을 확인하였다.
3. 유전학적 동정
먼저, 분리한 미세조류의 18S rRNA 부위의 염기서열 분석 결과, 서열목록 1의 염기서열과 같은 결과가 나왔다. 분석된 염기서열을 BLAST 검색을 이용하여 염기서열의 유사도를 기존 DB와 비교한 하기 표 1과 같이 아스테라시스 쿼드리셀룰라레(Asterarcys quadricellulare) 및 코엘라스트렐라 테누이테카(Coelastrella tenuitheca), 세네데스무스(Scenedesmus), 클로렐라(Chlorella) 등과 100% identity가 일치하는 결과가 나타났다. 따라서 정확한 유전학적인 구분을 위해 유전자 부위인 TufA의 DNA 염기서열 분석을 추가적으로 진행하였다.
번호 종 최대 점수 총 점수 Query cover
(%)		 Identity
(%)		 Accession
1 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 FACHB-2316 1764 3062 99 100 MH176109
2 코엘라스트렐라 테누이테카 FACHB-2314 1764 3062 99 100 MH176108
3 코엘라스트렐라 테누이테카 FACHB-2313 1764 3062 99 100 MH176107
4 코엘라스트렐라 테누이테카FACHB-2315 1764 3062 99 100 MH176106
5 세네데스무스 sp. SM15-1 1764 3028 99 100 KX495092
6 아스터라르시스 sp. SA-1702 1764 2984 99 100 MF595080
7 클로렐라 sp. QUCCCM62 1764 2493 81 100 KM985412
8 클로렐라a sp. QUCCCM36 1764 2484 81 100 KM985403
9 클로렐라 sp. LCF3 1764 3062 99 100 QM985944
10 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 R-56 1764 2493 80 100 QM427507
TufA 부위의 염기서열 분석 결과는 서열목록 2의 염기서열과 같은 결과가 나왔으며, BLAST 분석 결과 하기 표 2과 같이 아스테라시스 쿼드리셀룰라레와 가장 유사한 identity(99.77%)를 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었다.
번호 종 최대점수 총 점수 Query cover
(%)		 Identity
(%)		 Accession
1 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 1629 1629 91 99.77 KT429436
2 아스터라르시스 sp. GA4 1567 1567 89 99.42 MW363973
3 코엘라스트렐라 사이파넨시스 1543 1543 100 99.45 NC042181
4 코엘라스트렐라 sp. FACHB-3315 1474 1474 96 95.1 MW729747
5 아스터라르시스 sp. GP-2019 1465 1465 100 94 MK995333
6 코엘라스트렐라 sp. FACHB-3314 1434 1434 94 95.07 MW729746
7 세네데스무스 바쿠올라투스 SAG 211-8b 1430 1430 84 95.05 HG514403
8 코엘라스트렐라 테모필라 FACHB-2298 1424 1424 93 95.22 MH176136
9 코엘라스트렐라 테모필라 var. globulina FACHB2310 1419 1419 93 95.11 MH176154
10 코엘라스트렐라 테모필라 FACHB2306 1419 1419 93 95.11 MH176144
이후 TufA 부위의 시퀀스를 이용하여 계통수를 분석을 진행하였고, 분석한 염기서열을 토대로 근연종들과의 TufA 부위의 유전학적 계통수(Phylogenetic tree)를 위와 같이 분석하였다. 계통수 분석을 위해 Geneious Prime v.2022.2.2 (Biomatters Ltd., Auckland, New Zealand) 프로그램을 이용하여 서열정렬을 진행하였고, 정렬된 각 유전자 부위에서 활용 가능한 최적의 유전자 부위를 결정하기 위해 Bayesian analysis를 MrBayes v.3.2.7로 default GTR +G + I model을 통해 진행하였으며, ML(Maximum-likelihood) 분석을 RAxML v.8.2.10로, Boot-strap value는 1,000 replicates로 진행하였다.
그 결과, 도 4에 따르면, 계통수 분석결과 미세조류 아스테라시스 쿼드리셀룰라레와 높은 유전학적 유사성을 갖는 것을 확인할 수 있었으며, 코엘라스트렐라 속과는 TufA 유전자 부위에서 확연히 유전학적으로 구별되는 것을 확인할 수 있었다. 따라서 형태학적인 특징과 유전계통학적 분석 결과를 토대로 본 미세조류를 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21로 명명하였다.
