JP2020074725A - 珪藻類の回収方法及び回収装置 - Google Patents
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Abstract
Description
(2)上記紫外線の照射量を2〜50mJ/cm2とすることを特徴とする(1)記載の珪藻類の回収方法。
(3)上記紫外線は波長範囲(100〜400nm)であることを特徴とする(1)記載の珪藻類の回収方法。
(4)上記珪藻類は、Naviculaceae(フナガタケイソウ科)に属する珪藻類であることを特徴とする(1)記載の珪藻類の回収方法。
(5)上記Naviculaceae(フナガタケイソウ科)に属する珪藻類は、Fistulifera属、Mayamaea属、Navicula属、及びSeminavis属からなる群から選ばれる1つの属に属する珪藻類であることを特徴とする(4)記載の珪藻類の回収方法。
(6)上記珪藻類は、Fistulifera solarisであることを特徴とする(1)記載の珪藻類の回収方法。
(7)上記(1)〜(6)いずれか記載の方法により回収した珪藻類からオイル成分を抽出する工程を含む、珪藻類由来オイルの製造方法。
(8)抽出したオイル成分を精製する工程を更に含む(7)記載の珪藻類由来オイルの製造方法。
(9)オイル蓄積能を有する珪藻類を培養することができる培養槽と、上記培養槽内において培養した珪藻類を含む培養液に紫外線を照射する紫外線照射装置とを備えるオイル蓄積能を有する珪藻類の回収装置。
(10)上記紫外線照射装置により紫外線を照射した後の培養液を溜める回収槽を更に備えることを特徴とする(9)記載の珪藻類の回収装置。
(11)上記培養槽と上記回収槽との間に培養液を流すことができる流路を備え、上記紫外線照射装置は当該流路に配設されていることを特徴とする(10)記載の珪藻類の回収装置。
(12)上記紫外線照射装置による紫外線の照射量を2〜50mJ/cm2とすることを特徴とする(9)記載の珪藻類の回収装置。
(13)上記紫外線照射装置は波長範囲(100〜400nm)の紫外線を照射するものであることを特徴とする(9)記載の珪藻類の回収装置。
(14)上記珪藻類は、Naviculaceae(フナガタケイソウ科)に属する珪藻類であることを特徴とする(9)記載の珪藻類の回収装置。
(15)上記Naviculaceae(フナガタケイソウ科)に属する珪藻類は、Fistulifera属、Mayamaea属、Navicula属、及びSeminavis属からなる群から選ばれる1つの属に属する珪藻類であることを特徴とする(14)記載の珪藻類の回収装置。
(16)上記珪藻類は、Fistulifera solarisであることを特徴とする(9)記載の珪藻類の回収装置。
[水係数]=(1-10-al)/(al ln(10))
[沈降率(%)]=(1-A/B)×100
本研究では、海洋珪藻Fistulifera solaris及びMayamaea sp.へ紫外線(以下UV)を照射した際の細胞凝集誘導の解析を行うことを目的とした。具体的には、UV照射によるF. solaris及びMayamaea sp.の凝集誘導の照射量、波長依存性の解析を行い、凝集体形成の普遍性について評価した。また、比較として、異種の微細藻類についても同様の解析を行い、凝集誘導の評価を行った。
2-1. 試薬及び実験機器
試薬類は全て研究用の市販特級品またはそれに準じたものを用い、試薬等の調製は蒸留水及び蒸留水をMilli-Q Integral MT (Merck Millipore社製) で処理した純水を用いた。藻体の吸光度の測定には、マイクロプレートリーダSH-9000 (Corona electric社製) を用いた。藻体の凍結乾燥は、FreeZone Freeze Dry Systems (Labconco社製) を用いて行った。ガスクロマトグラフ・マススペクトロメリー分析 (GC-MS分析)の機器にはGC-MS-QP2010 Plus (Shimadzu Corporation製)を用いた。
