KR20190101623A - 옥세노클로렐라 프로토테코이드 mm0011 균주 및 그 용도 - Google Patents

옥세노클로렐라 프로토테코이드 mm0011 균주 및 그 용도 Download PDF

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Abstract

본원은 고농도의 다가불포화지방산 및 포화지방산을 포함하는 지질 생산능, 고농도의 유기물 및 단백질을 포함하는 바이오매스 생산능, 우수한 전질소 및 전인의 제거능, 및 고농도의 루테인 생산능을 갖는 신규한 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주를 개시한다. 본원에 따른 균주는 바이오연료, 기능성식품, 천연색소, 의약용물질, 동물사료, 및 수산양식용 사료 등의 개발에 효과적으로 사용될 수 있다.

Description

옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주 및 그 용도 {Auxenochlorella protothecoides MM0011 and use thereof}
본원은 신규한 미세조류인 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주 및 이의 용도에 관한 것이다.
미세조류는 이산화탄소와 물, 그리고 태양에너지를 이용하여 에너지주요인자인 유기물을 합성하고 산소를 생산하는 광합성 생물이다. 이러한 미세조류는 대기 중 이산화탄소를 고정할 수 있고, 단백질 및 지질함량이 높으므로 식품, 사료 또는 연료 생산용 바이오매스로 활용될 수 있다. 구체적으로, 미세조류의 1차 대사산물인 지질, 당질 또는 단백질 등은 바이오디젤, 바이오에탄올 또는 바이오가스와 같은 다양한 바이오연료의 공급원 및 다가불포화지방산(Polyunsaturated fatty acids, PUFAs)의 원료로도 사용될 수 있고, 미세조류의 2차 대사산물인 비타민, 카로테노이드, 다당류, 루테인 등의 고부가 유용 물질은 기능성식품, 천연색소, 의약용물질, 동물사료, 수산양식용 사료 등으로 이용될 수 있다.
미세조류는 이산화탄소의 저감 효과가 우수하고 식량자원 생산을 위한 농지와 경쟁하지 않으며, 생산수율도 높아 육상식물과 달리 바이오에너지를 위한 최적의 소재로 인식되고 있으나, 이에 대한 연구가 아직 미미한 실정이다.
대한민국 등록특허 제1525319호는 ‘신규한 마이크래티니엄 이너멈 NLP-F014 균주 및 이의 용도’에 관한 것으로 바이오연료를 생산할 수 있는 신규 미세조류가 개시되어 있다.
대한민국 등록특허 제1639467호는 ‘신규한 미세조류 오돈텔라 및 이의 용도’에 관한 것으로 지질 함량이 높은 신규 미세조류가 개시되어 있다.
미세조류는 광합성이 가능하여 이산화탄소의 저감 효과가 우수하고 식량자원과 관련된 정치사회적 문제도 발생되지 않으며, 생산수율도 높아 육상식물과 달리 바이오에너지를 위한 최적의 친환경적 소재라는 장점을 가진다. 따라서 다양한 유용 자원으로 활용가능한 물질의 생산 효율이 높은 신규한 미세조류의 개발이 필요하다.
본원은 불포화지방산, 바이오연료 및 항산화색소 생산능을 갖는 신규한 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주를 제공하고자 한다.
한 측면에서 본원은 서열번호 1로 표시되는 18S rRNA (ribosomal riboucleic acid), 서열번호 2로 표시되는 ITS (internal transcribed spacer) 및 서열번호 3으로 표시되는 rbcL (the large subunit of the ribulose-bisphosphate carboxylase gene)의 염기서열을 갖는 미세조류 옥세노클로렐라 프로토테코이드(Auxenochlorella protothecoides) MM0011 균주를 제공한다.
상기 서열번호 1, 2 및 3의 서열은 본원에 따른 미세조류에 특징적인, 다른 균주와 구별할 수 있는 신규한 서열이다.
일 구현예에서 본원에 따른 균주는 기탁번호 KCTC13291BP로 기탁된 미세조류 옥세노클로렐라 프로토테코이드(Auxenochlorella protothecoides) MM0011 균주이다.
본원에 따른 균주는 고농도의 다중불포화지방산 및 포화지방산을 포함하는 바이오오일 생산능, 고농도의 유기물 및 단백질을 포함하는 바이오매스 생산능, 우수한 전질소 및 전인의 제거능, 및 고농도의 루테인 생산능을 갖는다.
일 구현예에서 본원에 따른 균주는 다중불포화지방산으로서, 특히 오메가-3 및 오메가-6를, 특히 전체 지질 중량의 60% 내지 70%의 함량으로 생산할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 균주는 포화지방산으로서, 특히 팔미트산이, 특히 전체 지질 중량의 약 10 내지 15%의 함량으로 생산할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 균주는 고부가가치 물질인 루테인을 미세조류의 건조 중량 기준으로 약 3.5±0.1 mg·g-1 고농도로 생산할 수 있다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 균주의 바이오매스에 포함된 유기물은 85 중량% 이상이고, 상기 단백질은 50 중량% 이상 포함된다.
