KR101406039B1 - 신규한 미세조류 노스톡 ｋｎｕａ００３ 균주 및 이로부터의 알칸, 지방 알코올 및 지방산 생산 방법 - Google Patents

신규한 미세조류 노스톡 ｋｎｕａ００３ 균주 및 이로부터의 알칸, 지방 알코올 및 지방산 생산 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 신규한 미세조류 노스톡 KNUA003 (Nostoc sp . KNUA003 ) 균주(KCTC 12063BP) 및 이로부터 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지 Ｃ18의 지방산의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명의 노스톡 KNUA003 균주는 에스테르교환반응을 필요로 하지 않으면서 연료로서 직접 사용될 수 있는 헵타데칸(C17H36)을 독립영양적으로 생합성할 수 있으며, 지방 알코올(헥사데세놀(C20H40O)) 및 기타 일반적인 미세조류 바이오디젤 구성성분들 (팔미트산(C16:0), 팔미톨레산(C16:1), 레놀레산(C18:2) 및 리놀렌산(C18:3))도 주요 성분들로서 생산한다. 따라서, 본 발명에 따른 Nostoc sp. KNUA003은 바이오 디젤 생산원료로서 유용하게 사용될 수 있다.

Description

신규한 미세조류 노스톡 ＫＮＵＡ００３ 균주 및 이로부터의 알칸, 지방 알코올 및 지방산 생산 방법{Novel Microalgae Nostoc sp. KNUA003 and method for producing alkane, fatty alcohol, and fatty acid from the same}
본 발명은 신규한 미세조류 노스톡 ( Nostoc sp .) KNUA 003 균주 및 이로부터 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 생산하는 방법에 관한 것이다.
인류는 무분별한 화석연료 사용으로 지구온난화와 에너지원 고갈이라는 이중고에 직면하고 있어 재생 가능한 지속적 에너지 자원에 대한 전 세계적인 요구는 매년 지수적으로 증가되고 있다. 국내에서도 최근 신·재생에너지 개발에 적극 적으로 나서고 있지만 아직까지는 시작 단계이다. 바이오에너지는 화석에너지와는 달리 이산화탄소를 발생시키지 않는 친환경적 에너지로서, 이산화탄소와 태양에너지를 포획하는 광합성 과정을 통하여 에너지가 축적된 유기 탄소 화합물이 생성되고 이렇게 해서 저장된 바이오매스로부터 에너지를 추출하는 것이다.
바이오에너지는 재생가능하며 유해성분이 거의 없는 비독성 에너지이고, 미생물에 의해 완전히 분해되며 이산화탄소를 고정해서 생산되므로 온실효과를 감소시킨다. 현재 육상자원을 이용한 바이오에너지 연구가 진행되고 있으나, 식량자원 및 식량 재배면적과의 경쟁 등 육상자원 이용의 한계점이 드러나면서 해양자원(미세조류 및 해조류)을 이용하고자 하는 정책과 연구들이 전 세계적으로 시작되고 있다.
바이오에너지는 대표적으로 바이오에탄올/부탄올과 바이오디젤이 있는데, 거대조류(macroalgae)를 중심으로 바이오에탄올/부탄올의 생산 연구가 진행되고 있으며, 미세조류(microalgae)를 중심으로 바이오디젤 연구가 진행되고 있다.
특히, 남조류(cyanobacteria)를 포함하는 미세조류들은, 육지 공급원들에 비해 더욱 높은 광합성 효율 및 오일 수율로 인해 바이오연료 생산에 매력적인 후보가 되고 있다 (Huntley and Redalje 2007; Li 등 2008).
바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산(fatty acid)의 트랜스에스테르화 (transesterification) 과정에 의해 메틸 에스터 또는 에틸 에스터 형태로 생산되며 부산물로 글리세롤이 생성된다. 바이오디젤(biodiesel)은 페트로디젤(petrodiesel)과는 달리 연소될 때 배출되는 독성물질이 현저하게 낮은 친환경적 에너지이다.
미세조류의 태양에너지 이용 효율은 5%로, 육상식물의 0.2%에 비해 약 25배 정도 높으며, 이산화탄소 고정화 속도는 소나무의 15배로 매우 효율적이다. 현재 미세조류는 사료나 생물학적 비료로 이용될 뿐 아니라, 다양한 건강식품으로 이용되고 있다. 미세조류는 현미경적 크기로 육상식물과 비슷한 광합성 메커니즘을 가지지만, 물과 이산화탄소와 다른 여러 영양분의 접근이 효율적인 수중환경에서 서식하므로 태양에너지를 바이오매스로 전환함에 있어서 더욱 효과적이다.