藻体F. solaris及びPhaeodactylum tricornutumの培養には、Guillard’s f medium (f培地)の1/2倍の培地成分 (f/2培地、1.5g NaNO3、100mg NaH2PO4・H2O、10μg Vitamin B12、10μg Biotin、2mg Thiamine HCl、600mg Na2SiO3・9H2O、87.2mg Na2EDTA、63mg FeCl3・6H2O、200μg CoCl4・5H2O、440μg ZnSO4・7H2O、3.6mg MnCl2・4H2O、196μg CuSO4・5H2O、126μg Na2MoO4・2H2O)を1Lの人工海水に溶解したものを使用した。人工海水はマリンアート スーパーフォーミュラ (富田製薬株式会社製)を用いて作製した。Chlamydomonas reinhardtiiの培養には、BG-11培地 (36mg CaCl2・2H2O、1.81mg MnCl2・4H2O、1.5g NaNO3、49.4μg Co(NO3)2・6H2O、1mg Na2EDTA・2H2O、390μg Na2MoO4・2H2O、20mg Na2CO3、2.86mg H3BO3、30mg K2HPO4・3H2O、75mg MgSO4・7H2O、79μg CuSO4・5H2O、222μg ZnSO4・7H2O、1μg Vitamin B12、6mg Citric acid、6mg Ferric ammonium citrate)を1Lの蒸留水に溶解したものを使用した。F. solaris及びC. reinhardtiiは25℃、P. tricornutumは15℃で、光量約62μmol/m2sで三角フラスコ内で静置培養した。
本実施例で用いたUV照射系を図4(A)に示した。UVランプ(Toshiba lighting & technology社製)を台に取り付け、下向きになるように固定した。ランプの下に振とう機を設置し、その上にシャーレ (90×15mm、Iwaki社製)を設置し、培養液20mlを導入した。ランプ下面と液面までの距離は24.4cm、シャーレ底面から液面までの距離は0.6cm、照射面積は20.3cm2とした。また、青色、赤色光の照射系を図4(B)に示した。青色LED (ピーク波長474nm (435-540nm)、Nichia corporation社製)、赤色LED (ピーク波長620nm (585-665nm)、Nichia corporation社製)を照射面が下向きになるように固定し、UVランプと同様に培養液を導入したシャーレを設置した。なお、図4中(a)はUVランプであり、(b)はシャーレ及び培養液であり、(c)は振とう器であり、(d)は青色LED又は赤色LEDである。
各光の照射量は、各光の照射時間を変えることによって制御した。照射量は、平均照射強度と照射時間の積により算出される。本実施例では、平均照射強度の算出は上述したBolton and Linden 2003の報告に従って行った。本実施例では、光源と照射面の距離が、照射面の直径の4倍未満であるため、発散係数(Divergence Factor)を考慮しなかった。サンプルの254-870nmの吸光度は紫外可視吸光光度計 UV-2550 (Shimadzu社製)を用いて測定した。この際、f/2、BG-11培地の同波長領域の吸光度をバックグラウンドノイズとして差し引いた。また、反射率(Reflection Factor)は、光が空気から水に侵入する場合の文献値である0.975を用いた。本実施例では、水係数と反射率とを掛け合わせることで補正係数(Correction Factor)を算出した。次に、UV LIGHT METER UV-37SD (CUSTOM corporation社製)及びHD 2302.0 Photoradiometer photometers (Delta OHM社製)によって照射強度の測定を行った。以上より算出したCorrection Factorと照射強度を掛け合わせることで、平均照射強度を算出し、その値を元にUV-Cの照射時間を設定した([照射時間]=[照射量]÷[平均照射強度])。
F. solaris、Mayamaea sp.、P. tricornutum、C. reinhardtiiを初期濃度5.0×105cells/mlで培養した。120時間後、培養液40mlに対して、UVランプ及びLED用いて照射量0、0.5、1、2、4、10、25、50mJ/cm2の光を照射した。その後、培養液を三角フラスコに移し、再度静置培養した。
静置培養後、各藻体の培養液を15mlディスポーサブルチューブ (IWAKI社製)に移した。次に、培養液を撹拌し、培養液下面から2.5cm上のサンプルを採取した。その後、培養液を静置し、0、3、5、10分後に培養液下面から2.5cm上のサンプルを採取した。その後、採取したサンプルのOD750を測定し、細胞の沈降率を以下の式を用いて算出した。