또 다른 구현예에서, 본원에 따른 균주는 전질소 및 전인의 제거능은 각각 40% 이상 및 27% 이상이다.
또 다른 구현예에서 본원에 따른 미세조류는 5-35℃의 배양 온도 및 무염은 물론 1.5 M까지 농도의 NaCl 내성을 가진다.
다른 측면에서 본원은 또한 본원에서 규명된 새로운 서열인 서열번호 1로 표시되는 18S rRNA, 서열번호 2로 표시되는 ITS 및 서열번호 3으로 표시되는 rbcL 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주 검출용 핵산을 제공한다.
상기 서열번호 1, 2 및 3의 서열은 본원에 따른 미세조류를 다른 균주와 구별할 수 있는 특징적인 서열로, 본원에 따른 균주의 검출, 분리 또는 동정을 위해, 예를 들면 이로부터 프로브 또는 프라이머를 디자인하여, 합성한 후, PCR (polymerase chain reaction) 또는 혼성화(hybridization) 등의 당업계의 공지된 방법을 이용하여, 본원에 따른 균주의 검출, 분리 또는 동정에 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서 본원은 본원에 개시된 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 미생물 제제를 제공하며, 상기 미생물 제제는 바이오오일 생산, 바이오매스 생산, 루테인 생산, 동물 사료 생산, 또는 전질소 및 전인의 제거용으로 유용하게 사용될 수 있다.
또 다른 측면에서 본원은 본원에 개시된 균주를 지질 생산에 적합한 적절한 조건에서 배양하는 단계; 및 상기 균주로부터 지질을 분리하는 단계를 포함하는 지질 생산 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서 본원은 본원에 개시된 균주를 오·폐수와 배양하는 단계를 포함하는, 상기 오·폐수로부터 질소 및 인의 제거 방법을 제공한다.
또 다른 측면에서 본원은 본원에 개시된 균주를 배양하는 단계; 및 상기 균주로부터 색소를 추출하는 단계; 및 상기 색소로부터 루테인을 분리하는 단계를 포함하는 루테인 생산 방법을 제공한다.
본원에 따른 미세조류는 고농도의 다가불포화지방산 및 포화지방산을 포함하는 지질 생산능, 고농도의 유기물 및 단백질을 포함하는 바이오매스 생산능, 우수한 전질소 및 전인의 제거능, 및 고농도의 루테인 생산능을 갖는 신규한 균주이다. 이러한 본원에 따른 균주는 바이오연료, 기능성식품, 천연색소, 의약용물질, 동물사료, 및 수산양식용 사료 등의 개발에 효과적으로 사용될 수 있다.
구체적으로 본원의 미세조류는 오메가-6 또는 오메가-3와 같은 다가불포화지방산을 생합성할 수 있어 어류 및/또는 식물유래 다가불포화지방산 원료의 대체자원으로 사용될 수 있다. 심혈관 질환 예방에 효과가 있는 오메가-3 불포화지방산은 등푸른생선에 풍부한 것으로 알려져 있지만 실제로는 미세조류가 주로 생산하며 먹이사슬을 통해 이들을 섭취한 생선의 체내에 저장된다. 미세조류 오메가-3 불포화지방산은 어유(魚油) 특유의 비린내가 없고 해양환경 오염으로 인한 중금속 농축의 가능성이 없으며 베건 오메가-3로서의 판매 또한 가능한 장점이 있다. 또한 바이오디젤로 전환이 가능한 포화지방산을 생합성 할 수 있어 바이오연료 생산에 적합하다. 본원의 미세조류는 천연 카로테노이드인 루테인을 고농도로 생합성할 수 있어 식품, 의약품 및 화장품 등의 원료물질로 이용될 수 있다. 루테인은 항산화 카로테노이드의 일종으로 망막 내 황반 색소를 구성하여 자외선이나 청색광으로부터 눈을 보호하는 필터역할을 한다. 루테인 역시 체내 생합성이 불가하여 외부 섭취가 필수적인 성분이다. 이러한 루테인의 특성 때문에 루테인은 가장 빠르게 성장하는 카로테노이드계 색소 중 하나이며 전 세계적으로 연 평균 3.6%의 성장률을 보이며 2018년까지 약 309백만 달러(한화 약 3,358억 원)의 시장이 형성될 것으로 예상되고 있다. 현재 시판되는 대부분의 보충제는 금잔화(마리골드) 꽃에서 추출한 루테인을 사용하고 있으나 루테인 함량이 매우 낮고 추출 시 분리가 어려운 단점이 있어 본 미세조류는 금잔화를 대체할 수 있는 기능성 원료물질로서 활용 가능성을 기대하게 한다. 본원 미세조류의 또 다른 특징은 목질계 바이오매스와 비교하여 휘발성물질과 총발열량이 더 높아, 바이오연료 원료물질로서의 가능성 또한 높다. 또한 단백질 함량이 높아 바이오매스 그 자체로 훌륭한 동물 사료로 이용될 수 있고, 배양액으로부터 전질소 및 전인을 높은 비율로 각각 제거할 수 있어 본원의 분리균주는 오·폐수 처리에도 효과적으로 이용될 수 있다.