최근 해외에서도 미세조류를 이용한 바이오디젤 생산 연구가 활발하게 진행되고 있다. 2007년 12월에는 세계적 정유회사인 Shell사와 HR Biopetroleum이 공동으로 바이오디젤 생산을 목적으로 미세조류 배양 시설을 하와이에 설치하였으며, 2008년 1월에는 미국의 Solazyme사가 Soladiesel이라고 하는 시제품을 Mercedes-Benz의 디젤자동차에 제공하여 성능을 시험하기로 하였다고 발표하였고, Chevron사는 Solazyme사와 협약을 맺고 공동 기술 개발을 하기로 하였다. 최근 프랑스에서는 3년간 280만 유로의 예산을 Shamash 프로그램에 배정하여 해조류 활용에 대한 활발한 연구를 추진 중이며, Shamash 프로그램은 국립연구청이 실현 가능한 생산모델의 개발을 위해서 프랑스 대학의 7개 연구팀을 구성하여 미세조류에서 나온 지방산의 생산과 함께 이를 바이오에너지로 변형하는 연구를 수행 중에 있다.
국내에서도 중소업체를 중심으로 바이오디젤 생산 공정 기술 개발, 바이오디젤 에너지의 발굴 등의 연구를 하고 있으며, 현재 해조류를 이용한 바이오디젤 생산에 대한 연구를 진행 중에 있다. 그러나, 극복되어야만 할 다수의 기술적 장벽들이 여전히 많이 존재하고 있다.
미세조류 바이오디젤 생산에서 가장 큰 과제들 중 하나는 전체 생산 에너지 소비의 90%에 달하는 지질 추출 비용을 감소시키는 것이다(Lardon 등 2009). 조류 바이오디젤은 산성 또는 염기성 촉매 존재 하에서 알코올을 이용한 조류 오일의 에스테르 교환 반응에 의해 수득되는 것이 일반적이다 (Meher 등 2006; Demirbas 2007; Johnson & Wen 2009). 메탄올은, 그 낮은 비용으로 인해, 이 공정에서 가장 흔하게 사용되는 알코올인데(Demirbas 2005), 저렴한 메탄올조차도 바이오디젤 생산에서의 총 에너지 소비의 47%를 차지하는 것으로 보고되어 왔다(de Souza 등 2010). Schirmer 등 (2010)의 최근 연구는 일부 남조류 균주가 펜타데칸(C15H32) 및 헵타데칸(C17H36)과 같은 알칸계 탄화수소를 천연적으로 생산할 수 있음을 보여주었다. 페트로디젤은 8개에서 약 20개의 탄소 원자들을 갖는 알칸들의 혼합으로 구성되므로, 이들 남조류에서 합성된 알칸들은 트리글리세리드들을 액상 탄화수소로 전환하지 않고 바이오디젤로서 직접 사용될 수 있으며, 따라서 석유 연료를 대체가능한 후보로서의 역할을 할 수 있을 것이다.
이에, 본 발명자들은 사상체를 이루는(filamentous) 질소고정 남조류 Nostoc sp. KNUA003을 한국 대청호에서 여름철 녹조 시료(summer bloom sample)로부터 무균적으로 분리하였으며, 이 남조류는 최적 성장 조건 하에서 헵타데칸 뿐 아니라 미세조류 바이오디젤 구성성분들을 독립영양적으로 생산할 수 있음을 보여주어 바이오디젤 원료(biodiesel feedstock)로서 바이오에너지 생산에 기여할 것으로 기대된다.
본 발명의 목적은 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 생산하는 신규한 미세조류 노스톡 sp. KNUA003을 제공함에 목적이 있다. 상기 KNUA003은 에스테르교환반응을 필요로 하지 않으면서 연료로서 직접 사용될 수 있는 헵타데칸(C17H36)과 같은 알칸계 탄화수소를 독립영양적으로 생산할 수 있으며, 지방 알코올(헥사데세놀(C20H40O)) 및 기타 일반적인 미세조류 바이오디젤 구성성분들(팔미트산 (C16:0), 팔미톨레산 (C16:1), 레놀레산 (C18:2) 및 리놀렌산(C18:3))도 주요 지방산으로서 KNUA003 균주에 의해 생산된다.
또한 본 발명은 상기 신규 노스톡 KNUA003 균주로부터 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산의 생산방법을 제공함에 목적이 있다.
본 발명은 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지 Ｃ18의 지방산을 생산하는 미세조류인 노스톡 KNUA003(Nostoc sp . KNUA003 ) 균주 (KCTC 12063BP)를 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 노스톡 KNUA003(Nostoc sp . KNUA003 ) 균주 (KCTC 12063BP)를 배양하고, 그 배양액으로부터 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 분리하는 것을 특징으로 하는 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산의 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 노스톡 KNUA003(Nostoc sp . KNUA003 ) 균주 (KCTC 12063BP)에서 생산된 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 트랜스 에스테르화시켜 지방산 에스테르 및 글리세롤을 생성하는 것을 특징으로 하는, 바이오디젤의 제조 방법을 제공한다.
나아가, 본 발명은 상기 신규 노스톡 KNUA003 균주로부터 생산된 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 트랜스 에스테르화시켜 지방산 에스테르를 생산하는 바이오디젤 제조 방법을 제공함에 목적이 있다.