<실시 예 3> 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 최적의 배양조건 확인
1. 관주비료
미세조류 배양배지인 BG-11은 가격이 높아 대량배양에 활용하기가 용이하지 않으므로, 추후 미세조류의 대량배양 가능성을 고려하여 시중에 판매되고 있는 4가지 종류의 물에 녹는 농업용 관주비료에서 미세조류를 배양하여 성장을 기존 미세조류용 BG-11배지와 비교하였다. 분리된 미세조류 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21를 미세조류 배양배지(BG-11)와 1g/L로 농도를 조절한 4가지의 물에 녹는 농업용 비료(SF1: Agrosol (Agrobiz Co., 대한민국), SF2: Nutrivit (Nutrivival Products Nederland® 네덜란드), SF3: high-N S-feed (팜한농, 대한민국), SF4: Smarto, Beluckey Agricultural Chemical, 중국)를 증류수에 녹인 용액에 각각 배양하여 16일간 일일 성장을 측정하였다. 일일 성장은 먼저 혈구계수기(Haemocytometer)로 세포의 농도(cell concentration)를 측정하고, Microplate reader(BioTeK, USA)를 이용하여 미세조류 배양액의 흡광도(absorbance)를 600nm의 파장에서 분석하여 함께 검량선을 만들어 회귀분석을 통해 상관 방정식을 구하였으며, 상관 방정식에 실험군에서 획득한 흡광도 값을 대입하여 세포 농도를 구하였다.
그 결과, 도 5에 따르면, BG-11 배지보다 SF-1과 SF-2 배지에서 높은 성장을 나타낸다는 사실을 확인할 수 있었고, SF-2 배지(high-N S-feed (FarmHannong, South Korea)에서 가장 높은 성장을 보이는 것을 확인하였다. 따라서 선별된 SF-2관주비료를 농도별로 처리하여 성장을 확인한 결과 관주비료는 1g/L 보다 높은 농도인 2g/L이상에서 녹일 경우 침전물이 발생하는 것을 확인하였으며, 실험을 통해 확보된 정보를 바탕으로 0~1g/L의 범위로 농도를 조절하여 7일간 배양하고 미세조류 배양액의 흡광도 값을 600nm의 파장에서 측정한 결과 0.5 g/L에서 가장 높은 성장을 나타내는 것을 확인할 수 있었다.
2. 온도 및 광도
아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류의 최적배양조건을 확인하기 위해 PhotoBiobox(신화사이언스, 대한민국) 장비를 이용해서 최적온도와 최적광도 조건을 확인하였다. 실험방법은 96-웰 플레이트에 S-Feed 1g/L 배지를 이용하여 키운 미세조류 배양액을 106 cells/mL로 각각 분주하여 PhotoBioBox 장비에서 다양한 광도(0~100 μE)와 다양한 온도조건(5~40℃)을 설정하여 3일간 배양을 진행하였다. 이후 600 nm 파장에서 Synergy II microplate reader(BioTek, USA)를 이용하여 흡광도를 분석하였으며, 측정한 흡광도를 바탕으로 성장률을 구하여 히트 맵 데이터를 만들었다.
그 결과, 도 6에 따르면, 성장률 스크리닝을 진행한 결과 최적 온도조건은 27.2~30.4℃, 최적 광조건은 193 μmol/m2/s(백색 LED활용)인 것을 확인하였다.
즉, 최적 배양조건은 27℃, 193 μmol/m2/s인 것을 확인할 수 있었다.
<실시 예 4> 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21의 광합성 색소 합성 확인
설정된 최적 광배양 조건에서 미세조류 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21를 2주간 배양하여, 수확한 뒤 광합성 색소를 분석하였다.