도 1은 본원의 일 구현예에 따른 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011의 광학현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 2은 본원의 일 구현예에 따른 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011의 전계방사형 주사전자현미경 사진을 나타낸 것이다.
도 3A는 본원의 일 구현예에 따른 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011의 투과전자현미경 사진을 나타낸 것이다. CHL: 엽록체, M: 미토콘드리온, N: 핵.
도 3B는 본원의 일 구현예에 따른 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011의 세포벽 구조의 확대 사진을 나타낸 것이다. 화살표는 3개의 층으로 구성된 세포 외벽을 표시한다.
도 4는 18S rRNA 염기서열 데이터로부터 해석된 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011과 근연종들 간의 계통적관계를 나타낸 것이다.
도 5는 본원의 일 구현예에 따른 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011의 열중량분석 결과를 나타낸 것이다.
본원은 해수에서 분리하여 동정한 신규한 단세포 녹조류 균주인 옥세노클로렐라 프로토테코이드(Auxenochlorella protothecoides) MM0011 균주 발견에 근거한 것이다.
본원에 개시된 미세조류(microalgae) 옥세노클로렐라 프로토테코이드는 Trebouxiophyceae 강(class)에 속하는 통성(facultative) 종속영양(heterotrophic) 녹조류이다. 본원에 개시된 미세조류의 형태적, 분자적, 및 생화학적 특성을 분석한 결과, 옥세노클로렐라 프로토테코이드에 속하나, 현재까지 국내에서 공식 기록이 없는 미기록종임을 밝혀, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주라 명명하였고, 이를 한국생명공학연구원 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 2017년 7월 13일자로 기탁하였다(기탁번호 KCTC13291BP).
이에 한 측면에서 본원은 기탁번호 KCTC13291BP로 기탁된 신규한 미세조류 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011에 관한 것이다.
본원에 따른 미세조류 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011은 서열번호 1의 18S rRNA, 서열번호 2의 ITS, 및 서열번호 3의 rbcL 유전자서열을 가진다.
따라서 상기 서열은 본원에 따른 균주에만 존재하는 특이적 서열로, 본원에 따른 균주의 검출에 효과적으로 사용될 수 있으며, 이러한 측면에서 본원은 서열번호 1, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 검출용 핵산에 관한 것이다.
본원에 따른 미세조류는 고농도의 다가불포화지방산 및 포화지방산을 포함하는 지질 생산능, 고농도의 유기물 및 단백질을 포함하는 바이오매스 생산능, 우수한 전질소 및 전인의 제거능, 및 고농도의 루테인 생산능을 갖는다.
본원에서 “생산능”이란 미세조류 단위 개체수 또는 단위 건조 또는 습 중량 당 총 지방산 양 증가, 다가불포화지방산의 양의 증가, 오메가-3 또는 오메가-6 양의 증가, 또는 생산된 지방산 중 다가불포화지방산의 상대적 비율 증가, 생산된 총 지방산 또는 다가불포화지방산 중 오메가-3 및 오메가-6의 상대적 비율 증가; 또는 미세조류 단위 개체수 또는 단위 건조 또는 습 중량 당 총 바이오매스 양 증가, 유기물 및 단백질의 양의 증가, 또는 생산된 바이오매스 중 유기물 및 단백질 상대적 비율 증가; 또는 미세조류 단위 개체수 또는 단위 건조 또는 습 중량 당 총 색소 양 증가, 루테인 양의 증가, 또는 생산된 색소 중 루테인의 상대적 비율 증가를 포함한다. 상술한 것 중 어느 하나라도 목적하는 유용 물질의 생산증가로 이어질 수 있으며, 예를 들면 상대적 비율이 증가하는 경우에는 목적하는 유용물질 증가는 물론, 농도가 높아지게 되어, 분리가 용이해질 수 있다.
본원의 상기 “바이오매스(biomass)”는 바이오연료 및 유용물질 제조에 사용될 수 있는 미세조류 기인의 유기체 물질을 총칭한다. 이러한 바이오매스는 세포 및/또는 세포 내 물질 뿐만 아니라 세포 외 물질을 함유할 수 있다. 세포 외 물질은 세포에 의해 분비된 화합물을 포함하지만 이에 제한되지 않는다.
본원에서 “바이오연료”는 바이오매스를 자원으로 이용하여 이를 에너지로 전환하여 수득되는 연료로, 고형 바이오연료, 액상 바이오연료(바이오오일, 바이오에탄올/부탄올, 바이오디젤) 및 기체 바이오연료를 포함한다.
본원에 따른 미세조류는 1차 대사산물인 지질, 당질 또는 단백질을 고농도로 함유하고 있어 고형 및 액상 바이오연료의 공급원으로 사용될 수 있다.