기존의 미세조류 바이오디젤은 산성 또는 염기성 촉매 존재 하에서 알코올을 이용한 미세조류 오일(algal oil)의 에스테르교환반응에 의해 수득되는 것이 일반적이었으며 이러한 방법에 의할 경우 지질 추출 비용이 매우 크게 소요되는 단점이 있었다. 본 발명은 신규 미세조류 노스톡 sp. KNUA003 균주를 이용하여 기존의 방식으로 바이오디젤을 생산 할 수 있을 뿐만 아니라, 헵타데칸과 같은 알칸계 탄화수소를 천연적으로 생산하여 액상 탄화 수소로 전환하는 과정 없이 직접 바이오디젤을 생산할 수 있는 효과를 가진다.
도 1은 노스톡 KNUA003 (Nostoc sp . KNUA003 ) KCTC 12063BP 균주의 현미경 관찰 결과를 나타낸 도이다.
도 2는 노스톡 KNUA003 (Nostoc sp . KNUA003 ) KCTC 12063BP 균주의 온도 조건에 따른 성장의 차이를 나타낸 도이다.
도 3은 노스톡 KNUA003 (Nostoc sp . KNUA003 ) KCTC 12063BP 균주의 pH 조건에 따른 성장의 차이를 나타낸 도이다.
도 4는 노스톡 KNUA003 (Nostoc sp . KNUA003 ) KCTC 12063BP 균주의 염도 조건에 따른 성장의 차이를 나타낸 도이다.
도 5는 노스톡 KNUA003(a), 노스톡 PCC6720(b), 노스톡 PCC7120(c)의 GC/MS 분석 결과를 나타낸 도이다.
도 6은 노스톡 KNUA003에 의해 생산된 헵타데칸(a)과 헥사데세놀(b)의 electron impact (EI) mass spectra를 나타낸 도이다.
본 발명은 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 생산하는 미세조류인 노스톡 KNUA003(Nostoc sp . KNUA003 ) 균주 (KCTC 12063BP)를 제공한다.
상기 노스톡 KNUA003 (Nostoc sp . KNUA003 ) 은 2009년 9월 대청호(36°22'N, 127°28'E)에서 채집한 후, 한천 상에 획선접종(streaking)하여 형성된 단일 콜로니를 선발하여 16S rRNA, phycocyanin(PC) 및 rbcLX 유전자 서열 분석을 통하여 동정하였다. 상기 남조류 노스톡 KNUA003 (Nostoc sp . KNUA003 )균주는 한국생명공학연구원(KCTC)에 2011년 11월 9일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 12063BP).
상기 노스톡 KNUA003 균주는 알칸계 탄화수소, 바람직하게는 헵타데칸(C17H36)을 생산한다. 또한, 상기 노스톡 KNUA003 균주는 주요 지방산으로서 탄소수가 16이며 이중결합수가 0 또는 1인 지방산 (16:0, 16:1 지방산) 및 탄소수가 18이며 이중 결합수가 2 또는 3인 지방산 (18:2, 18:3 지방산)을 생산하는 것을 특징으로 한다. 또한, 상기 노스톡 KNU003 균주는 C20의 지방 알콜, 바람직하게는 헥사데세놀을 생산한다.
또한, 본 발명은
1) 노스톡 KNU003 균주를 배양하는 단계;
2) 상기 1) 단계에서 얻은 배양액으로부터 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 과Ｃ18의 지방산을 추출하는 단계;를 포함하는 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 과Ｃ18의 지방산의 생산 방법을 제공한다.
상기 균주의 성장 조건으로, 배양 온도는 15℃에서 30℃, 배양 pH는 4.0에서 12 그리고 0.2M 이하의 NaCl 하에서 배양될 수 있다. 균주 배양 배지는 당업계에서 일반적으로 통용되는 배지를 이용할 수 있다.
균주 배양액으로부터 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 추출하는 방법은 당업계에 공지된 임의의 방법을 이용할 수 있다. 상기 추출용매는 펜탄, 핵산, 사이클로헥산, 톨루엔, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 크로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다.
또한, 본 발명은 노스톡 KNU003 균주로부터 생산된 트라이글리세리드를 트랜스에스테르화시켜 지방산 에스테르와 글리세롤을 분리하여 바이오디젤을 제조할 수 있다. 상기 지방산 에스테르는 바람직하게는, 지방산 메틸 에스테르 또는 지방산 에틸 에스테르일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 바이오디젤은 바이오매스에 포함된 지방산의 트랜스에스테르화 과정에 의해 메틸 에스테르 또는 에틸 에스테르 형태로 생산될 수 있다. 상기 트랜스에스테르화 과정은 바이오매스에 포함된 지방의 크고 가지를 낸 분자 구조를 정규 디젤 엔진이 요구하는 작고 직선 사슬의 분자로 변형시키는 방법을 말한다. 상기 트랜스에스테르화 과정의 유화제로서 Triton X-100 또는 Tween 60 등을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다. 상기 유화제는 바이오오일의 계면 안정을 도모하고 잘 혼합되도록 하여 반응 수율을 높여서 바이오디젤의 회수 비용을 절약할 수 있게 한다. 또한, 상기 트랜스에스테르화 과정의 반응 촉매제로서 수산화나트륨 또는 수산화칼륨을 사용할 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예>
1. 시료 채집 및 남조류 분리
남조류 시료를 2009년 9월 대청호(36°22'N, 127°28'E)에서 채집하였다. 그 후, 채집한 시료를 실험실로 가져와서 시료 중 1ml를, 250 ug/ml 농도의 사이클로헥사마이드(cycloheximide, Sigma, St. Louis, MO, USA)가 있는 100 ml BG-11 배지(Rippka 등 1979)에 접종하였다. 플라스크들을 25°C에서 160rpm으로 진탕배양하면서, 확연한 바이오매스가 관찰될 때까지 배양하였다.
