KR101615409B1

KR101615409B1 - 나비큘라속에 속하는 미세 조류, 그 미세 조류의 배양에 의한 유분의 제조 방법, 및 그 미세 조류로부터 채취한 유분

Info

Publication number: KR101615409B1
Application number: KR1020117025551A
Authority: KR
Inventors: 미츠후미 마츠모토
Original assignee: 일렉트릭 파워 디벨롭먼트 컴퍼니 리미티드
Priority date: 2009-04-10
Filing date: 2010-03-10
Publication date: 2016-04-25
Also published as: WO2010116611A1; AU2010233307B2; AU2010233307A1; EP2418270A4; ES2482592T3; EP2418270A1; CN102388126B; ZA201107726B; US8927285B2; US20120094339A1; PT2418270E; HK1167160A1; KR20120006520A; JPWO2010116611A1; EP2418270B1; JP5608640B2; CN102388126A

Abstract

본 발명은, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능이 높은 미세 조류, 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 유분의 제조 방법, 그 미세 조류로부터 채취한 유분, 그 미세 조류로부터 얻어지는 연료, 및 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 이산화탄소 고정 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 본 발명은, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능을 갖는 나비큘라(Navicula)속에 속하는 미세 조류이다. 미세 조류 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종　JPCC DA0580주(FERM　BP-11201)를 제공한다.

Description

나비큘라속에 속하는 미세 조류, 그 미세 조류의 배양에 의한 유분의 제조 방법, 및 그 미세 조류로부터 채취한 유분{MICRO-ALGA BELONGING TO GENUS NAVICULA, PROCESS FOR PRODUCTION OF OIL BY CULTURE OF THE MICRO-ALGA, AND OIL COLLECTED FROM THE MICRO-ALGA}

본 발명은, 나비큘라(Navicula)속에 속하는 미세 조류(藻類), 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 유분의 제조 방법, 및 그 미세 조류로부터 채취한 유분에 관한 것이다. 보다 상세하게는, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능(産生能)을 갖는 나비큘라(Navicula)속에 속하는 미세 조류, 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 유분의 제조 방법, 그 미세 조류로부터 채취한 유분, 그 미세 조류를 건조하여 얻어지는 건조 조체(藻體), 그 미세 조류로부터 얻어지는 연료, 및 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 이산화탄소 고정 방법에 관한 것이다.

바이오 연료로 호칭되는 중질유계 또는 경질유계의 탄화수소를, 미세 조류의 배양에 의해 제조할 방법이 몇 가지 보고되어 있다.

중질유계 탄화수소의 산생능을 갖는 조류로서는, 탄소수 36의 탄화수소의 산생능을 갖는 미세 조류 보트리오코커스 브라우니(비특허 문헌 1 참조)나 탄소수 33의 탄화수소의 산생능을 갖는 미세 조류 보트리오코커스·브라우니 A레이스(특허 문헌 1 참조)가 알려져 있다.

또, 경질유계 탄화수소의 산생능을 갖는 조류로서는, 탄소수 17의 탄화수소의 산생능을 갖는 미세 조류 Nostoc muscorum, Trichodesmium erythaeum, Plectonema terebrans 등(비특허 문헌 1 참조), 탄소수 19의 탄화수소의 산생능을 갖는 미세 조류 Coccochloris elabens 등(비특허 문헌 1 참조), 탄소수 17, 18, 19, 및 20의 탄화수소의 산생능을 갖는 미세 조류 슈도코리시스티스 엘립소이데아 MBIC11204주(특허 문헌 2 참조), 탄소수 17, 19, 21, 및 23의 탄화수소의 산생능을 갖는 미세 조류 코리시스티스 마이너 SAG17.98주(특허 문헌 2 참조)가 알려져 있다.

미세 조류를 산생할 수 있는 경질유계 탄화수소는 디젤 연료로서 산업상 유용하며, 지구 온난화 방지를 지향한 카본 뉴트럴한 연료로서도 기대되고 있다.

그러나, 상기 미세 조류를 건조하여 얻어지는 건조 조체에 있어서, 경질유계 탄화수소의 함유율은 통상 0.025~0.12질량% 정도이며(비특허 문헌 1 참조), 그 탄화수소 산생능은 반드시 충분하지는 않다.

특허 문헌 1 : 일본국 특허공개 평9-234055호 공보 특허 문헌 2 : 국제 공개 제2006/109588호 팸플릿

비특허 문헌 1 : R. Raja, S. Hemaiswarya, N. Ashok Kumar, S. Sridhar and R. Rengasamy(2008) A Perspective on the Biotechnological Potential of Microalgae. Critical Reviews in Microbiology, 34:77-88.

본 발명은 상기 사정을 감안하여 이루어진 것이며, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능이 높은 미세 조류, 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 유분의 제조 방법, 그 미세 조류로부터 채취한 유분, 그 미세 조류를 건조하여 얻어지는 건조 조체, 그 미세 조류로부터 얻어지는 연료, 및 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 이산화탄소 고정 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 하기의 구성을 취한다.

(1) 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능을 갖는 나비큘라(Navicula)속에 속하는 미세 조류.

(2) 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능을 갖는 미세 조류 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종.

(3) 미세 조류 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종 JPCC DA0580주(FERM BP-11201).

(4) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 유분의 제조 방법.

(5) 상기 배양하는 공정 뒤에, 당해 배양에 이용한 배지(培地) 중의 영양염류(營養鹽類)의 농도를 저감한 다른 배지에서 상기 미세 조류를 더 배양하는 공정을 갖는, 상기 (4)에 기재된 유분의 제조 방법.

(6) 상기 유분이 중성 지질(脂質)을 포함하는, 상기 (4) 또는 (5)에 기재된 유분의 제조 방법.

(7) 상기 유분이 스쿠알렌을 포함하는, 상기 (4)~(6) 중 어느 하나에 기재된 유분의 제조 방법.

(8) 상기 배양하는 공정 뒤에, 배양물로부터 유기용매로 유분을 추출하는 공정을 가지며, 당해 유기용매가, n-헥산으로 이루어지는 용매, n-헥산 및 메탄올로 이루어지는 용매, 또는 n-헥산 및 에탄올로 이루어지는 용매 중 어느 하나인 상기 (4)~(7) 중 어느 하나에 기재된 유분의 제조 방법.

(9) 상기 (4)~(8) 중 어느 하나에 기재된 유분의 제조 방법에 의해 제조된 유분.

(10) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 미세 조류를 건조하여 얻어지는 건조 조체.

(11) 상기 (1)~(3) 중 어느 한 항에 기재된 미세 조류로부터 얻어지는 연료.

(12) 상기 (1)~(3) 중 어느 하나에 기재된 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 이산화탄소 고정 방법.

또한, 본 특허청구범위 및 명세서 중에 있어서, 「탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능을 갖는다」란, 주로 탄소수 16, 18, 20, 22, 24 및 26의 지방족 탄화수소의 산생능을 갖는다는 의미이다. 또, 「유분」이란, 주로 소수성 유기 화합물로 이루어지는 액체 성분을 말한다. 그 소수성 유기 화합물로서는, 지방족 탄화수소, 중성 지방 등을 들 수 있다.

본 발명에 의하면, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능이 높은 미세 조류, 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 유분의 제조 방법, 그 미세 조류로부터 채취한 유분, 그 미세 조류를 건조하여 얻어지는 건조 조체, 그 미세 조류로부터 얻어지는 연료, 및 그 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 이산화탄소 고정 방법을 제공할 수 있다.

도 1은, JPCC DA0580주의 18S rDNA 염기 배열을 사용하여 얻어진 분자 계통수를 도시한 도면이다.
도 2는, JPCC DA0580주의 증식 곡선이다.
도 3은, JPCC DA0580주의 해수 성분 농도를 변화시킨 배양에 있어서의 증식 곡선이다.
도 4는, 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종 JPCC DA0580주(FERM BP-11201)의 전자 현미경상(좌 : 배율 1만배, 우 : 배율 1만 5천배)이다.
도 5는, Nile red로 염색한 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종 JPCC DA0580주(FERM BP-11201)의 형광 현미경상(밝은 형광 발색의 영역 : Nile red로 발색한 조체 내의 유지(油脂), 약간 어두운 영역 : 자가 형광으로 발색한 광합성 색소 등)이다.

이하, 본 발명에 대해 상세하게 설명한다.

<나비큘라속에 속하는 미세 조류>

본 발명에 있어서의 나비큘라(Navicula)속에 속하는 미세 조류는, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능을 갖는 것이다. 여기에서, 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소는, 주로 탄소수 16, 18, 20, 22, 24, 및 26의 지방족 탄화수소이다.