광합성 색소는 HPLC-DAD(Agilent 1260, Germany)를 이용하여 분석하였으며, 용매A 및 용매B 두개를 이용하여 Gradient 조건으로 분석하였다. 용매 A의 경우 0.1 M의 Tris와 아세토나이트릴, 메탄올을 14:82:2로 섞은 용액을 제조하였으며, 용매 B의 경우 메탄올과 에틸 아세테이트를 68:32로 섞어 제조하였다. 이후 용매를 1시간 동안 음파 처리하여 녹아있는 기포를 제거해 주었으며, 컬럼은 Waters Spherisorb ®5.0μm ODS2(4.6 mm x 250 mm) 컬럼을 사용하여 40℃의 온도에서, 카로티노이드의 경우 445nm 및 클로로필의 경우 670nm 파장에서 각각 분석을 진행하였다. 유량은 1.2 mL/min으로 설정하였고 10 μL로 주입하여 25분간 분석을 진행하였다. Gradient 조건은 다음과 같았다. 0분: 용매 A 100%, 15분: 용매 B 100%, 18분: 용매 B 100%, 19분: 용매 A 100%, 25분: 용매 A 100%. 크로마토그램을 통해 확인된 광합성색소가 무엇인지 정성적인 확인을 위해 DHI사에서 액상형태로 나온 카로티노이드 표준 용액(DHI, USA)를 활용하여 분석된 피크의 머무름시간(Retention time)을 비교하여 어떠한 색소인지 정성적으로 분석하였다.
그 결과. 도 7에 따르면, 크로마토그램에 나타낸 것처럼 네오잔틴(neoxanthin), 비올라잔틴(violaxanthin), 안테라잔틴(antheraxanthin), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeaxanthin), 클로로필 a, b, 알파카로틴(α-carotene) 및 베타카로틴(ß-carotene)을 생산할 수 있는 미세조류임을 확인하였다. 이 중 루테인의 피크가 가장 높게 나타났으므로, 루테인 생산성이 뛰어난 미세조류라는 것을 확인할 수 있었다.
나아가, 해당 루테인의 피크에 따른 생성물이 정말 루테인이 맞는지 이중 확인하기 위해 DAD 스펙트럼을 분석한 결과, 도 8에 따르면, 루테인 스탠다드 시약의 스펙트럼과 일치하는 것을 확인하여, 생산하는 물질이 루테인이 맞음을 확인하였다. 또한, Lutein standard 시약(Sigma Aldrich, USA)으로 정량한 결과 약 10.18 mg/g(dried biomass) 의 루테인을 생산할 수 있다는 사실을 확인할 수 있었다.
<실시 예 5> 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21의 지방산 생성 확인
미세조류의 지방산(Fatty acid) 조성은 5975C mass selective detector가 장착된 7890A gas chromatograph(Agilent, Santa Clara, CA, USA)를 이용하여 분석하였다. 조지질을 추출하여 헥세인으로 에스테르화 반응 이후 DB-FFAP 컬럼(30m, 250μm ID, 0.25μm film thickness; Agilent, Santa Clara, CA, USA)을 사용하여 분석을 진행하였다. GV 오븐 온도는 50℃에서 시작하여 1분간 유지시켰으며, 온도는 200℃까지 분당 10℃씩 30분간 상승시킨 후 240℃까지 분당 10℃씩 상승시켜 20분간 유지시켰다. 시료는 20:1의 분할비로 1 μl를 주입하였으며, 헬륨을 운반가스로 하여 1 ml/min의 유속으로 흘려주었다. 질량분석은 다음의 조건으로 분석하였다. 시료 온도: 250℃, source 온도: 230℃, electron impact mode는 70eV의 가속 전압이 acquisition range 50-550 mz-1에서 시료의 이온화를 위해 사용되었다. 지방산의 동정은 Wiley/NBS libraries의 질량 분석과 비교하여 match값이 90% 이상이 되는 결과만 유효한 것으로 판정하였다.
실시 예 3에 따른 최적 광배양 조건에서, 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21를 2주간 배양하여, 미세조류를 수확한 뒤 지방산(fatty acid)을 분석한 결과, 하기 표 3과 같이, 다양한 지방산을 생산한다는 것을 확인할 수 있었고, 특히, 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀레산(linoleic acid) 및 알파 리놀렌산(alpha-linolenic acid)가 높은 양을 나타냈고, 오메가-9 지방산에 속하는 올레산이 가장 높은 함량을 나타냄을 알 수 있었다.