잘 배양된 배양액(1.5 ml)을 3,000g에서 15분(Centrifuge 5424, Eppendorf, Hamburg, Germany) 동안 원심분리하였다. 원심분리된 펠렛들을 이미페넴(100ug/ml) (imipenem, Choongwae Pharma Corporation, Seoul, 한국)과 사이클로헥사마이드(20ug/ml)를 함유하는 BG-11 한천 상에 획선접종하고, 24시간 동안 암실에서 배양하여 무균 배양물을 분리하였다. 그 후 플레이트들을 광:암(16시간:8시간) 주기로 25℃에서 배양하고 사상체의 성장을 매일 관찰하였다. 플레이트 바깥쪽으로 자라나는 노스톡 사상체들이 나안으로 볼 수 있을 정도로 자랐을 때, 이들을 새로운 BG-11 플레이트들로 무균적으로 접종시켜 오염 세균들로부터 분리하였다(Hong 등 2010). 그 후, 노스톡 사상체를 R2A 및 LB 한천 플레이트들(Becton, Dickinson and Company, Sparks, MD, USA) 상으로 획선접종하고, 암실에서 14일 동안 배양하여 배양물의 무균 상태를 확인하였다. 상기 무균 상태의 배양물을 KNUA003으로 명명하였다.
2. 형태학 및 분자 확인
상기 KNUA003의 형태적 분석을 위하여 20일동안 BG-11 배지에서 질소원 없이 배양하였다. 살아있는 세포들을 수확하여 멸균된 증류수에 현탁시키고, 차등간섭대비(DIC) 광학렌즈가 설치된 Zeiss Axioskop 2 광 현미경 (Carl Zeiss, Standort Gottingen, Vertrieb, Germany) 상에서 400배 배율로 관찰하였다.
결과는 도 1에 나타내었다.
도 1에 나타낸 바와 같이, 균주 KNUA003은 Nostoc. 속의 일반적인 특징들을 가졌다. 상기 미생물은, 염주형태의 영양세포들(vegetative cells)로 구성된 곧거나 약간 굽은 형태의 세포사(trichomes)를 갖는 사상체로 이루어졌으며, 중간(intercalary) 및 말단 이형세포들이 모두 관찰되었다. 색상은 녹색 내지 암녹색이었으며, 밀집하게 응집된 사상체들은 육안으로도 관찰이 가능한 매트(mats)를 형성하였다. 전체적으로, 균주 KNUA003의 형태학적 특징들은 Nostoc. 속에 속한다는 것을 제시하였다.
분자생물학적 접근을 통해 균주의 분류학적 위치를 확인하기 위하여, Nostoc sp .로의 동정은 16S rRNA와 rbcLX, PC-IGS 유전자 서열분석을 실시하였다. 16S rRNA 유전자 단편들의 증폭에, Nubel 등 (1997)에 의해 설명된 프라이머 세트인 CYA106F 및 CYA781R(a) 및 CYA781R(b)을 사용하였다. 파이코사이아닌 암호화 오페론 유전자간 스페이서(phycocyanin encoding operon intergenic spacer: PC-IGS) 영역을 남조류에 특이적인 프라이머쌍인 PCβF 및 PCαR을 이용하여 증폭하였다 (Neilan 등 1995). RuBisCO (리불로오스-1,5-비스포스페이트 카르복실라아제/옥시게나아제) rbcLX의 영역을 프라이머 CW 및 CX를 이용하여, 선행기술에 설명된 것과 같이 증폭하였다(Rudi 등 1998). 본 연구에서 사용된 프라이머들의 합성 및 DNA 서열분석은 Macrogen 사(Macrogen, Seoul, 대한민국)에서 수행하였다. Nostoc sp. PCC 6720은 프랑스 파스퇴르 남조류 균주은행(Pasteur Culture Collection of Cyanobacteria, PCC, Paris, France)으로부터, Anabaenopsis circularis NIES21 및 Nostoc sp. NIES219는 일본 환경연구원 미생물 균주은행(National Institute for Environmental Studies, NIES, Ibaraki, Japan)으로부터 각각 구입하였다. 본 연구에서 얻어진 DNA 염기서열들을 NCBI 데이터베이스에 제출하고 이들의 기탁 번호들을 표 1 및 2에 나타내었다.