상기 미세 조류로서는, 특히, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 조체 중에 있어서의 함유율이 높고, 용이하게 배양할 수 있는 관점에서, 미세 조류 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종이 바람직하고, 미세 조류 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종 JPCC DA0580주(FERM BP-11201)(이하, JPCC DA0580주라고 약칭한다)가 보다 바람직하다.

JPCC DA0580주는, 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능에 더하여, 중성 지질 및 스쿠알렌의 높은 산생능을 갖는 관점에서도, 본 발명의 미세 조류로서 보다 바람직하다. 그 중성 지질의 설명은 후술한다.

JPCC DA0580주는, 발명자가 기수역의 해수로부터 단리(單離)한 황색식물문 규조강 깃돌말목 등줄돌말아목 나비큘라과에 속하는 해양 미세 조류의 신종의 신규주이다.

이하에, 그 미세 조류의 단리 방법 및 그 미세 조류의 JPCC DA0580주를 신종의 신규주로 판정하기에 이른 경위를 설명한다.

(배지 조제 방법)

질산나트륨 75.0mg/l, 인산수소2나트륨 5.0mg/l, 메타규산나트륨 9수화물 30.0mg/l, f/2 미량 금속 용액 1.0ml, f/2 비타민 용액 0.5ml, 및 인공 해수{제품명 : 마린아트·SF-1(센주 제약 주식회사제)} 37g/l를 증류수에 상기 소정의 농도로 용해한 액체 배지를, f/2 배지로서 조제하였다.

상기 f/2 미량 금속 용액은, Na₂EDTA 2수화물 4.36g/l, 염화제2철 6수화물 3.15g/l, 염화망간(II) 4수화물 180mg/l, 황산아연 7수화물 22.0mg/l, 염화코발트(II) 6수화물 10.0mg/l, 몰리브덴(VI)산2나트륨 2수화물 6.3mg/l, 황산구리(II) 5수화물 9.8mg/l의 조성을 갖는 수용액으로서 조제하였다.

상기 f/2 비타민 용액은, 티아민 200.0mg/l, 비오틴 0.1mg/l, 비타민(B12) 1.0mg/l의 조성을 갖는 수용액으로서 조제하였다.

또, 상기 f/2 배지의 조성에 더하여, 또한 한천을 1.2%(w/v)의 농도가 되도록 첨가한 한천 f/2 배지를 조제하였다.

또한, 상기 인공 해수는, 천연 해수에 포함되는 염류를 모방한 염류이다. 상기 인공 해수의 소정량(37g/l)을 증류수에 용해함으로써, 천연 해수를 모방한 해수 성분을 갖는 수용액을 제작할 수 있다.

(단리 방법)

상기 f/2 배지 2ml를 포함하는 24웰의 마이크로타이터 플레이트에, 2005년 7월 가고시마현 아마미시 스미요강과 야쿠가치강의 합류 지점에 있는 맹그로브림에서 채취한 모래와 진흙 샘플을 적당량 첨가하였다. 이어서, 1000럭스(lx)의 광 조사 하에서 정치(靜置) 배양을 행하여, 미세 조류의 생육을 확인할 수 있었던 웰 중의 배양액의 일부를 분취(分取)하였다. 그 분취한 배양액을 상기 f/2 한천 배지 상에 접종하여, 상기 광 조사 조건 하에서 배양함으로써, 갈색의 단세포 조류 JPCC DA0580주가, 단균화(單菌化)(단리)된 미세 조류의 콜로니로서 얻어졌다.

(형태학적 성질)

상기 한천 배지 상에서, 25℃, 7일간 배양한 결과, 직경 2.0~5.0mm 정도의 갈색의 JPCC DA0580주의 콜로니가 얻어졌다. 콜로니의 형상은 점상이며, 융기가 없는 반렌즈상이었다. 둘레 가장자리는 전연(全緣)이며, 표면은 매끄러운 형상이었다. 또, 변이에 의한 콜로니 형태의 변화는 보이지 않으며, 배양 조건이나 생리적 상태에 의한 콜로니 형태의 변화도 보이지 않았다.

상기 콜로니 중의 해양 미세 조류는, 크기가 평균적으로 10~20μm 정도의 단세포 조류로, 때로 군체를 형성하고, 영양 세포에는 점안이나 수축포는 없으며, 세포형은 마름모였다. 부유성은 없으며, 유리질의 껍질을 갖고, 피각(被殼)에 세로홈이 있으며, 세포 표면은 매끄럽다. 영양 세포는 편모를 갖지 않으며 운동성을 나타내지 않는다.

JPCC DA0580주의 전자 현미경상을 도 4에 나타낸다.

(생식 양식)

JPCC DA0580주는, 유성 생식과 무성 생식의 양쪽을 행한다. 무성 생식은 2분열에 의해 무성적으로 증식한다. 세포 분열은 피각 중에서 진행되고, 2개의 낭세포는 친세포의 외각와 내각의 내측에 각각 새로운 반피각(半被殼)을 형성한다. 친세포의 반피각은 각각 1개씩 낭세포에 분배된다. 그 결과, 낭세포의 1개는 친세포와 동일한 크기(의 피각)이지만, 또 한쪽은 내각을 외각으로서 이용한다. 그 결과, 친세포보다 한층 작아지므로, 어느 정도 작아진 세포에서는 유성 생식이 행해진다. 그 세포에서는, 감수 분열을 행하여 동형 배우자가 형성된다. 이 접합자가 피각을 통해 근접하여, 원형질을 아메바상으로 변화시켜 접합, 증대 포자를 형성하고, 성장하여 체적을 늘려, 적당한 크기의 통상 세포로 돌아오는 양식을 취하고 있다.

(생리학·생화학적 성질 및 상태)

· 배양액 : 해수를 기조로 하는 배양액 중에서 생육한다. 담수에서는 생육하지 않는다.

· 광합성 : 광합성에 의한 광 독립 영양 생육을 할 수 있다. 종속 영양 생육은 확인되지 않는다.

· 함유 색소 : 클로로필 a, c1, c2, 푸코크산틴 및 푸코크산틴 유도체를 중심으로 하는 카로테노이드 색소류

· 저장 물질 : 전분

· 생육 온도 : 20℃~35℃(지적(至適) 온도 25℃)

· 생육 pH : 7.0~9.0(지적 pH 8.0)

· 세포 내에 Nile red로 염색되는, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소, 중성 지질 및 스쿠알렌을 포함하는 대량의 유분을 축적한다.

· 생육 기간 : 1주간{탁도(OD750)가 0.05에서 1.2에 달하는데 필요한 기간}

도 5에 나타낸 바와 같이, Nile red 염색한 JPCC DA0580주를 형광 현미경으로 관찰하면, 형광 시야 중의 조체에 있어서, 밝은 형광 발색의 영역으로서 Nile red로 발색한 유분의 존재가 확인된다. 그 유분은 조체 세포 내에 유적(油滴)으로서 축적될 수 있다. 또, 그 유분은 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소, 중성 지질, 및 스쿠알렌을 포함한다.

전술한 형태학적 성질, 생식 양식, 및 생리학·생화학적 성질 및 상태의 점에서 JPCC DA0580주는, 황색식물문 규조강 깃돌말목 등줄돌말아목 나비큘라과에 속하는 조류라고 추정되었다. 또한, 종래 공지의 방법에 따라, DNA 추출 키트{제품명 : QIAamp DNA 브로드 미니 키트 50(주식회사 퀴아젠사제)}를 이용하여, 상기 JPCC DA0580주로부터 DNA를 추출하고, PCR법에 의해, 18S rDNA의 영역을 증폭시켜 시퀀스 해석을 행하여, 18S rDNA 영역의 염기 배열을 결정하였다. 얻어진 18S rDNA의 염기 배열을 배열표의 배열 번호 1에 나타낸다. 얻어진 18S rDNA의 염기 배열을 공공의 데이터베이스인 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ)와 대조하여 상동성을 검색(Blast 검색)하고, 해석 소프트 ClustalW 및 표시 소프트 Treeview를 이용하여 계통 해석을 행하였다. 그 결과 얻어진 계통도를 도 1에 나타낸다.

단리한 JPCC DA0580주는, 상기 계통수에 있어서, 나비큘라과로 분류되고, 나비큘라(Navicula)속의 규조와 클러스터를 형성하였다. 그러나, 유전자 레벨로 확인되어 있는 나비큘라(Navicula)속의 이미 알려진 종과 분기가 확인되었으므로, 본 발명자가 단리한 JPCC DA0580주는, 나비큘라(Navicula)속의 신종의 조류라고 판단되었다. 그래서, 당해 주를, 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종 JPCC DA0580주라고 명명하였다.