일 구현예에서 본원에 따른 미세조류에서 추출된 바이오매스에 포함된 유기물은 85 중량% 이상이고, 고형 바이오연료의 공급원으로 효과적으로 사용될 수 있다. 특히 GCV(gross calorific value, 총발열량)는 20.3 MJ·kg-1로 육상 에너지 작물의 총발열량 수치 범위(17.0-20.0 MJ·kg-1)보다 높았다.
또한 다른 구현예에서 본원에 따른 미세조류는 또한 고농도의 포화지방산을 생산한다. 포화지방산은 이중결합을 가지지 않는 지방산으로, 본원의 일 실시예에서 본원에 따른 상기 미세조류는 16-탄소 포화지방산인 팔미트산(C16:0)이 총 지방산 중량의 약 10% 이상 특히 12.0%로 포함되며, 이는 에스테르교환반응(transesterification)을 통해 바이오디젤과 같은 액상 바이오연료 생산의 원료로 이용될 수 있다.
또한 본원에 따른 균주는 다가불포화지방산의 함량이 높은 것으로 나타났다.
본원에서 “다가불포화지방산(polyunsaturated fatty acid, PFUA)”은 탄소수 18개 이상의 2개 이상의 이중결합(π)을 포함하는 불포화지방산을 의미한다. 오메가-3 또는 오메가-6 불포화 지방산과 같은 다가불포화지방산은 인체 내에서 매우 중요한 기능을 수행하지만, 인체 내에서는 자연적으로 합성되지 않으므로 주로 식품을 통해서 섭취하여야만 한다.
일 구현예에서 본원에 따른 상기 미세조류는 리놀렌산(linoleic acid, C18:2 ω6; Omega-6) 및 α-리놀렌산(linolenic acid, C18:3 ω3; Omega-3)과 같은 다가불포화지방산을 높은 함량으로 함유한다. 일 구현예에서, 상기 불포화지방산은 전체 지질 중량 중 약 60 내지 70%, 특히 67.2%가 포함되어 있다. 따라서 본원에 따른 미세조류는 오메가-3 및 오메가-6 불포화지방산 생산에 이용될 수 있어, 기존의 식물성 오일, 해양 동물 오일(marine animal oil), 어유(fish oils) 및 오일시드(oilseeds)를 대체할 수 있다.
본원에 따른 상기 미세조류는 2차 대사산물로 높은 함량으로 루테인을 생합성할 수 있다. 본원에서 “루테인”은 카로티노이드의 잔토필류(xanthophyll 類) 중에서 가장 다량으로 존재하는 색소로서 잔토필이라고도 한다. 본원 일 실시예에서 본원에 따른 미세조류 MM0011 균주는 건조 중량 기준으로 3.5±0.1 mg·g-1의 루테인 함량을 가진다. 이에 본원에 따른 상기 미세조류는 기능성식품, 천연색소, 의약용물질 등의 원료로 이용될 수 있다.
또한 본원에 따른 미세조류는 배지에서 전질소(total nitrogen) 및 전인(total phosphorus)을 효과적으로 제거할 수 있다.
상기 ‘전질소’는 수중에 포함된 질소화합물의 총량을 말한다. 전질소(TN)는 자연계의 질소순환과정에서 자연수에 포함되어 있으나, 생활하수, 공장폐수, 축산폐수 등과 같은 인위적인 유입에 따라 증가한다. 또한 인과 함께 호수나 연안에서 부영양화에 대한 지표로도 사용하며, 인구의 집중도가 큰 지역의 하천과 호소 등에 많다. 측정방법으로는, 자외선 흡광광도법, 카드뮴환원법, 환원증류-킬달법(합산법) 등이 있다. 생활하수 속에 음식물 찌꺼기 등으로 질소가 포함되어 있으며, 축산폐수에서는 매우 높은 농도의 질소가 함유되어 있다.
상기 ‘전인’은 물속에 포함된 인화합물의 총 농도를 말한다. 상기 전인은 호소, 하천 등의 부영양화를 나타내는 지표 중 하나로 물속에 포함된 인의 농도를 의미한다. 인은 질소와 함께 호소와 같은 폐쇄수역 부영양화에 있어 제한기질로 작용한다. 총인은 입자성 인, 유기성 인, 폴리인산염, 인산염이온 등 수중에 존재하는 인(P)의 총량을 측정한 값을 말하며, 단위는 mg·l-1로 표기한다.