沈降率(%)=(1-A/B)×100
A:攪拌3、5、10分後に採取したサンプルのOD750
B:攪拌0分後に採取したサンプルのOD750
UV照射24時間後、F. solaris或いはMayamaea sp.をカバーガラス上に導入し、正立顕微鏡 (BX-51, Olympus Corporation, Tokyo, Japan)によって微分干渉観察を行った。また、F. solaris培養液を超純水で1回洗浄し、カバーガラス上に導入した。次に、サンプルを風乾させ、Auコーティングをした後に走査型電子顕微鏡 (VE-9800、Keyence社製)で観察を行った。
2-8-1. 多糖類組成分析
UV照射24時間後、F. solarisを遠心回収 (8,500g、10min)した。その後、超純水5mlを添加し、再度細胞を遠心回収した。次に、回収した細胞に超純水1mlを添加し、凍結乾燥した。凍結乾燥後、乾燥藻体に0.1% (w/v) NaCl 1.3mlを添加し、インキュベーション (70℃、5min)した。遠心分離 (10,000g、20min、4℃)後、上清1mlを回収した。残渣には超純水1mlを加え再懸濁後、遠心分離 (10,000g、20min、4℃)し、上清1mlを先の上清に加えた。この操作をもう一度繰り返し、得られた3mlの上清を0.2μl PTFEフィルター (Advantec社製)でろ過した。次に、100%エタノールを終濃度70%になるように上清に添加し、静置 (16h、4℃)し、得られたペレットを1mlの超純水で溶解し、凍結乾燥した。
3-1. UV照射に伴うF. solarisの凝集誘導の評価
3-1-1. 照射量依存性の評価
F. solarisに対し、0、0.5、2mJ/cm2のUV (照射時間:0-12sec)を照射し、静置培養を行った。24時間後、F. solaris培養液の観察を行ったところ、2mJ/cm2のUVを照射した藻体は三角フラスコ内で凝集している様子が目視により観察された。次に、培養液をディスポーサブルチューブに移し、攪拌後に静置したところ、0、0.5mJ/cm2のUVを照射したF. solarisと比較し、2mJ/cm2のUVを照射したサンプルで細胞がより短時間に沈降する様子が観察された(図5)。以上より、F. solarisがUV照射によって凝集し、より早く細胞が沈降するようになることが示された。
UVランプ及びLEDを使用し、F. solarisへ光照射を行った。光照射は、図4に示した系で行った。UVランプ及びLEDを使用した際の平均照射強度を表1に示した。
UVランプを使用し、F. solaris、P. tricornutum、C. reinhardtiiへ照射量0、0.5、1、2、4mJ/cm2のUVを照射し、静置培養した。24時間後、F. solaris培養液を回収し、細胞の沈降率の測定を行った。その結果、F. solarisの沈降率は、0、0.5、1mJ/cm2のUV照射時には-1-16%、2、4mJ/cm2のUV照射時に65%以上となり、UV照射によって細胞の沈降率が増加した (図9)。一方、P. tricornutumの沈降率は全ての照射量条件で4%以下となり、細胞の沈降率に顕著な増加は見られなかった。また、C. reinhardtiiの沈降率は全ての照射量条件で12%以下となり、細胞の沈降率に顕著な増加は見られなかった。オイル蓄積能を有する珪藻F. solarisで凝集が見られ、オイル蓄積能を有しない珪藻P. tricornutum及びオイル蓄積能を有しない緑藻C. reinhardtiiで凝集が見られなかったことから、UV照射による微細藻類の凝集誘導は、オイル蓄積能を有する珪藻類に特異的に見られる現象であることが示唆された。
UVランプを使用し、Mayamaea sp.へ照射量0、4、10、25、50mJ/cm2のUVを照射し、静置培養した。24時間後、Mayamaea sp.の培養液を回収し、細胞の沈降率の測定を行った。その結果、Mayamaea sp.の沈降率は、4、10、25、50mJ/cm2のUV照射時において30%以上であり、10mJ/cm2のUV照射時に沈降率は60%で最大値を示した(図10)。
3-3-1. 正立顕微鏡及び走査型電子顕微鏡を用いた細胞表面の観察