JPCC DA0580주는, 평성 21년 3월 16일자로 수탁 번호 FERM BP-11201로서, 독립 행정법인 산업기술 종합 연구소 특허 생물 기탁 센터(일본국 이바라키현 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1반지 1 중앙 제6(우편 번호 305-8566))에 수탁되어 있다(2009년 3월 16일에 기탁된, 국내 수탁 번호 : FERM P-21788로부터 이관).

JPCC DA0580주는, 조체 중에 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소, 중성 지질, 및 스쿠알렌을 포함하는 유분을 축적할 수 있다. 또한, JPCC DA0580주의 건조 조체에 있어서의 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 함유율은, 0.2질량% 이상에 달할 수 있다. 또, JPCC DA0580주의 건조 조체에 있어서의 상기 중성 지질의 함유율은, 36질량% 이상에 달할 수 있다. 또한, JPCC DA0580주의 건조 조체에 있어서의 상기 스쿠알렌의 함유율은, 0.3질량% 이상에 달할 수 있다.

또, 상기 유분은 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소, 중성 지질, 및 스쿠알렌 외에, 탄소수 27 이상의 지방족 탄화수소, 인지질, 유리 지방산, 스테로이드 화합물, 및 푸코크산틴 및 푸코크산틴의 유도체를 포함하는 카로테노이드 등의 광합성 색소 등도 포함할 수 있다.

상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소는, 주로 탄소수 16, 18, 20, 22, 24 및 26의 지방족 탄화수소이며, 보다 상세하게는, 주로 탄소수 16, 18, 20, 22, 24 및 26의 직쇄 지방족 포화 탄화수소이다.

상기 중성 지질은, 후술하는 바와 같이, 주로 테트라데카노일기(미리스토일기), 헥사데카노일기(팔미토일기), 헥사데세노일기(팔미톨레오일기), 옥타데세노일기(올레오일기), 및 에이코사펜타에노일기를, 아실기로서 갖는 중성 지질이며, 주로 이들 아실기를 갖는 트리글리세라이드이다.

상기 스쿠알렌은, 2, 6, 10, 15, 19, 23-헥사메틸테트라코사-2, 6, 10, 14, 18, 22-헥사엔이다.

상기 탄소수 27 이상의 지방족 탄화수소는, 스쿠알렌 이외의 지방족 탄화수소이다.

JPCC DA0580주에 포함되는 유분을, n-헥산을 용매로 하여 추출한 경우, 통상, 당해 추출된 유분 중, 약 80질량%는 상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질이며, 이것은 JPCC DA0580주의 건조 조체의 약 36질량% 이상에 달할 수 있다. 단, 이들 값은, 상기 트리글리세라이드가 올레산트리글리세라이드인 것으로 하여 계산한 경우이다.

또, 당해 추출된 유분에 포함되는, 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 양 및 상기 스쿠알렌의 양은, JPCC DA0580주의 건조 조체의, 약 0.2질량% 이상 및 약 0.3질량% 이상에, 각각 달할 수 있다.

단, 당해 추출된 유분의 이들 조성은, 상기 f/2 배지를 이용하여, 후술하는 통기 배양의 방법에 의해, JPCC DA0580주를 배양하였을 때에 통상 얻어지는 것이며, 당해 미세 조류의 배양 방법을 변경한 경우에는, 당해 추출된 유분의 조성은 변동할 수 있다.

상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하는 지방산은, 주로 테트라데칸산{미리스틴산(탄소수는 14, 이중 결합수는 0)}, 헥사데칸산{팔미틴산(탄소수는 16, 이중 결합수는 0)}, 헥사데센산{팔미톨레산(탄소수는 16, 이중 결합수는 1)}, 옥타데센산{올레산(탄소수는 18, 이중 결합수는 1)}, 및 에이코사펜타엔산{EPA(탄소수는 20, 이중 결합수는 5)}이다. 이들 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하고 있는 지방산의, JPCC DA0580주의 건조 조체당의 함유량은, 순서대로, 약 1.0질량%, 약 12.7질량%, 약 17.0질량%, 약 0.8질량%, 및 약 1.4질량%이다. 즉, 당해 건조 조체의 약 32.9질량%를, 상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하는 지방산이 차지한다.

또한, 상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하는 지방산의 건조 조체 중의 함유율은, 당해 지방산을 메틸에스테르화한 경우에, 그 지방산 메틸에스테르의 질량이 상기 건조 조체 중에 차지하는 비율이다.

<유분의 제조 방법>

본 발명에 있어서의 유분의 제조 방법은, 본 발명에 따른 상기 나비큘라(Navicula)속에 속하는 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 것이다. 본 발명에 따른 미세 조류를 배양하고, 당해 배양 공정에 의해 생육시킨 당해 미세 조류를 배지 중에서 회수하여, 얻어진 미세 조류 중에 포함되는 유분을 채취함으로써, 당해 유분을 제조할 수 있다.

당해 나비큘라(Navicula)속에 속하는 미세 조류로서는, 특히, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 조체 중에 있어서의 함유율이 높고, 용이하게 배양할 수 있는 관점에서, 미세 조류 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스종이 바람직하며, JPCC DA0580주가 보다 바람직하다.

JPCC DA0580주는, 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능에 더하여, 중성 지질 및 스쿠알렌의 높은 산생능을 갖는 관점에서도, 본 발명의 미세 조류로서 보다 바람직하다.

당해 미세 조류를 배양하는 공정으로서는, 나비큘라속에 속하는 미세 조류를 배양할 수 있는 공지의 방법을 적용할 수 있다. 예를 들면, 액체 배지를 넣은 편평 플라스크 등의 배양 용기에 상기 미세 조류를 접종하여, 조체가 침전하지 않을 정도로 완만하게 교반하면서 광 조사 하에서 통기 배양하면 된다.

상기 액체 배지로서는 당해 미세 조류를 배양할 수 있는 액체 배지이면 특별히 제한되지 않으며, 공지의 것을 사용할 수 있다. 예를 들면, 전술한 JPCC DA0580주를 단리할 때에 이용한 f/2 배지가, 생육이 양호한 관점에서, 바람직한 것으로서 들 수 있다.

상기 액체 배지에 있어서의 인공 해수{제품명 : 마린아트·SF-1(센주 제약 주식회사제)}의 농도로서는, 37g/l를 첨가한 경우를 100%(w/v)로 하였을 때, 30~100%(w/v)가 바람직하고, 50~100%(w/v)가 보다 바람직하고, 70~100%(w/v)가 더욱 바람직하며, 90~100%(w/v)가 특히 바람직하고, 95~100%(w/v)가 가장 바람직하다. 여기에서, 상기 인공 해수의 소정의 양(37g/l)을 증류수에 용해한 수용액은, 천연 해수의 염농도와 거의 동일하게 된다.

상기 광 조사 조건으로서는, 배양액 중의 조체 농도에 따라 적절히 조절하면 되고, 예를 들면 500럭스 이상(lx)이 바람직하고, 1000~30000럭스(lx)가 보다 바람직하고, 1000~10000럭스(lx)가 더욱 바람직하며, 1000~6000럭스(lx)가 특히 바람직하고, 1000~3000럭스(lx)가 가장 바람직하다.

상기 통기 배양에 있어서의 통기 가스로서는, 당해 미세 조류가 생육하는데 적합한 공지의 통기 가스를 이용할 수 있으며, 예를 들면, 통상의 공기, CO₂를 첨가한 공기 등을 사용할 수 있다. 그 중에서도, 당해 미세 조류의 생육을 보다 양호하게 하여 생육 기간을 단축할 수 있으므로, CO₂를 첨가한 공기를 이용하는 것이 바람직하다.

상기 CO₂를 첨가한 공기에 있어서의 CO₂ 농도로서는, 0.05~10%(v/v)가 바람직하고, 0.05~5.0%(v/v)가 보다 바람직하며, 1.0~3.0%(v/v)가 가장 바람직하다.

상기 통기 배양에 있어서의 통기량으로서는, 당해 미세 조류가 생육하는데 적합한 공지의 통기량을 적용할 수 있으며, 예를 들면, 0.5~5vvm이 바람직하고, 0.5~3.0vvm이 보다 바람직하며, 0.5~2.0vvm이 더욱 바람직하다.