본원의 일 실시예에서 본원에 따른 미세조류는 배양액으로부터 전질소와 전인을 효과적으로 제거할 수 있어 오·폐수 처리에 이용될 수 있다. 본원에서 "폐수"는 세척 수, 세탁 수, 배설물, 소변 및 다른 액체 또는 반액체 폐기물을 일반적으로 함유하는 물의 폐기물을 지칭한다. 이것은 지자체 폐기물뿐만 아니라 2차 처리된 하수의 일부 형태를 포함한다. 또한 ‘오수’는 액체성 또는 고체성의 오염된 물질이 섞여 있는 상태의 물로서 생활이나 사업에 의해 발생되거나 부수되는 배수를 말한다. 소비 생활과 산업 활동을 하는 사회에서 물질적 문명 활동의 부산물로서 각종 폐기물이 끊임없이 배출되는데 그 중에서 액체 형태로 배출되어 하수도로 흘러들어가는 폐기물을 가리키는 말이다. 인간의 일상생활을 하는 데에 쓰이고 난 뒤 발생하는 폐수를 생활하수라고 하고 산업 활동으로 발생한 폐수는 산업폐수라고 한다. 본원에 따른 미세조류는 배양액으로부터 40.5%의 전질소와 27.9%의 전인을 각각 제거할 수 있다.
또한 본원에 따른 미세조류는 높은 단백질 함량을 가지고 있어, 동물사료의 원료가 될 수 있다. 일 실시예에서 본원에 따른 미세조류의 바이오매스는 50% 이상, 특히 51.4%의 높은 단백질 함량을 갖고 있다. 가축의 먹이를 동물사료라고 하며 상기 동물사료에는 동물 사료첨가용 필수 아미노산으로 체내에서 합성되지 않는 영양소를 공급하기 위해 사료에 첨가되는 사료첨가제를 배합한다. 본원에 따른 미세조류의 바이오매스는 사료첨가제로 사용될 수 있다.
다른 측면에서 본원은 또한 본원에 개시된 균주 및/또는 이의 배양액을 포함하는, 미생물제제에 관한 것으로, 이러한 미생물제제는 오메가-3 및/또는 오메가-6을 포함하는 다가불포화지방산의 생산, 바이오연료의 원료가 되는 바이오매스 생산, 루테인 생산, 동물 사료 생산, 또는 전질소 및 전인의 제거용으로 효과적으로 사용될 수 있다.
본원에 따른 균주의 배양액은 본원에 따른 미세조류가 목적하는 적절한 조건에서 배양된 배지로, 상기 배지는 상기 미세조류의 배양에 필요한 영양물질 및/또는 특수한 목적을 위한 물질을 포함한 액체 조성물이며, 배양액은 미세조류가 배양된 후 제거된 것, 또는 미세조류를 포함한 것을 모두 포함한다.
본원에 따른 균주는 미세조류의 배양에 사용되는 다양한 배지에서 배양될 수 있다. 본 발명에서 이용되는 배지는 이에 한정되는 것은 아니나 탄소원 및 질소원을 포함하고 해수 및 염화나트륨을 포함하는 배지에서 수행되는 것이 바람직하며, 상기 탄소원으로는 포도당, 과당, 갈락토스, 글루코스, 글리세롤 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있고, 상기 질소원으로는 글루타민산나트륨, 펩톤, 트립톤, 효모 추출물, 옥수수 침지액, 질산나트륨, 황산암모늄, 구연산 암모늄 또는 이들의 혼합물로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 본원의 일 실시예에서 본원의 미세조류 배양에 상대적으로 저렴한 빈영양배지인 R2A가 사용된다. 또한 상기 본원에 따른 미세조류 배양에 사용되는 배지는 이에 한정되지는 않으나 염화나트륨이 포함되지 않거나 또는 최대 1.5 M까지의 염화나트륨 농도에서 배양될 수 있다. 본원의 미세조류는 해수기원의 특성 상 염화나트륨에 대한 내성이 있으므로 담수에 한정되지 않고 풍부한 해수자원을 배양액으로 사용할 수 있다.
본원에 따른 미세조류는 넓은 온도 범위에서 배양가능하며, 본원의 일 구현에서 5-35℃의 온도에서 배양될 수 있다.
다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 균주를 적절한 온도 및 배지 조건에서 배양하는 단계; 및 상기 균주로부터 지질을 분리하고, 상기 지질로부터 다가불포화지방산을 추출하는 단계를 포함하는 다가불포화지방산 생산 방법에 관한 것이다. 배양 배지 및 온도를 포함하는 배양 방법은 본원에 개시된 것을 참조할 수 있으며, 분리 또는 추출은 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 균주를 적절한 온도 및 배지 조건에서 배양하는 단계; 및 상기 균주로부터 색소를 분리하고, 상기 색소로부터 루테인을 추출하는 단계를 포함하는 미세조류를 이용한 루테인 생산 방법에 관한 것이다. 배양 배지 및 온도를 포함하는 배양 방법은 본원에 개시된 것을 참조할 수 있으며, 분리 또는 추출은 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 균주를 오·폐수와 배양하는 단계를 포함하는, 상기 오·폐수로부터 질소 및 인의 제거 방법에 관한 것이다. 배양을 통한 질소 및 인의 제거 방법은 본원에 개시된 것 및 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.