16S rRNA 서열 데이터에 근거하여, 균주 KNUA003은 Nostoc sp. PCC6720, Anabaenopsis circularis NIES21 및 Nostoc sp. HK-01 (Nostoc sp. NIES2109와 동일한 균주) 균주들과 100%의 염기서열 상동성을 보였다. 하지만, 가변 영역이 적은 16S rRNA 유전자의 특성으로 인해 PC-IGS 및 RuBisCO rbcLX와 같은 다른 유전자 영역들을 분석하였으며, 그 결과 Nostoc sp. KNUA003에 가장 유사하게 연관된 남조류인, Nostoc sp. PCC6720 만을 추가의 분석을 위해 선발하였다.
KNUA003의 16S rRNA, rbcLX, PC-IGS 블라스트 검색(BLAST Search) 결과
마커
유전자		 접근번호 Closest match
(GenBank 접근번호)		 중첩
(%)		 시퀀스
유사성
(%)
16S rRNA JF740671 Nostoc sp. PCC6720 (DQ185240)
Anabaenopsis circularis NIES21 (AF247595)
Nostoc sp. HK-01 (AB085687)a 		100
100
100		 100
100
100
PC-IGS JF740672 Nodularia spumigena KNUA005 (HM241946) 100 86
RuBisCO
rbcLX		 JN251745 Nostoc sp. PCC6720 (DQ185297) 72 100
Nostoc sp. HK-01는 Nostoc sp. NIES-2109와 동일한 균주.
16S rRNA, PC-IGS, RuBisCO rbcLX 염기서열 비교 결과
남조류 Nostoc sp. KNUA003 와 염기 서열 비교
16S rRNA
 PC-IGS
 RuBisCO rbcLX
Nostoc sp. PCC6720 100% 상동
(DQ185240)		 1 bp 다름
(JF740673)		 100% 상동
(JN251746)
Anabaenopsis circularis NIES21 100% 상동
(AF247595)		 1 bp 다름
(JF740674)		 2 bp 다름
(JN251747)
Nostoc sp. NIES2109 100% 상동
(AB085687)		 1 bp 다름
(JF740675)		 1 bp 다름
(JN251748)
3. 균주 KNUA 003의 생리학적 특성
균주 KNUA 003의 생리학적 특성을 확인하기 위하여, 온도, pH, 염도 및 탄소원을 달리하면서 실험을 진행하였다. 20일 된 균주 KNUA003의 종균 배양액(Seed culture 1 ml)을, 3회 반복으로, BG-11 배지(100ml) 내에 접종시키고, 20일 동안 배양하였다. 배양물의 최적 온도를 알기 위하여, 균주 KNUA003의 생존 및 성장을 5, 10, 15, 20, 25 및 30℃에서 관찰하였다. 염도 및 산성 내성 시험은 최적 생장 온도인 25℃에서 수행하였다. 염도 및 산도는, 각각 0.1, 0.2, 0.3 및 0.4 M 염화나트륨(NaCl)과 3.0에서 13.0의 pH범위였다. 대체 탄소원(alternative carbon source) 이용성 시험도 역시 25℃에서 글루코오스, 수크로오스, 프럭토오스, 리보오스, 나트륨 아세테이트, 글리세롤 및 글리콜산을 이용하여, Miura and Yokota (2006)에 기재된 대로 실시하였다. 배양물의 광학 밀도를 Optimizer 2120UV 분광기(Mecasys Co. Ltd., Daejeon, 대한민국)에서 750nm에서 측정하여 균주 KNUA 003 밀도를 측정하였다.
결과는 도 2 내지 도 4, 및 표 3에 나타내었다.
균주 KNUA 003의 생리학적 특징
생리학적 요소 성장
온도
pH
NaCl 내성
대체 탄소원 이용성:
글루코오스(Glucose)
수크로오스(Sucrose)
리보오스(Ribose)
아세테이트(Acetate)
프룩토오스(Fructose)
글리세롤(Glycerol)
글리콜산(Glycolic acid)
질소-프리-매질		 15 ℃~30℃
pH 4 ~pH 12
Up to 0.2 M

×
×
×
×
○
×
×
×
도 2 내지 도 4, 및 표 3 에 나타낸 바와 같이, 균주 KNUA003의 최적 성장 온도는 25℃였으나, 20℃ 및 30℃에서도 성장가능하였다. 그러나, 이 미생물은 10℃ 이하에서는 생존할 수 없었으며, 15℃에서의 배양에서는 현저히 지연된 성장이 관찰되었다. 성장 pH는 pH 4.0부터 12.0 범위였으며, 최적 pH는 pH 7.4였다. 균주 KNUA003은 0.2 M보다 높은 NaCl 농도는 견딜 수 없었다. 균주 KNUA003이 프럭토오스를 대체 탄소원으로 이용할 수 있는 특성이 관찰되었다.