상기 통기 배양에 있어서의 배양 온도로서는, 당해 미세 조류가 생육하는데 적합한 공지의 배양 온도이면 되고, 통상, 20~35℃에서 행하는 것이 바람직하며, 25~30℃에서 행하는 것이 보다 바람직하다.

상기 통기 배양의 기간으로서는, 당해 미세 조류가 생육하는 한 배양을 계속할 수 있으며, 통상, 1~4주간에서 행하는 것이 바람직하고, 1~3주간에서 행하는 것이 보다 바람직하며, 1~2주간에서 행하는 것이 더욱 바람직하다.

본 발명에 있어서의 유분의 제조 방법에 있어서, 당해 미세 조류의 상기 통기 배양 기간 뒤에, 영양 제한 하에서 더 배양해도 된다. 그 영양 제한 하에서 배양함으로써, 조체 중에 포함되는 유분의 함유율(건조 조체 중에 포함되는 유분의 질량%)을 높일 수 있다. 따라서, 상기 통기 배양 기간에, 영양 제한이 없는 배지(영양 배지)에서 당해 미세 조류를 생육시켜, 원하는 양까지 배양한 후에, 영양 제한 하에서의 배양으로 전환함으로써 조체 중에 포함되는 유분의 함유율을 높여, 당해 유분의 제조 효율을 높일 수 있다.

여기에서, 상기 영양 제한 하에서의 배양이란, 배지에 포함되는 비타민 등을 포함하는 영양염류를 통상보다 적게 한 배지(영양 제한 배지)에서 배양을 행하는 것이다. 예를 들면, 전술한 JPCC DA0580주를 단리할 때에 이용한 f/2 배지(영양 액체 배지)에 있어서의 비타민 등을 포함하는 영양염류(질산나트륨, 인산수소2나트륨, 메타규산나트륨, f/2 미량 금속 용액, 및 f/2 비타민 용액)의 함유량을 100%로 한 경우, 그 함유량이 100% 미만인 f/2 배지(영양 제한 액체 배지)를 이용하여 배양하는 것이, 영양 제한 하에서 배양하는 것에 해당한다.

상기 영양 제한 액체 배지에 포함되는, 비타민 등의 영양염류의 함유량으로서는, 당해 미세 조류 중의 유분의 함유율을 높이는 관점에서, 0~60%가 바람직하고, 0~30%가 보다 바람직하고, 0~20%가 더욱 바람직하며, 0~10%가 특히 바람직하고, 0%가 가장 바람직하다.

전술한, 영양 액체 배지로부터 영양 제한 액체 배지로 전환하는 방법으로서는, 특별히 제한되지 않으며, 한 번에 영양 제한 배지로 전환해도 되고, 점차 전환해도 된다. 상기 한 번에 전환하는 방법으로서는, 예를 들면 원심에 의해 조체를 침전시켜, 상청액인 영양 액체 배지를 제거하고, 다음에 영양 제한 액체 배지를 투입하는 방법을 들 수 있다. 또, 점차 전환하는 방법으로서는, 예를 들면 반투막으로 이격된 일방측에 조체를 포함하는 영양 액체 배지를 넣고, 타방측에 영양 제한 액체 배지를 넣음으로써, 침투압의 원리에 의해 조체를 포함하는 액체 배지의 비타민 등을 포함하는 영양염류의 함유 농도를 점차 저하시켜, 영양 제한 액체 배지로 하는 방법을 들 수 있다.

상기 영양 제한 하에서의 배양의 기간은, 본 발명의 효과를 손상시키지 않는 범위이면 특별히 제한되지 않으며, 당해 미세 조류의 유분 함유율을 높일 수 있는 기간이면 된다. 그 기간으로서는, 바람직하게는 3~20일, 보다 바람직하게는 3~10일, 더욱 바람직하게는 3~7일에서 행할 수 있다.

배양한 미세 조류의 회수 방법으로서는, 공지의 방법으로 행할 수 있으며, 예를 들면 배양액을 원심함으로써 조체를 침전시켜 펠릿으로서 회수하는 방법, 당해 미세 조류가 통과할 수 없는 구멍을 갖는 필터에 배양액을 통과시켜 필터에 남은 조체를 회수하는 방법 등을 들 수 있다.

상기 배양 방법 및 회수 방법에서 얻어진 조체 중에 포함되는 유분을 채취하는 방법으로서는, 본 발명의 효과를 손상시키는 것이 아니면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면 회수한 조체를 유기용매 중에 현탁함으로써 조체 중에 포함되는 유분을, 그 유기용매 중에 추출할 수 있다.

상기 유기용매로서는, 본 발명의 효과를 손상시키지 않고, 조체 중에 포함되는 유분을 용해할 수 있는 것이면 특별히 제한되지 않으며, 예를 들면, n-헥산(이하에서는, 헥산이라고 한다), 아세톤, 아세토니트릴, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 클로로포름 등을 들 수 있다. 이들 중에서도, 유분의 추출 효율의 관점에서, 헥산이 바람직하다. 또, 이들 유기용매는, 1종을 단독으로 이용해도 되고, 2종 이상을 조합하여 이용해도 된다.

또, 상기 유분의 추출 효율을 높이기 위해, 상기 조체를 현탁한 유기용매를 초음파 호모지나이저 등에 넣어, 그 조체를 물리적으로 파괴하는 것이 바람직하다.

상기 유분을 상기 미세 조류의 조체로부터 추출하기 위한 바람직한 용매로서 든 전술한 헥산은, 단독의 1상 용매로서 이용해도 되고, 메탄올 및/또는 에탄올을 혼합한 2상 용매로서 이용해도 된다.

메탄올을 혼합한 2상 용매로 한 경우, 헥산:메탄올=10:0~5:5의 비율(체적비)로 혼합하는 것이 바람직하고, 헥산:메탄올=10:0.5~8:2의 비율로 혼합하는 것이 보다 바람직하며, 헥산:메탄올=10:1~9:1의 비율로 혼합하는 것이 더욱 바람직하다.

에탄올을 혼합한 2상 용매로 한 경우, 헥산:에탄올=10:0~5:5의 비율(체적비)로 혼합하는 것이 바람직하고, 헥산:에탄올=10:0.5~8:2의 비율로 혼합하는 것이 보다 바람직하며, 헥산:에탄올=10:1~9:1의 비율로 혼합하는 것이 더욱 바람직하다.

에탄올 및 메탄올을 헥산에 혼합한 2상 용매의 경우, 에탄올 및 메탄올은 임의의 비율(체적비)로 혼합한 1상의 용매로서 이용된다. 이 경우, 헥산:에탄올 및 메탄올=10:0~5:5의 비율(체적비)로 혼합하는 것이 바람직하고, 헥산:에탄올 및 메탄올=10:0.5~8:2의 비율로 혼합하는 것이 보다 바람직하며, 헥산:에탄올 및 메탄올=10:1~9:1의 비율로 혼합하는 것이 더욱 바람직하다.

또한, 용매의 안전성 및 유분 추출량을 높이는 관점에서, 메탄올보다 에탄올을 이용하는 쪽이 보다 바람직하다.

상기 조체로부터 유기용매를 이용하여 유분을 추출하는 경우, 상기 조체를 건조시킨 후에 유기용매에 의한 유분 추출을 행해도 되고, 상기 조체에 수분이 포함되는 미건조 상태에서 유기용매에 의한 유분 추출을 행해도 된다.

본 발명에 따른 미세 조류의 조체로부터 유기용매를 이용하여 유분을 추출하는 경우, 그 조체를 미리 건조시키지 않고 미건조 상태의 조체로부터 유기용매에 의한 유분 추출을 행하는 쪽이, 유분 추출량을 높일 수 있으므로 바람직하다.

공지의 미세 조류의 조체로부터 유기용매를 이용하여 유분을 추출하는 경우에는, 상기 조체를 미리 건조시켜 두고, 건조 상태의 조체로부터 유기용매에 의한 유분 추출을 행하는 쪽이, 일반적으로 유분 추출량을 높일 수 있다. 그러나, 미리 조체를 건조하는 것은, 건조 처리에 걸리는 시간·에너지 비용의 면에서 불리하다. 이 점에 있어서, 본 발명에 따른 미세 조류의 조체는, 미건조 상태의 조체로부터 효율적으로 유분을 추출할 수 있는, 매우 우수한 성질을 갖는다고 할 수 있다. 이 이점에 의해, 본 발명의 미세 조류를 이용한 바이오 연료 등의 제조 프로세스의 저에너지화를 도모할 수 있다.