또 다른 측면에서 본원은 또한 본원에 따른 균주 유래의 바이오매스를 이용한 바이오연료 생산 방법에 관한 것이다. 앞서 언급한 바와 같이 본원에 따른 균주의 바이오매스는 고형 바이오연료 및 액상 바이오연료의 원료가 될 수 있으며, 이로부터 바이오원료를 생산하는 방법은 앞서 언급한 사항 및 당업계의 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있으며, 배양 방법은 본원에 개시된 것을 참조할 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예
실시예 1. MM0011 균주의 동정
시료 채취 및 미세조류 분리
해수시료는 2016년 4월에 한국 경상북도 울릉군 서면 울릉도 거북바위주변 조수웅덩이로부터 채취되었다. 시료는 실험실로 옮겨져서 멸균된 250 ml 플라스크에 100 ml의 BG-11 미세조류 선택배지에 접종하였다. 세균의 생장을 억제하기 위하여 배지에 광범위 항생제인 클로람페니콜과 이미페넴을 각각 100 μg·ml-1의 농도로 첨가해 주었다. 플라스크는 25도에서 형광등을 이용하여 약 40 μmole·m-2·s-1의 광량을 주어 16시간:8시간(낮:밤) 조건으로 미세조류 생장이 확연할 때까지 정치(靜置)배양을 실시하였다. 1.5 ml의 미세조류 배양액을 3,000× g 에서 3분간 원심분리하여 미세조류 바이오매스를 확보하였다. 원심분리된 미세조류 펠렛은 20 μg·ml-1 농도의 이미페넴을 함유한 R2A 한천배지에 획선분획하여 접종하여 상술한 배양조건과 동일한 환경에서 배양하였다. 단일 집락을 새로운 R2A 한천배지 상에 무균적으로 획선분획하였으며 무균적 배양체가 얻어질 때까지 이 과정을 되풀이 하였다.
형태적 동정
순수분리한 미세조류 배양체는 R2A 배지에서 8일간 배양하였다. 살아있는 세포를 3,000× g 에서 3분간 원심분리하여 수확한 뒤 멸균증류수를 이용하여 3회 세척한 후 Zeiss Axio Imager.A2 광학현미경을 이용하여 1,000× 배율로 관찰하였다. 주사전자현미경 관찰을 위해, ml 당 약 1,000 세포의 농도로 10 ml의 배양액을 준비하여 최종농도 2% (v/v) 사산화오스뮴으로 10분간 고정하였다. 고정된 세포는 3 μm의 공극 크기를 가진 폴리카보네이트 멤브레인 필터에 수집하여 증류수로 세 차례 세척하여 배지의 성분을 제거하였다. 멤브레인 필터는 에탄올을 단계별(10, 30, 50, 70, 100% 및 100% 2회)로 각 2분씩 처리하여 탈수과정을 진행하였으며, 초임계건조기로 건조한 시료를 알루미늄 스터브에 올려놓고 저진공 coater를 이용하여 금-팔라듐 코팅을 실시하여 전계방사형 주사전자현미경으로 세포 표면의 형태적 특성을 관찰하였다.
투과전자현미경 관찰을 위해 10 ml의 배양액을 준비하여 최종농도 2.5% (v/v) 글루타알데히드로 2시간 동안 고정하였다. 고정된 세포는 10 ml 용량의 원심분리용 시험관으로 옮겨져 1,610× g 에서 10분간 원심분리 하였다. 원심분리된 미세조류 펠렛은 1.5 ml 용량의 미량원심분리기용 시험관으로 옮겨져 0.2 M 농도의 pH 7.4의 카코딜산나트륨 완충용액으로 수 차례 세척한 후 최종농도 1% (v/v) 사산화오스뮴으로 1시간 30분간 2차 고정하였다. 고정된 펠렛은 한천 사이에 embed시켜 에탄올을 단계별(50, 60, 70, 80, 90%, 100% 및 100% 2회)로 처리하여 탈수과정을 진행하였다. 탈수한 펠렛은 Spurr’s resin에 embed시킨 후 초박절편기를 이용하여 박막을 준비한 후 3% (w/v) 아세트산우라닐과 납 시트레이트로 염색하였다. 박막시료는 H-7650 투과전자현미경으로 100 kV에서 관찰하였다.
분자생물학적 동정
분자생물학적 분석을 위해, genomic DNA를 DNeasy Plant Mini kit를 이용하여 추출하였다. White 등에 의해 보고된 NS1/NS8 및 ITS1/ITS4 프라이머가 18S rRNA와 ITS 단편을 증폭하기 위하여 각각 사용되었다. MM0011 균주의 18S rRNA 염기서열을 이용하여 계통관계분석은 MEGA ver. 6.0 소프트웨어 패키지를 사용하여 실시하였다. MM0011의 옥세노클로렐라 및 클로렐라 근연종들의 염기서열은 미국 국립생물정보센터(NCBI) 데이터 베이스에서 다운로드하여 ClustalW를 이용하여 정렬하였다. 베이시안 정보 기준에 근거하여 best-fit nucleotide substitution model인 Kimura 2-parameter를 선택하였다. 이 모델을 사용하여 1,000회의 부트스트랩 반복을 거쳐 최우도 계통수를 작성하였다. rRNA 염기서열의 높은 보존성 때문에 RuBisCO rbcL 엽록체 유전자를 Verbruggen 등이 제안한 rbcL 7F 및 rbcL 1391R 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 모든 유전자 분석은 3회 반복으로 실시하였으며 본 연구를 통해 얻어진 염기서열 정보는 미국 국립생물정보센터 데이터 베이스에 MF040300, MF040301 및 MF043910으로 등록하였다(표 1). 하기 표 1는 MM0011 균주의 18S rRNA, ITS, 및 rbcL 유전자의 서열을 이용한 BLAST 검색 결과를 나타낸 것이다.