4. GC/MS 분석 결과 확인
GC/MS 분석을 위하여, Nostoc sp. KNUA003을 두 개의 비교 균주들, Nostoc sp. PCC6720 및PCC7120과 함께 3 회 반복으로 BG-11 배지(pH 7.4)에 접종하고, 25℃에서 20일 동안 배양하였다. 세포들을 3,220 g (Centrifuge 5810R, Eppendorf, Hamburg, Germany)에서 원심분리하여 수확하고, 일부 수정된 블라이-다이어(Bligh-Dyer)법(Lee 등 2010)을 이용하여 미세조류 지질을 추출하였다. 구체적으로, 클로로포름:메탄올(2:1) 용매 혼합물을 이용하여 동결건조된 남조류 바이오매스로부터 지질 성분을 추출하였다. 지질과 메탄올간의 에스테르교환반응에 의하여 바이오디젤을 수득하였으며, 수산화칼륨 (KOH)이 기본 촉매로서 사용되었다. 배양물의 지방산 조성을, 한국 기초과학연구센터(Korea Basic Science Institute (KBSI)) 대구센터에서, GC/MS (Agilent 6890N GC가 장착된 Jeol JMS700 질량 분광기)로 측정하였다. Nostoc sp. PCC7120는 헵타데칸을 생합성하는 것으로 알려져 있으므로 이 균주를 헵타데칸 생산 및 분석에 대한 양성 대조 균주로서 포함시켰다. 또한, 균주 Nostoc sp. PCC6720도 선택되었는데, 이 균주가16S rRNA, PC-IGS 및 RuBisCO rbcLX (표2)로부터의 분자적 증거에 기초하여 균주 KNUA003에 가장 가깝게 연관되었기 때문이다.
결과는 도 5, 도 6 및 표 4에 나타내었다.
Nostoc sp. KNUA003, PCC6720 그리고 PCC7120의 알칸, 지방산, 지방알코올 조성 성분
성분 KNUA003(%) PCC6720(%) PCC7120(%)
Heptadecane (C17H36) 14.5 ±7.1 19.1 ±9.7 1.3 ±0.3
Myristic acid (C14H28O2 = C14:0) 0.3 ±0.1 0.3 ±0.2 0.2 ±0.0
Heneicosane (C21H44) 2.7 ±1.7 1.5 ±1.2 2.0 ±1.2
Palmitoleic acid (C16H30O2 = C16:1) 17.6 ±3.5 14.0 ±4.5 25.4 ±1.7
Palmitic acid (C16H32O2 = C16:0) 25.1 ±5.7 22.0 ±1.9 25.3 ±4.8
Methyl palmitoleate (C17H32O2) 0.4 ±0.3 1.2 ±0.6 1.1 ±0.3
Heptadecanoic acid (C17H34O2 = C17:0) 0.1 ±0.1 0.8 ±0.1 0.0 ±0.0
Linoleic acid (C18H32O2 = C18:2) 8.5 ±2.4 7.2 ±3.2 13.8 ±1.9
Linolenic acid (C18H30O2 = C18:3) 17.6 ±5.8 15.5 ±5.4 24.5 ±2.8
Oleic acid (C18H34O2 = C18:1) 0.8 ±0.4 0.9 ±0.7 1.3 ±0.2
Hexadecenol (C20H40O) 11.1 ±6.5 13.9 ±4.7 3.9 ±0.7
Strearic acid (C18H36O2 = C18:0) 0.9 ±0.5 2.4 ±0.8 1.1 ±0.4
도 5 및 표 4에 나타낸 바와 같이, GC/MS 결과들은 본 연구에서 시험된 모든 남조류 균주들, Nostoc sp. KNUA003(a), Nostoc sp. PCC7120(b), Nostoc sp. PCC6720(c)은 헥사데세놀(C20H40O)과 함께 헵타데칸(C17H36), 팔미트산(C16:0), 팔미톨레산(C16:1), 리놀레산(C18:2) 및 리놀렌산(C18:3)과 같은 지방산들을 생합성할 수 있음을 확인하였다. 특히, 균주 KNUA003 및 PCC6720은 헵타데칸 및 헥사데세놀을 이들의 주요 지질 성분으로 함유하였다.
도 6에 나타낸 바와 같이, electron impact (EI) mass spectra을 이용하여 노스톡 KNUA003에 의해 생산된 헵타데칸(a)과 헥사데세놀(b)을 확인할 수 있었다.
5. 알칸 생합성에 관련된 유전자의 검출 및 확인
Nostoc sp. KNUA003에서 헵타데칸이 합성되는 것을 확인하기 위하여, 알칸 생합성에 관련된 유전자를 검출하였다.