미건조 상태의 상기 조체로부터 유분을 유기용매에 의해 추출하는 경우는, 헥산과 메탄올 및/또는 에탄올로 이루어지는 2상 용매를 이용하면, 추출량을 많게 할 수 있다. 이 2상 용매로서는, 헥산:메탄올=10:1의 비율(체적비)로 혼합한 2상 용매, 또는 헥산:에탄올=10:1의 비율(체적비)로 혼합한 2상 용매가 특히 바람직하다.

건조 상태의 상기 조체로부터 유분을 유기용매에 의해 추출하는 경우는, 헥산으로 이루어지는 1상 용매를 이용하면, 보다 높은 추출 효율이 얻어진다.

상기 유기용매는, 당해 유분보다 끓는점이 낮으므로, 질소 기류의 분사, 감압 증류 제거 등에 의해 제거할 수 있다. 또, 재이용도 가능하다.

또, 상기 유기용매에 의해 추출한 유분은, 필요에 따라 또한 정제할 수 있다. 그 정제 방법으로서는, 공지의 방법으로 행하면 되고, 예를 들면 실리카겔을 이용한 고상 추출, 액체 크로마토그래피, 증류 등에 의해, 당해 유분에 포함되는 성분마다 분취하는 방법을 들 수 있다.

본 발명의 유분의 제조 방법에 의해 제조된 유분은, 당해 미세 조류를 Nile red로 염색하였을 때에 관찰되는 유분을 포함한다. 그 유분은, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소를 함유한다. 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소는, 주로 탄소수 16, 18, 20, 22, 24, 및 26의 지방족 탄화수소이다.

또, 상기 유분은 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소 외에, 중성 지질, 스쿠알렌, 탄소수 27 이상의 지방족 탄화수소, 인지질, 유리 지방산, 스테로이드 화합물, 및 카로테노이드 등의 광합성 색소 등도 포함할 수 있다.

본 발명의 유분의 제조 방법에 있어서, 당해 미세 조류로서 JPCC DA0580주를 이용한 경우, 그 제조된 유분의 설명은, 전술한 JPCC DA0580주가 조체 중에 축적할 수 있는 유분의 설명과 동일하다.

<유분>

본 발명에 있어서의 유분은, 본 발명에 따른 유분의 제조 방법에 의해 제조된 것이다.

당해 유분의 설명은, 전술한 유분의 제조 방법에 있어서의 유분의 설명과 동일하다.

또, 당해 유분으로부터 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소를 정제할 수도 있다. 또한, 당해 유분이 중성 지질 및/또는 스쿠알렌을 포함하는 경우는, 그 중성 지질 및/또는 스쿠알렌을 상기 유분으로부터 정제할 수도 있다.

그 정제 방법으로서는, 특별히 제한되지 않으며, 공지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 당해 미세 조류로부터 헥산 추출한 유분을 헥산 등의 유기용매에 용해하고, 그 용액에 실리카겔을 투입함으로써, 지방족 탄화수소 이외의 물질을 실리카겔에 흡착시켜, 상기 지방족 탄화수소만을 용출시킴으로써 정제할 수 있다. 또, 실리카겔에 흡착된 중성 지질을 유기용매 등으로 용출시킴으로써 정제할 수 있다. 또한, 용출한 지방족 탄화수소에 대해 증류, 크로마토그래피 등의 공지의 정제 방법을 행함으로써, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소와 스쿠알렌을 분리할 수 있다.

또한, 당해 유분을 용해하는 유기용매로서는, 전술한 유분의 제조 방법에 있어서의 유기용매의 설명에서 든 것과 동일한 것을 들 수 있다.

<건조 조체>

본 발명에 있어서의 건조 조체는, 본 발명에 따른 상기 나비큘라속에 속하는 미세 조류를 건조시킨 것이다.

당해 미세 조류로서는, 본 발명에 따른 상기 나비큘라속에 속하는 미세 조류의 설명에서 든 것과 동일한 것을 들 수 있다.

당해 미세 조류를 건조시키는 방법으로서는, 조체 중의 수분을 제거할 수 있는 방법이면 특별히 제한되지 않는다. 예를 들면, 조체를 햇볕에 말리는 방법, 조체에 건조 공기를 분사하는 방법, 조체를 동결 건조(프리즈 드라이)하는 방법 등을 들 수 있다. 이들 중, 조체에 포함되는 성분의 분해를 억제할 수 있는 관점에서, 동결 건조에 의한 건조 방법이 바람직하다.

<연료>

본 발명에 있어서의 연료는, 본 발명에 따른 상기 나비큘라속에 속하는 미세 조류로부터 얻어진 것이다.

당해 미세 조류를 연료로서 이용하는 방법으로서는, 당해 미세 조류를 연소시키는 방법, 당해 미세 조류로부터 채취한 유분을 연소시키는 방법, 당해 미세 조류로부터 채취한 유분에서 정제한 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소, 중성 지질, 및/또는 스쿠알렌을 연소시키는 방법 등을 예시할 수 있다.

당해 미세 조류를 연소시키는 경우, 연소 효율을 높이는 관점에서, 당해 미세 조류를 건조하여 얻어지는 건조 조체를 이용하는 것이 바람직하다. 그 건조 조체는, 본 발명에 따른 상기 건조 조체와 동일하다. 당해 미세 조류가 JPCC DA0580주인 경우에는, 그 건조 조체가 갖는 열량은, 석탄이 갖는 열량(약 6000kcal/kg)과 동등 이상에 달할 수 있다.

당해 미세 조류로부터 채취한 유분을 연소시키는 경우, 그 유분은, 본 발명에 따른 상기 유분과 동일하다. 당해 미세 조류로부터 채취한 유분은 가연성이며, 예를 들면 보일러 등의 연료로서 사용할 수 있다. 당해 미세 조류가 JPCC DA0580주인 경우에는, 그 헥산 추출물(유분)이 갖는 열량은, 8700kcal/kg 이상에 달할 수 있다.

당해 미세 조류로부터 채취한 유분에서 정제한 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소, 중성 지질, 및/또는 스쿠알렌을 연소시키는 경우, 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소, 중성 지질, 및 스쿠알렌은, 본 발명에 따른 상기 유분에 있어서의 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소, 중성 지질, 및 스쿠알렌과 동일하다. 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소는 디젤 엔진의 연료로서 이용할 수 있다. 또, 상기 중성 지질은, 공지의 에스테르 교환법 등에 의해 디젤 연료(이른바 바이오 디젤 연료)로 할 수 있다.

<이산화탄소 고정 방법>

본 발명에 있어서의 이산화탄소 고정 방법은, 본 발명에 따른 상기 나비큘라속에 속하는 미세 조류를 배양하는 공정을 갖는 것이다.

당해 미세 조류가 생육할 때에 행하는 광합성은, 배양액 중(대기 중)의 이산화탄소를 동화(同化)하는 작용이 있다. 즉, 당해 미세 조류를 배양함으로써, 이산화탄소를 고정할 수 있다.

당해 미세 조류를 배양하는 공정은, 본 발명에 따른 상기 유분의 제조 방법에 있어서의 당해 미세 조류의 배양 방법과 동일하다.

다음에 실시예를 나타내어 본 발명을 더욱 상세하게 설명하지만, 본 발명은 이하의 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1

JPCC DA0580주를 24구 웰에서 12주간 배양한 후, 그 조체를 Nile red로 염색함으로써, 조체 중에 유분이 산생 및 축적되어 있는 것을 확인하였다.

구체적으로는, 상기 f/2 배지 2ml를 포함하는 24구멍의 마이크로타이터 플레이트에, JPCC DA0580주를 접종하여, 1000럭스(lx)의 광 조사 하에서, 12주간 정치 배양하였다. 이어서, 배양액을 1.5ml 용량의 마이크로 튜브에 옮겨, 13000rpm으로 원심함으로써 조체를 펠릿으로서 회수하였다. 그 펠릿에 포함되는 배지를 제거하기 위해 0.5ml의 생리 식염수에 현탁한 후, 13000rpm의 원심을 5분 행하여, 조체를 펠릿으로서 회수하였다.

다음에, 그 펠릿을 450μl의 생리 식염수에 재현탁하고, 또한 50μl의 Nile red 용액을 더하여 혼합한 후, 실온에서 10분간의 인큐베이션을 행하였다. 그 후, 13000rpm의 원심을 5분 행하여 펠릿을 회수하고, 여분의 Nile red 용액을 씻어내기 위해 그 펠릿을 0.5ml의 생리 식염수에 현탁한 후 재차 원심하여 펠릿으로서 조체를 회수하였다. 얻어진 조체를 50μl의 생리 식염수에 현탁한 것을, 형광 현미경에 의해 관찰하였다. 그 결과, 조체 중에 Nile red로 염색된 유분의 존재 영역을 나타내는 황색의 형광을 발하는 영역을 확인할 수 있었다. 상기 형광 현미경상에서는, 조체 내에 대량의 유분이 유적상(油滴狀)으로 축적되어 있는 모양이 확인되었다(도 5).