F. solarisへ10mJ/cm2のUVを照射し、静置培養した。また、比較としてUV照射を行わないサンプルを調製し、静置培養した (0mJ/cm2)。次に、静置培養にて凝集した細胞を正立顕微鏡によって観察した。その結果、10mJ/cm2のUVを照射したF. solarisが凝集している様子が観察された (図11(A))。また、凝集体の周りに細胞外分泌物質様の物質が観察された。一方、UVを照射していないF. solarisは凝集しておらず、培地全体に分散していた (図11(B))。次に、SEMによるF. solarisの観察を行った。その結果、UVを照射したF. solarisが凝集している様子が観察され、同様に凝集体の周りに細胞外分泌物質様の物質が観察された (図12(A))。一方、UVを照射していないF. solarisの細胞表面に分泌物質は観察されなかった (図12(B))。微細藻類は細胞外に多糖類やタンパク質を分泌し、これらの物質を介して凝集することが知られている (Salim et al. (2014). J Biotechnol, 174:34-38)。従って、顕微鏡で観察された細胞外分泌物質様の物質は多糖類かタンパク質である可能性が考えられた。
4 mJ/cm2のUVを照射したF. solarisの単糖類組成を解析した。また、比較としてUV照射を行っていないサンプルを調製し、単糖類組成を解析した。その結果、いずれのサンプルでもグルコースのみが検出された (図13)。
F. solarisへ10mJ/cm2のUVを照射し、静置培養した。得られた凝集体について光学顕微鏡で明視野観察するとともに、クロロフィル染色、BODIPY染色及びCalcofluor White染色して蛍光観察した。
Claims (16)
- オイル蓄積能を有する珪藻類を培養した培養液に対して紫外線を照射する工程と、
上記工程の後、上記珪藻類の凝集体を沈降させ、沈降した珪藻類を回収する工程とを含むオイル蓄積能を有する珪藻類の回収方法。 - 上記紫外線の照射量を2〜50mJ/cm2とすることを特徴とする請求項1記載の珪藻類の回収方法。
- 上記紫外線は波長範囲(100〜400nm)であることを特徴とする請求項1記載の珪藻類の回収方法。
- 上記珪藻類は、Naviculaceae(フナガタケイソウ科)に属する珪藻類であることを特徴とする請求項1記載の珪藻類の回収方法。
- 上記Naviculaceae(フナガタケイソウ科)に属する珪藻類は、Fistulifera属、Mayamaea属、Navicula属、及びSeminavis属からなる群から選ばれる1つの属に属する珪藻類であることを特徴とする請求項4記載の珪藻類の回収方法。
- 上記珪藻類は、Fistulifera solarisであることを特徴とする請求項1記載の珪藻類の回収方法。
- 請求項1〜6いずれか一項記載の方法により回収した珪藻類からオイル成分を抽出する工程を含む、珪藻類由来オイルの製造方法。
- 抽出したオイル成分を精製する工程を更に含む請求項7記載の珪藻類由来オイルの製造方法。
- オイル蓄積能を有する珪藻類を培養することができる培養槽と、
上記培養槽内において培養した珪藻類を含む培養液に紫外線を照射する紫外線照射装置とを備えるオイル蓄積能を有する珪藻類の回収装置。 - 上記紫外線照射装置により紫外線を照射した後の培養液を溜める回収槽を更に備えることを特徴とする請求項9記載の珪藻類の回収装置。
- 上記培養槽と上記回収槽との間に培養液を流すことができる流路を備え、上記紫外線照射装置は当該流路に配設されていることを特徴とする請求項10記載の珪藻類の回収装置。
- 上記紫外線照射装置による紫外線の照射量を2〜50mJ/cm2とすることを特徴とする請求項9記載の珪藻類の回収装置。
- 上記紫外線照射装置は波長範囲(100〜400nm)の紫外線を照射するものであることを特徴とする請求項9記載の珪藻類の回収装置。
- 上記珪藻類は、Naviculaceae(フナガタケイソウ科)に属する珪藻類であることを特徴とする請求項9記載の珪藻類の回収装置。
- 上記Naviculaceae(フナガタケイソウ科)に属する珪藻類は、Fistulifera属、Mayamaea属、Navicula属、及びSeminavis属からなる群から選ばれる1つの属に属する珪藻類であることを特徴とする請求項14記載の珪藻類の回収装置。
- 上記珪藻類は、Fistulifera solarisであることを特徴とする請求項9記載の珪藻類の回収装置。
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