알데히드 디카르보닐라아제 및 아실-아실 운반 단백질(acyl carrier protein, ACP) 환원효소를 Nostoc sp. KNUA003으로부터 증폭시키기 위하여, 2개의 프라이머 세트들을 이미 전체 염기서열이 알려진 Nostoc sp. PCC7120을 근거로 설계하였다. Nostoc sp. KNUA003에서 두 유전자의 부분 단편들을, 상기 프라이머 세트들에 의해 성공적으로 증폭시켰으며, 이 때 사용된 프라이머 세트들은 각각 alr5283F-3 및 alr5283R, 및 alr5284F-5 및 alr5284R-5 였다. 지놈 워킹-PCR(Genome-walking PCR) (Clontech, Mountain View, CA, USA)을 이용하여 상기 PCR 반응을 통해 부분적으로만 얻어진 각 유전자 염기서열의 앞뒤 서열을 분석하였다. 구체적으로, DNA를 제한 효소들 DraI, EcoRV, PvuII 및 StuI 제한효소로 절단하고, 각각의 DNA 단편들 양 끝에 GenomeWalker 어댑터들(adaptors)을 부착시켰다. 구축된 각 GenomeWalker 라이브러리를 어댑터 프라이머들(AP1 및 AP2) 및 설계된 두 개의 유전자-특이적 프라이머들(GSP1 및 GSP2)을 사용하여 2차례의 nested-PCR 반응을 시켰다. 그 후, 2 차 PCR 생성물들을 아가로오스 젤로부터 잘라내어 분석하였다. 마지막으로, Nostoc sp. KNUA003 및 PCC6720에서의 오픈 리딩 프레임들(Open Reading Frames: ORFs)을 포함하는 전체 (full length)의 알데히드 디카르보닐라아제 및 아실-ACP 환원효소를 프라이머 세트들(KNUA003_5283F 및 KNUA003_5283R 그리고 KNUA003_5284F 및 KNUA003_5284R)에 의해 증폭시켰다. 본 연구에서 사용된 모든 프라이머들은 Primer3Plus 소프트웨어(Untergasser 등 2007)를 사용하여 설계되었으며, 이를 표 5에 나타내었다. 결과는 표 6에 나타내었다.
실험에 사용된 프라이머의 종류
이름 서열 (5'->3') 길이 (bp) 유전자
alr5283F-3
(forward)
서열번호1		 GGG GAA CAA GAA GCA TAC GA 20 partial aldehyde decarbonylase
alr5283R-3
(reverse)
서열번호2		 TTA AGC TGC TGT AAG TCC GT 20 partial aldehyde decarbonylase
alr5284F-5
(forward)
서열번호3		 CTT GCT TTT TAC CGG AGA TGC TAG C 25 partial acyl-ACP reductase
alr5284R-5
(reverse)
서열번호4		 AGA GCA TAG ATT CCG CAA AAC AAG C 25 partial acyl-ACP reductase
5283_GSP1R
(upstream)
서열번호5		 GTA TTC ATC TTT GAC TAC ACC CTC AGT 27 partial aldehyde decarbonylase GSP1
5283_GSP2R
(upstream)
서열번호6		 GAA TCA GTA AGC AAG TGA CAA CGT TAC 27 partial aldehyde decarbonylase GSP2
5284_GSP1F
(downstream)
서열번호7　		 ATA CAC ACA CTG CCT ACA TTA TCT GTC 27 partial acyl-ACP reductase GSP1
5284_GSP2F
(downstream)
서열번호8　		 GAA AGC AAC AGT AGC TAT ATG TGG AG 26 Partial acyl-ACP reductase GSP2
5284_GSP1R
(upstream)
서열번호9　		 TAT AGC TAC TGT TGC TTT CGA CAG TTC 27 partial acyl-ACP reductase GSP1
5284_GSP2R
(upstream)
서열번호10		 GAC AGA TAA TGT AGG CAG TGT GTG TAT 27 partial acyl-ACP reductase GSP2
KNUA003_5283F
(forward)
서열번호11		 CGG TCT GTA CTG TTC TTA ATT CTG G 25 full aldehyde decarbonylase
KNUA003_5283R
(reverse)
서열번호12		 TTA AGC TGC TGT AAG TCC GTA GG 23 full aldehyde decarbonylase
KNUA003_5284F
(forward)
서열번호13		 ATC CCT GTT GCT GAT GAT TTT G 22 full acyl-ACP reductase
KNUA003_5284R
(reverse)
서열번호14		 GAC TTT GCT AAA GCA GCA GAG G 22 full acyl-ACP reductase
Nostoc sp. KNUA003 와 PCC6720의 알데히드 디카르보닐라아제 유전자 및 아실-ACP 환원효소 유전자
유전자 번역된 아미노산 유사도
(접근 번호 / % ID)
Nostoc sp. KNUA003 (접근번호 / 길이) Nostoc sp. PCC6720
(접근번호 / 길이)
알데히드
디카르보닐라아제		 가설적 알데히드 디카르보닐라아제 (JN391509 / 232 amino acids)b 가설적 알데히드 디카르보닐라아제 (JN581686 / 232 amino acids)c 가설적 단백질 Ava_2533 [Anabaena variabilis ATCC29413]
(YP 323043 / 86%) &
가설적 단백질 alr5283
[Nostoc sp. PCC7120]
(NP 489323 / 86%)
아실-ACP
환원효소		 가설적 아실-ACP 환원효소
(JN391510 / 340 amino acids)d 		가설적 아실-ACP 환원효소
(JN581687 / 340 amino acids)e 		가설적 단백질 Ava_2534 [Anabaena variabilis ATCC29413]
(YP 323044 / 91%)
표 6에 나타난 바와 같이, Nostoc sp. KNUA003 (JN391509) 및 PCC6720 (JN581686)에서 알데히드 디카르보닐라제의 번역된 아미노산 서열들은 서로 동일하였으며, 이들의 가장 가까운 매치들은 가설적 단백질 Ava_2533 (YP 323043) [Anabaena variabilis ATCC29413] 및 가설적 단백질 alr5283 [Nostoc sp. PCC7120] (NP 489323)로, 상동성(identity)은 86%이었다. 아실-ACP 환원효소의 경우, Nostoc sp. KNUA003 (JN391510) 및 PCC6720 (JN581687)에서 번역된 아미노산 서열들은 서로 99.7%의 상동성(아미노산 1개 상이)을 보였으며,, 이들의 가장 가까운 매치는 가설적 단백질 Ava_2534 [Anabaena variabilis ATCC29413] (YP 323044)로 나타났고, 동일성은 91%이었다. 이 연구를 통해, KNUA003균주 내에 알칸 생합성 관련 유전자 알데히드 디카르보닐라아제 및 아실-ACP 환원효소 유전자들의 존재를 입증할 수 있었으며, 이 유전자들을 이용하여 알칸을 생합성 함으로써, 바이오연료 생산에 있어 보다 매력적이고 비용 효과적인 공정이 이루어질 수 있을 것으로 생각된다.