또한, 상기 Nile red 용액은, 1mg의 Nile red를 10ml의 아세톤에 용해하고, 다시 생리 식염수로 4배로 희석한 용액이다.

실시예 2

상기 f/2 배지 500ml를 넣은 500ml 용량의 편평 플라스크에 JPCC DA0580주를 접종하여, 3000럭스(lx)의 광 조사 하, 통기량 1vvm으로 1주간, 통기 배양을 행하였다. 그 후, 원심으로 회수한 조체 펠릿을 하룻밤 동결 건조하였다.

얻어진 건조 조체 0.1g에 헥산 6ml를 더하여 현탁하고, 초음파 호모지나이저를 이용하여 실온에서 조체를 파쇄하면서 30분간의 추출을 행하였다. 다음에, 그 헥산 추출액을 원심하여, 조체의 잔사를 침전시키고, 상청의 헥산 추출 용액을 약 6ml 회수하였다. 침전으로서 남은 조체의 잔사에 대해, 다시 새로운 헥산 6ml를 더하여 현탁하고, 동일한 추출 조작을 2회(합계 3회의 추출 조작) 더 행하였다. 그 후, 회수한 헥산 추출액 약 18ml를 Sep-pak cartridge(6cc/1g)(Waters Corporation사제) 실리카겔 컬럼을 이용하여, 중성 지질, 유리 지방산, 색소 등을 제거하고, 지방족 탄화수소 분획을 포함하는 16ml 얻었다. 질소 기류에 의해 건조시키고, 헥산 0.5ml에 재용해시킨 것을 시료로 하였다. 그 시료를 가스 크로마토그래프 질량 분석(GCMS)에 의해 분석하여, 시료에 포함되는 탄화수소를 동정하였다.

사용한 가스 크로마토그래프 기기는 주식회사 시마즈 제작소제의 GC2010이고, 사용한 컬럼은 DB-1(컬럼 길이 : 30m, 컬럼 내경 : 0.25mm)이며, 측정 조건(승온 : 100℃(0분)~330℃(10℃/분, hold), 주입 온도 : 300℃, 주입 모드 : 스플릿리스, 캐리어 가스 : He, 주입량 : 1.0μl)으로 행하였다.

질량 분석 기기는, 전자 충격(EI)법에 의한 이온화를 행하는, 주식회사 시마즈 제작소제의 GCMS-QP5050A를 사용하였다.

GCMS 분석의 결과, JPCC DA0580주는, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소를 산생하고 있는 것이 명확해졌다. 보다 구체적으로는, 탄소수 16, 18, 20, 22, 24 및 26의 직쇄상 지방족 포화 탄화수소가 주된 성분으로서 확인되었다.

또, 경유 0.1%를 헥산에 용해한 시료를 정량용의 시료로 하여, GCMS 차트에 있어서의 당해 탄화수소를 나타내는 면적비로부터 JPCC DA0580주가 산생하는 탄화수소량을 정량한 바, JPCC DA0580주의 건조 조체에 있어서의 당해 탄소수 16, 18, 20, 22, 24 및 26의 직쇄상 지방족 포화 탄화수소의 함유율은 약 0.2질량%였다. 이 함유율은, 지금까지 공지의, 경질유계의 지방족 탄화수소를 산생하는 조류의 함유율보다 높은 것이었다. 또한, 당해 공지의 조류는, 비특허 문헌 1의 표 2에 기재되어 있는 바와 같이, 그 건조 조체에 있어서, 0.025~0.12질량%를 경질유계 지방족 탄화수소가 차지한다.

또한, 상기 GCMS 차트에 있어서 최대의 면적을 갖는 피크는, 스쿠알렌인 것으로 동정되었다. 그 피크 면적으로부터 계산한, 당해 JPCC DA0580주의 건조 조체당의 스쿠알렌 함유율은 약 0.3질량%였다.

또, 전술한 실리카겔 컬럼을 이용한 정제를 행하기 전의 헥산 추출액 약 18ml 중 미량을 분취해 둔 시료를, 상기 GCMS에 의해, 동일한 조건으로 분석하였다.

그 결과, 헥산에 의해 추출된 유분은, JPCC DA0580주의 건조 조체 중, 45.5질량% 이상을 차지하는 것이 확인되었다. 또한, 동일 조건에서 배양하여 얻어진, 다른 배양 로트로부터 얻어진 JPCC DA0580주의 조체에서는, 그 건조 조체 중, 최대로 58질량%를 상기 헥산에 의해 추출된 유분이 차지하는 것도 확인되었다.

실시예 3

실시예 2와 동일한 방법으로 배양하여 얻은 JPCC DA0580주의 조체 펠릿을 하룻밤 동결 건조하였다.

당해 건조 조체 20mg을 시료로 하고, 1회의 추출 조작에 이용한 헥산을 7ml로 한 것 이외는 실시예 2와 동일한 방법으로, 헥산 추출액 약 20ml를 얻었다. 그 헥산 추출액의 용매인 헥산을 질소 기류에 의해 증발시켜 제거하고, 9.1mg의 헥산 추출물(유분)을 얻었다. 따라서, 당해 건조 조체의 45.5질량%를 헥산 추출물(유분)이 차지하는 것을 확인하였다.

상기 헥산 추출물(유분)에 5% 염산-메탄올 용액을 더하여, 시일링한 시험관 중에서 90℃, 2시간 반응시켜, 상기 헥산 추출물에 포함되는 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하는 지방산의 메틸에스테르화를 행하였다. 그 후, 클로로포름으로 추출하고, 클로로포름상을 분취하여 시료로 하였다.

상기 시료를 하기의 GCMS 장치에 의해 분석하여, 올레산메틸에스테르를 표준 물질로서 이용하여 정량하였다.

사용한 가스 크로마토그래프 기기는, 애질런트·테크놀러지·인터내셔널 주식회사제의 GC6890N(모델 넘버)이고, 사용한 컬럼은 J&W제의 DB-WAX(컬럼 길이 : 30m, 컬럼 내경 : 0.25mm, 막두께 : 0.25μm)이며, 측정 조건{승온 : 50℃(0분)~250℃(10℃/분, 15분 유지), 주입 온도 : 230℃, 주입 모드 : 스플릿 주입(스플릿비 10:1), 캐리어 가스 : He(1.2ml/분), 검출기 : FID(250℃), 주입량 : 0.6μl}으로 행하였다.

질량 분석 기기는, 전자 충격(EI)법에 의한 이온화를 행하는, 일본 전자 주식회사제의 JMS-GCmate-II형을 사용하였다.

GCMS 분석의 결과, 상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하고 있는 지방산은, 주로 테트라데칸산{미리스틴산(C14:0)}, 헥사데칸산{팔미틴산(C16:0)}, 헥사데센산{팔미톨레산(C16:1)}, 옥타데센산{올레산(C18:1)}, 및 에이코사펜타엔산{EPA(C20:5)}이었다. 이들 지방산의, JPCC DA0580주의 건조 조체당의 함유량은, 순서대로, 약 1.0질량%, 약 12.7질량%, 약 17.0질량%, 약 0.8질량%, 및 약 1.4질량%였다. 즉, 당해 건조 조체의 약 32.9질량%를, 상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하는 지방산이 차지하고 있었다.

상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하는 지방산이, 모두 올레산인 것으로 가정한 경우, 당해 건조 조체의 약 3.8질량%가 상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 구성하는 글리세린인 것으로 계산되고, 당해 건조 조체의 약 36.7질량%가 상기 트리글리세라이드 등의 중성 지질인 것으로 결론되었다.

실시예 4

실시예 2와 동일한 방법으로 JPCC DA0580주를 배양하였다. 또, 액체 배지를 하기 IMK 배지로 바꾼 것 이외는 실시예 2와 동일한 방법으로 JPCC DA0580주를 배양하였다. 각각의 배지에 있어서의 JPCC DA0580주의 생육을 평가하기 위해, 각 배양액의 탁도(OD750)를 경시적으로 측정하였다. 그 결과를 도 2에 나타낸다.

상기 IMK 배지의 조제는, 이하와 같이 행하였다.