[표 1]
Figure pat00001
상기 세포는 단세포성이고(solitary), 비운동성이며, 약 3-4 ㎛의 지름을 가진 둥근 모양이다(도 1, 및 도 2). 상기 세포벽은 3개 층으로 이루어져 있으며(도 3B) 뚜렷한 컵 모양의 엽록체가 존재하였다(도 1, 및 도 3). 또한 분리주는 엽록체에 피레노이드가 결핍되어 있었다(도 3A). 종합적으로 보면, MM0011 균주는 A. protothecoides 종의 전형적인 형태적 특징을 가지고 있었다. 18S rRNA, ITS region, 및 rbcL 유전자를 순차적으로 분석한 분자생물학적 특징 또한 분리주가 A. protothecoides에 속하는 것으로 나타났으며; 모든 결과가 이와 일치하였다(상기 표 1, 도 4).
따라서, 본원의 해양 미세조류는 옥세노클로렐라 프로토테코이드(Auxenochlorella protothecoides) MM0011로 동정되었다. 상기 분리주는 기탁번호 KCTC13291BP로 생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures)에 기탁하였다.
실시예 2. 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주의 배양조건
온도 및 염화나트륨 내성 테스트 : R2A 한천 사면배지에 주기적인 계대배양을 통해 옥세노클로렐라 프로토테코이드의 순수배양체를 유지하였다. MM0011 균주의 단일 집락을 R2A 한천배지에 3반복으로 획선분획하여 14일간 배양하였다. 5-35도(5도 간격)의 범위에서 MM0011 세포의 생존과 생장을 조사하여 최적 생장온도를 결정하였다. 염화나트륨 내성 테스트는 20도에서 R2A 한천배지를 이용하여 실시하였으며 0.0 M, 0.5 M, 1.0 M, 1.5 M 및 2.0 M 농도의 염화나트륨을 첨가하여 실험을 실시하였다.
상기 실험 결과, 상온조건(ambient temperature)에서 최대 성장이 관찰되었다(표 3). 낮은 온도에서는 성장이 억제되는 것이 관찰되었다. 또한 상기 분리주는, 비록 NaCl 존재시에는 성장이 더딘 것이 관찰되긴 하였지만, 1.5 M NaCl 농도까지의 염화나트륨에 내성이 있는 것으로 나타났다. 하지만, 2.0 M NaCl에서는 생존하지 못하였다. 하기 표 2은 다양한 온도 및 NaCl 농도에서의 MM0011 균주의 생장을 나타낸 것이다.
[표 2]
Figure pat00002
실시예 3. 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주의 지질 함량 분석
본원에서 분리된 균주의 지질함량을 가스크로마토그래피를 이용하여 다음과 같이 분석하였다.
구체적으로 분리균주는 R2A 배지에서 20도에서 진탕배양기를 이용하여 160 rpm으로 종속영양적으로 8일간 배양하였다. 지질 분석을 위해 바이오매스는 2,063 g에서 원심분리하여 바이오매스를 수확하였다. 시료는 지질추출의 효율을 높이기 위해 동결건조한 후 균질화시켰다. 지질 추출은 Breuer 등 (Breuer, G. et al. 2013. J. Vis. Exp. 80, e50628)에 의해 개발된 방법을 사용하였다. 지방산 조성은 5975C mass selective detector가 장착된 7890A gas chromatograph (Agilent, USA)를 이용하여 분석하였다. 지질 분석에는 DB-FFAP 컬럼(30 m, 250 μm ID, 0.25 μm film thickness; Agilent)을 사용하였다. 최초의 GC 오븐 온도는 50℃에서 시작하여 1분간 유지시켰다. 온도는 200도까지 분당 10도씩 30분간 상승시켰으며 이후 240도까지 분당 10도씩 상승시켜 20분간 유지시켰다. 시료는 20:1의 분할비로 1 μl를 주입하였다. 헬륨이 분당 1 ml의 유속으로 이동 가스로 사용되었다. 질량분석 인자들은 다음과 같다: injector 온도: 250도 / source 온도: 230도, electron impact mode는 70 eV의 acceleration voltage가 acquisition range 50-550 m·z-1에서 시료의 이온화를 위해 사용되었다. 지방산의 동정은 Wiley/NBS libraries의 mass spectra와 비교하여 match value가 90% 이상이 되는 결과만 유효한 것으로 판정하였다.