지방산(%) 종류 양(mg/g) 중량비(wt.%)
미리스트산(테트라데칸산) C14:0 - 0.34 ± 0.01 0.35 ± 0.01
필미트산(헥사노데카노인산) C16:0 - 29.18 ± 0.12 30.61 ± 0.28
스테아르산(옥타데칸산) C18:0 - 2.29 ± 0.00 2.40 ± 0.03
올레산 C18 1n9 omega-9 31.35 ± 0.38 32.88 ± 0.04
리놀레산 C18 2n9 omega-6 12.16 ± 0.25 12.75 ± 0.09
감마-리놀렌산 C18 3n6 omega-6 0.69 ± 0.01 0.72 ± 0.02
알파-리놀렌산 C18 3n3 omega-3 18.26 ± 0.53 19.15 ± 0.30
아라키딕산(이코산산) C20:0 0.28 ± 0.01 0.29 ± 0.01
에이코센산 C20:1 omega-9 0.33 ± 0.01 0.35 ± 0.00
베헨산(도코사노산) C22:0 - 0.18 ± 0.00 0.19 ± 0.00
리그노세르산(테트라코사노산) C24:0 - 0.30 ± 0.0 0.31 ± 0.01
총합 95.35 100
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.
본 발명의 범위는 후술하는 청구범위에 의하여 나타내어지며, 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 균등 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) KCTC15413 20230414

Claims (9)

  1. KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21).
  2. 청구항 1에 있어서,
    상기 미세조류는 네오잔틴(neoxanthin), 비올라잔틴(violaxanthin), 안테라잔틴(antheraxanthin), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeazanthin), 클로로필-a(chlorophyll-a), 클로로필-b(chlorophyll-b), α-카로틴(α-carotene) 및 β-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 생산하는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21).
  3. 청구항 1에 있어서,
    상기 미세조류는 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linoleic acid) 및 알파-리놀렌산(alpha-linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 생산하는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21).
  4. (1) KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)를 배양배지에 접종하는 단계; 및
    (2) 상기 배양배지에 접종한 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)를 빛이 있는 광조건하 25℃ 내지 32℃에서 배양하는 단계를 포함하며,
    상기 광조건은 광도 190 내지 195μmol·m-2·s-1의 빛을 처리하는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21) 배양방법.
  5. 청구항 4에 있어서,
    상기 (1) 단계의 배양배지는 농업용 비료를 포함하는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21) 배양방법.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 농업용 비료는 질소(N), 인(P) 및 칼륨(K)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상을 포함하는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21) 배양방법.
  7. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양방법은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)의 네오잔틴(neoxanthin), 비올라잔틴(violaxanthin), 안테라잔틴(antheraxanthin), 루테인(lutein), 제아잔틴(zeazanthin), 클로로필-a(chlorophyll-a), 클로로필-b(chlorophyll-b), α-카로틴(α-carotene) 및 β-카로틴(β-carotene)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21) 배양방법.
  8. 청구항 4 내지 청구항 6 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 배양방법은 KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21)의 팔미트산(palmitic acid), 올레산(oleic acid), 리놀렌산(linoleic acid) 및 알파-리놀렌산(alpha-linoleic acid)으로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나 이상의 생산을 증가시키는 것을 특징으로 하는 배양방법.
  9. KCTC15413BP로 기탁된 아스테라시스 쿼드리셀룰라레 AQYS21 미세조류(Asterarcys quadricellulare AQYS21), 이의 배양체, 배양체 추출물 또는 이들의 혼합물을 포함하는 카로티노이드 또는 지방산 생산 증진용 조성물.
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118084191A (zh) * 2024-04-29 2024-05-28 山东建筑大学 一种可扩展微藻动态膜生物反应器

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101548207B1 (ko) 2014-12-04 2015-09-01 경북대학교 산학협력단 신규한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 knua020 균주, 및 이를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101548207B1 (ko) 2014-12-04 2015-09-01 경북대학교 산학협력단 신규한 아스터라르시스 쿼드리셀룰랄리 knua020 균주, 및 이를 이용한 지방산 및 지방알코올의 생산방법

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
PLOS ONE | https://doi.org/10.1371/journal.pone.0221930, pp.1~19(2019) *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN118084191A (zh) * 2024-04-29 2024-05-28 山东建筑大学 一种可扩展微藻动态膜生物反应器

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