비타민 등을 포함하는 영양염류{질산나트륨 200mg/l, 인산수소2나트륨 1.4mg/l, 인산2수소나트륨 5.0mg/l, 염화암모늄 68mg/l, 티아민 0.2mg/l, 비오틴 0.0015mg/l, 비타민(B12) 0.0015mg/l, Na₂EDTA 37.2mg/l, FeEDTA 5.2mg/l, MnEDTA 0.3332mg/l, 염화망간(II) 4수화물 0.18mg/l, 황산아연 7수화물 0.024mg/l, 염화코발트(II) 6수화물 0.014mg/l, 몰리브덴(VI)산2나트륨 2수화물 0.0072mg/l, 황산구리(II) 5수화물 0.0024mg/l, 아셀렌산 5수화물 0.0016mg/l}, 및 인공 해수{제품명 : 마린아트·SF-1(센주 제약 주식회사제)} 37g/l를 증류수에 상기 소정의 농도로 용해한 액체 배지를, IMK 배지로서 제작하였다.

얻어진 결과로부터, JPCC DA0580주는, 상기 f/2 배지에 있어서, 1주간의 배양 기간에서, OD750이 0.05~0.9가 되고, 그 생육이 정상(定常)에 달하는 것이 확인되었다. 그 정상에 달한 조체를 회수하여 건조 동결하고, 그 건조 조체의 회수량을 조사한 바, 배양액 1L당 0.46g이었다.

실시예 2에 전술한 바와 같이, JPCC DA0580주의 건조 조체당의 헥산 추출물(유분)의 함량은 55질량% 이상을 차지할 때까지 달할 수 있으므로, JPCC DA0580주의 1주간당의 유분 생산성은, 배양 스케일 1L당 0.26g 이상에 달하는 것이 확인되었다.

한편, JPCC DA0580주는, 상기 IMK 배지에 있어서, 1주간의 배양 기간에서는, 그 생육이 정상에 달하지 않았다.

실시예 5

실시예 2에서 사용한 f/2 배지의 조성 중, 인공 해수{제품명 : 마린아트·SF-1(센주 제약 주식회사제)}의 농도를 변화시킨 영양 액체 배지를 5종류 제작하였다. 당해 인공 해수의 농도는, 0g/l로 첨가한 경우를 0%로 하고, 이하 동일하게 11.1g/l(30%), 18.5g/l(50%), 29.8g/l(80%), 37g/l(100%)로 하였다.

이들 배지 500ml를 넣은 500ml 용량의 편평 플라스크에 JPCC DA0580주를 접종하여, 실시예 2와 동일한 배양 조건으로, 1주간의 정치 배양을 행하였다. 생육을 평가하기 위해 배양액의 탁도(OD750)를 경시적으로 측정하였다. 그 결과를 도 3에 나타낸다.

얻어진 결과로부터, 1주간의 생육 기간 중, JPCC DA0580주는, 인공 해수(해수 성분)를 100% 포함하는 조건에서 가장 생육이 좋은 것이 확인되었다. 또, 인공 해수(해수 성분) 농도가 감소함에 따라 생육이 감소하고, 인공 해수(해수 성분)가 0%이면 생육하지 않는 것이 확인되었다.

이것으로부터, JPCC DA0580주는, 해양성의 미세 조류인 것이 확인되었다.

실시예 6

실시예 2와 동일한 배양 방법으로 JPCC DA0580주를 1주간 배양하였다. 그 후, 배양액으로부터 원심으로 회수한 조체 펠릿을 동결 건조하였다.

얻어진 건조 조체를 시료로 하여, 봄베형 열량계(주식회사 요시다 제작소제, 형식 : 1013-J, 열량의 계측 범위 : 4000~33500J)로 발열량을 측정한 바, 6730kcal/kg이었다. 즉, JPCC DA0580주의 건조 조체는, 석탄과 동등 이상의 발열량을 갖는 것이 확인되었다.

또, 얻어진 건조 조체를 시료로 하여, 실시예 2와 동일한 방법으로 얻어진 헥산 추출액을 질소 기류에 의해 건조시켜, 헥산 추출물(유분)로서 얻었다. 이것을 시료로 하여, 상기 봄베형 열량계로 발열량을 측정한 바, 그 헥산 추출물(유분)의 발열량은 8780kcal/kg이었다.

실시예 7

실시예 2와 동일한 방법으로 JPCC DA0580주를 1주간 배양하였다. 그 후, 배양액으로부터 원심에 의해 조체 펠릿을 회수하였다.

미건조 상태의 상기 조체 펠릿(건조 시의 질량은 0.1g)에 대해, 헥산/메탄올로 이루어지는 2상 용매(혼합비(체적비)는 헥산:메탄올=10:1)를 6ml 더하여 현탁하고, 초음파 호모지나이저를 이용하여 실온에서 조체를 파쇄하면서 30분간의 추출을 행하였다. 다음에, 그 추출액을 원심하여, 조체의 잔사를 침전시키고, 상청의 추출 용액을 약 6ml 회수하였다. 침전으로서 남은 조체의 잔사에 대해, 다시 새로운 상기 2상 용매 6ml를 더하여 현탁하고, 동일한 추출 조작을 2회(합계 3회의 추출 조작) 더 행하였다. 얻어진 추출액(합계 18ml)을 질소 기류에 의해 건조시켜, 실시예 2와 동일한 방법으로 GCMS에 의해 정량하였다.

그 결과, 상기 2상 용매에 의해 추출된 유분은, JPCC DA0580주의 조체의 건조 시 질량 중, 51.8질량%를 차지하는 것이 확인되었다. 이 결과를 표 1에 병기한다.

다음에, 상기 배양액으로부터 원심에 의해 회수된 조체 펠릿을 하룻밤 동결 건조하여 얻어진 건조 조체 0.1g에 대해, 상기 2상 용매를 대신해, 헥산으로 이루어지는 1상 용매를 이용하여, 동일한 방법으로 유분을 추출하였다. 얻어진 추출액(합계 18ml)을 질소 기류에 의해 건조시켜, 실시예 2와 동일한 방법으로 GCMS에 의해 정량하였다.

그 결과, 상기 헥산으로 이루어지는 1상 용매에 의해 추출된 유분은, JPCC DA0580주의 조체의 건조 시 질량 중, 46.2질량%를 차지하는 것이 확인되었다. 이 결과를 표 1에 병기한다.

또, 상기 배양액으로부터 원심에 의해 회수된 조체 펠릿을 하룻밤 동결 건조하여 얻어진 건조 조체 0.1g에 대해, 상기 2상 용매(헥산/메탄올(혼합비(체적비) 10:1))를 이용하여, 동일한 방법으로 유분을 추출하였다. 얻어진 추출액(합계 18ml)을 질소 기류에 의해 건조시켜, 실시예 2와 동일한 방법으로 GCMS에 의해 정량하였다.

그 결과, 상기 헥산으로 이루어지는 1상 용매에 의해 추출된 유분은, JPCC DA0580주의 조체의 건조 시 질량 중, 45.3질량%를 차지하는 것이 확인되었다. 이 결과를 표 1에 병기한다.

이상의 결과에서는, JPCC DA0580주의 미건조 상태의 조체로부터 유분을 유기용매에 의해 추출하는 경우는, 헥산과 메탄올로 이루어지는 2상 용매를 이용하면, 높은 추출 효율이 얻어졌다. 상기 결과를 비교하면, JPCC DA0580주로부터 유분을 추출하는 경우, 미건조 상태의 조체 펠릿에 대해, 헥산/메탄올로 이루어지는 2상 용매를 사용하여 추출하는 것이 보다 바람직하다.

실시예 8

미건조 상태의 상기 조체 펠릿(건조 시의 질량은 0.1g)에 대해, 헥산/에탄올로 이루어지는 2상 용매(혼합비(체적비)는 헥산:에탄올=10:1)를 6ml 더하여 현탁하고, 초음파 호모지나이저를 이용하여 실온에서 조체를 파쇄하면서 30분간의 추출을 행하였다. 다음에, 그 추출액을 원심하여, 조체의 잔사를 침전시키고, 상청의 추출 용액을 약 6ml 회수하였다. 얻어진 추출액(합계 6ml)을 질소 기류에 의해 건조시켜, 실시예 2와 동일한 방법으로 GCMS에 의해 정량하였다.

그 결과, 상기 2상 용매에 의해 추출된 유분은, JPCC DA0580주의 조체의 건조 시 질량 중, 31.5질량%를 차지하는 것이 확인되었다. 이 결과를 표 2에 병기한다.