한국생명공학연구원 KCTC12063BP 20111109
<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Microalgae Nostoc sp. KNUA003 and method for producing alkane, fatty alcohol, and fatty acid from the same <130> p106 <160> 14 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of partial aldehyde decarbonylase(alr5283F-3) <400> 1 ggggaacaag aagcatacga 20 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of partial aldehyde decarbonylase(alr5283R-3) <400> 2 ttaagctgct gtaagtccgt 20 <210> 3 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of partial acyl-ACP reductase(alr5284F-5) <400> 3 cttgcttttt accggagatg ctagc 25 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of partial acyl-ACP reductase(alr5284R-5) <400> 4 agagcataga ttccgcaaaa caagc 25 <210> 5 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream primer of partial aldehyde decarbonylase GSP1(5283_GSP1R) <400> 5 gtattcatct ttgactacac cctcagt 27 <210> 6 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream primer of partial partial aldehyde decarbonylase GSP2(5283_GSP2R) <400> 6 gaatcagtaa gcaagtgaca acgttac 27 <210> 7 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream primer of partial acyl-ACP reductase GSP1(5284_GSP1F) <400> 7 atacacacac tgcctacatt atctgtc 27 <210> 8 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Downstream primer of Partial acyl-ACP reductase GSP2(5284_GSP2F) <400> 8 gaaagcaaca gtagctatat gtggag 26 <210> 9 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream primer of partial acyl-ACP reductase GSP1(5284_GSP1R) <400> 9 tatagctact gttgctttcg acagttc 27 <210> 10 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Upstream primer of partial acyl-ACP reductase GSP2(5284_GSP2R) <400> 10 gacagataat gtaggcagtg tgtgtat 27 <210> 11 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of full aldehyde decarbonylase(KNUA003_5283F) <400> 11 cggtctgtac tgttcttaat tctgg 25 <210> 12 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of full aldehyde decarbonylase(KNUA003_5283R) <400> 12 ttaagctgct gtaagtccgt agg 23 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Forward primer of full acyl-ACP reductase(KNUA003_5284F) <400> 13 atccctgttg ctgatgattt tg 22 <210> 14 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Reverse primer of full acyl-ACP reductase(KNUA003_5284R) <400> 14 gactttgcta aagcagcaga gg 22

Claims (8)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 1) 노스톡 KNUA003(Nostoc sp . KNUA003 ) 균주 (KCTC 12063BP)를 배양하는 단계; 및
    2) 상기 1)단계에서 얻은 배양액으로부터 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 추출하는 단계;를 포함하는, 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산의 생산방법.
  4. 제 3항에 있어서, 상기 1) 단계에서 균주의 배양 온도는 15℃에서 30℃ 범위인 것을 특징으로 하는 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산의 생산방법.
  5. 제 3항에 있어서, 상기 1) 단계에서 균주의 배양 pH는 4.0에서 12.0 범위인 것을 특징으로 하는 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산의 생산방법.
  6. 제 3항에 있어서, 상기 2) 단계에서 추출 용매는 펜탄, 핵산, 사이클로헥산, 톨루엔, 메틸렌클로라이드, 에틸아세테이트, 아세톤, 크로로포름, 메탄올 및 이들의 혼합용매로 이루어진 군으로부터 선택된 것을 특징으로 하는 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산의 생산방법.
  7. 제 3항에 있어서, 상기 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산은 팔미트산(C16:0), 팔미톨레산(C16:1), 리놀레산(C18:2) 및 리놀렌산(C18:3)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 헵타데칸, 헥사데세놀 및 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산의 생산방법.
  8. 노스톡 KNUA003(Nostoc sp. KNUA003) 균주 (KCTC 12063BP)에 의해 생산된 Ｃ16 내지Ｃ18의 지방산을 트랜스 에스테르화시켜 지방산 에스테르를 생성하는 것을 특징으로 하는 바이오디젤의 제조 방법.
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