다음에, 헥산/에탄올로 이루어지는 상기 2상 용매를 대신해, 헥산/메탄올로 이루어지는 2상 용매(혼합비(체적비)는 헥산:메탄올=10:1)를 이용하여, 동일하게 미건조 상태의 상기 조체 펠릿(건조 시의 질량은 0.1g)으로부터 유분을 추출해서, GCMS에 의해 정량하였다.

그 결과, 상기 2상 용매에 의해 추출된 유분은, JPCC DA0580주의 조체의 건조 시 질량 중, 30.7질량%를 차지하는 것이 확인되었다. 이 결과를 표 2에 병기한다.

또한, 실시예 7에 있어서의 유분 추출량보다, 실시예 8에 있어서의 유분 추출량이 적은 이유는, 유기용매에 의한 추출 회수를 3회(실시예 7)에서 1회(실시예 8)로 줄였기 때문이다.

다른 속으로 분류되는 미세 조류의 조체로부터 유분 추출할 때의 추출 효율

세네데스무스(Scenedesmus rubescens) JPCC GA0024주(수탁 번호 : FERM P-21749), 시아노 박테리아(Synechocystis sp.), 테트라셀미스(Tetraselmis striata)의 3종의 미세 조류를 공지의 방법으로 배양하여, 각각 조체 펠릿을 얻었다. 이들 3종의 미세 조류는, 그 조체 중에 유분을 축적하는 것이다. 그 유분은, 적어도 트리글리세라이드 등의 중성 지질을 함유한다.

각 조체 펠릿의 건조 시 질량 0.1g을 시료로 하고, 미건조 상태의 조체 펠릿에 대해 2상 용매《헥산/메탄올(혼합비(체적비) 10:1)》를 이용하여, 실시예 7과 동일한 방법으로 유분을 추출하였다.

다음에, 각 조체 펠릿의 건조 시 질량 0.1g을 시료로 하고, 건조 상태의 조체 펠릿에 대해 1상 용매(헥산)를 이용하여, 실시예 7과 동일한 방법으로 유분을 추출하였다.

또, 각 조체 펠릿의 건조 시 질량 0.1g을 시료로 하고, 건조 상태의 조체 펠릿에 대해 2상 용매《헥산/메탄올(혼합비(체적비) 10:1)》를 이용하여, 실시예 7과 동일한 방법으로 유분을 추출하였다.

얻어진 각 추출액(합계 18ml)을 질소 기류에 의해 건조시켜, 실시예 2와 동일한 방법으로 GCMS에 의해 정량하였다. 그 결과를 표 3에 병기한다.

표 3의 결과로부터, 공지의 미세 조류의 조체로부터 유기용매를 이용하여 유분을 추출하는 경우, 미건조 상태의 조체로부터 유분 추출을 행하면, 극히 유분 추출량이 적어져 버리는 것이 명확하다. 즉, 미리 상기 조체를 건조시키는 공정이 필요하다. 상기 조체의 건조 프로세스에는, 많은 시간이나 비용이 필요해진다.

한편, 본 발명에 따른 미세 조류의 조체는, 미건조 상태의 조체로부터 효율적으로 유분을 추출할 수 있는 매우 우수한 성질을 가지므로, 본 발명의 미세 조류를 이용한 바이오 연료 등의 제조 프로세스의 저에너지화를 도모할 수 있다.

본 발명에 따른 미세 조류는, 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능이 높기 때문에, 디젤 연료의 생산에 이용 가능하고, 지구 온난화 방지를 지향한 카본 뉴트럴한 연료로서도 기대할 수 있다. 본 발명의 JPCC DA0580주는, 상기 탄소수 16~26의 지방족 탄화수소의 산생능에 더하여, 중성 지질 및 스쿠알렌의 높은 산생능을 갖는 관점에서도, 특히 기대할 수 있는 것이다.

또한, 상기 중성 지질은, 공지의 에스테르 교환법 등에 의해 디젤 연료(이른바 바이오 디젤 연료)로 할 수 있다.

일본 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허미생물기탁센터

FERMBP11201

20090316

SEQUENCE LISTING <110>Electric Power Development Co.,Ltd <120>Microalgae Scenedesmus, method of the production of oil with microalgae Senedesmus, and oil extracted from microalgae Senedesmus. <130>PC12591 <160>1 <210>1 <211>1641 <212>18S rDNA <213> Navicula sp. JPCC DA0580 (FERM BP-11201) <400>1 ACTTTGAAACTGCGAACGGCTCATTATATCAGTTATAGTTTATTTGATAGTCCCTTACTA 60 CTCGGATAACCGTAGTAATTCTAGAGCTAATACGTGCGTCAATACTCTTCGGAGTAGTAT 120 TTATTAGATGGAAACCAACTGCTTCGGCATGATGTGGTGATTCATAATAAGCTTGCGGAT 180 CGCGTGCTTCGGCYGCGATGGATCATTCAAGTTTCTGCCCTATCAGCTTTGACGGTACTG 240 TATTGGAGTACCGTGGCGGTAACGGGTAACGGGAAATTAGGGTTTGACACCGGAGAGGGA 300 GCCTGAGAGACGGCTACCACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGTAAATTACCCAATCTTG 360 ACACAAGGAGGTAGTGACAATAAATAACAATGCCGGGCCTTTCTAGGTCTGGCAATTGGA 420 ATGAGAACAATTTAAACCCCTTATCGAGGATCCATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAG 480 CCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGCAGTTAAAAAGCTCGTAG 540 TTGGATTTGTGGCGTGCGTTGCGGCGTCCATTGATTTGGTTCTGCCTYGACCGCGCCATC 600 CTTGGGTGGAATCTGYGTGGCATTAGGTTGTCGTGCAGGGGATGCCCATCGTTTACTGTG 660 AAAAAATTAGAGTGTTCAAAGCAGGCTTATGCCGTTGAATATATTAGCATGGAATAATAA 720 GATAGGTCTAGGGTCCTATTTTGTTGGTTTGCGGTCCTTGGAAATGATTAACAGGGACAG 780 TTGGGGGTATTCGTATTCCATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTCTGGAAGACGAACT 840 ACTGCGAAAGCATTTACCAAGGATGTTTTCATTAATCAAGAACGAAAGTTAGGGGATCGA 900 AGATGATTAGATACCATCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACAAGGGATTGGCGGGG 960 TTCGTTTCGTCTCCGTCAGCACCTTATGAGAAATCACAAGTTTTTGGGTTCCGGGGGGAG 1020 TATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGAGTGGAGCC 1080 TGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGAAAACTTACCAGGTCCAGACATAGTGAGGATTGA 1140 CAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTCTATGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTG 1200 GAGTGATTTGTCTGGTTAATTCCGTTAACGAACGAGACCCCTGCCTGCTAAATAGTCCCG 1260 CGAGTGAATTTCACTGGCGCGGTCTTCTTAGAGGGACGTGCGTTCTATTMGACGCAGGAA 1320 GATAGGGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACA 1380 CTGATGCATTCAACGAGTGTTYTTCCTTGGCCGAGAGGCCTGGGCAATCTTTTGAACGTG 1440 CATCGTGATAGGGATAGATTATTGCAATTATTAATCTTGAACGAGGAATTCCTAGTAAAC 1500 GCAGATCATCAATCTGCATTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCACC 1560 TACCGATTGAATGGTCCGGTGAAGCCTCGGGATTGTGGCTGTTGCCTTYRCGGGTGGCGG 1620 TTGCGAGAACTTGTCTAAACC 1641

Claims

미세 조류 나비큘라(Navicula)속 오일리티커스(oiliticus)종 JPCC DA0580주(FERM BP-11201).
청구항 1에 기재된 미세 조류를 배양하는 것을 포함하는 유분의 제조 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 배양 후, 당해 배양에 이용한 배지 중의 영양염류(營養鹽類)의 농도를 저감한 다른 배지에서 상기 미세 조류를 배양하는 것을 추가로 포함하는, 유분의 제조 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 유분이 중성 지질을 포함하는, 유분의 제조 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 유분이 스쿠알렌을 포함하는, 유분의 제조 방법.
청구항 2에 있어서,
상기 배양 후, 유기용매로 배양물로부터 유분을 추출하는 것을 추가로 포함하고,
상기 유기용매가, n-헥산으로 이루어지는 용매, n-헥산 및 메탄올로 이루어지는 용매, 또는 n-헥산 및 에탄올로 이루어지는 용매 중 어느 하나인 것인, 유분의 제조 방법.
청구항 1에 기재된 미세 조류를 건조하여 얻어지는 건조 조체(藻體).
청구항 1에 기재된 미세 조류를 배양하는 것을 포함하는 이산화탄소 고정 방법.
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