분석 결과, 3가지 측정치의 평균 ± 표준편차를 기초로 하여, A. protothecoides의 FAME 프로파일을 하기 표 3에 나타내었다. 본원에서 분리된 균주의 주요 지방산은 C16:0 (12.0%±0.5%), C18:2 ω6 (27.6%±0.1%), 및 C18:3 ω3 (39.6%±0.6%)이었다. 또한, C16:1 ω7 (3.2%±0.1%), C18:1 ω9 (2.5%±0.3%), 및 C16:2 ω6 (0.5%±0.0%)와 같은 불포화지방산도 상기 광합성 미생물에서 탐지되었다. 하기 표에서 함량%는 추출된 지질을 기준으로 한 것이다.
[표 3]
Figure pat00003
MM0011 균주의 세포내 지방산을 분석한 결과, 팔미트산인 C16:0 포화지방산(SFA), 및 불포화지방산으로서 오메가 6인 C18:2 (27.6%) 및 오메가 3인 C18:3 (39.6%) 불포화지방산이 풍부한 것으로 나타났다. 수많은 연구에서, 이들 필수 불포화지방산은 건강상 잇점이 많아 다양한 상업적 제품이 전세계적으로 많이 이용되고 있다. 오메가-3 불포화지방산은 흔히 어류 오일에서 추출하며, 오메가-6 불포화지방산은 해바라기, 옥수수 및 콩 기름과 같은 식물자원에서 우선적으로 얻고 있다. 따라서 본원의 분리균주는 어류- 및/또는 식물-유래 자원의 대체제로 사용될 수 있다. 또한, 16-탄소 포화 팔미트산은 바이오연료 생산에 유용하게 사용될 수 있다.
실시예 4. 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주의 루테인 생산능 분석
본원에 따른 균주의 유용 색소 성분을 고속액체크로마토그래피로 분석하였다. 이를 위해 색소추출은 Zapata 등(Zapata, M. et al. 2000. Mar. Ecol . Prog . Ser. 195, 29-45)에 의해 개발된 방법을 사용하여 실시하였다. 구체적으로 1 mg의 동결건조된 본원 균주의 바이오매스에서 90% HPLC 등급 아세톤을 이용하여 광합성 색소를 추출한 후 공극 크기 0.2 μm의 Whatman PTFE 주사기 필터로 주입 전에 필터링해 주었다. 시료는 Discovery C18 컬럼(25 cm × 4.6 mm, 5 μm)이 장착된 Agilent 1260 Infinity HPLC system을 이용하여 33도에서 분석하였다. 이동상 gradient는 Sanz 등에 의해 보고된 방법을 이용하여 1 ml·min-1의 유속을 유지하며 메탄올: 225 mM 아세트산 암모늄(82:18, v:v)을 용매 A로 에탄올을 용매 B로 프로그램 시켰다(하기 표 4). HPLC 등급의 메탄올과 에탄올은 J. T. Baker사 제품을 사용하였으며, HPLC 등급 아세트산암모늄은 Fluka사의 제품을 구입하여 사용하였다. 주입 직전에 HPLC 등급의 물(Fisher사) 0.32 ml를 0.8 ml의 시료에 첨가시켜 초기 피크의 왜곡을 방지하였다. 표준물질 색소(클로로필 a, 클로로필 b 및 루테인)은 Sigma-Aldrich사에서 구입하였다. 루테인 함량은 검량선으로부터 피크 영역을 계산하여 정량하였다. 하기 표 4는 용매 A와 B의 농도구배 프로파일 및 이동상 조성물을 나타낸 것이다.
[표 4]
Figure pat00004
A. protothecoides MM0011의 색소 프로파일은 하기 표 5에 나타나 있다. 그 결과 본원에 따른 분리주의 주요 색소는 클로로필 a (Chl a, 38.4%±0.1%), 클로로필 b (Chl b, 14.4%±0.1%), 및 루테인(31.3%±0.1%)으로 나타났다. 다른 미세 피크는 동정되지 않았다. 균주 MM0011의 루테인 함량은 미세조류 바이오매스 건중량 기준 3.5±0.1 mg g-1 DW으로 높은 것으로 나타났다. 표 5에서 %는 전체 색소 내에서 각 색소의 함량 %를 나타낸 것이다.
[표 5]
Figure pat00005
이는 본원의 분리균주가 루테인을 고농도로 생산능을 갖는 것을 나타낸다. 따라서 본원에 따른 균주는 천연 카로테노이드로, 식품, 의약품 및 화장품에 널리 사용되고 있으며, 최근에는 사람의 눈을 보호하는 기능으로 인해 더욱 관심을 받고 있는 루테인의 생산에 효과적으로 사용될 수 있다.
실시예 5. 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주 바이오매스 성분 분석
본원에 따른 균주의 동결건조된 바이오매스 시료는 막자사발을 이용하여 분쇄한 후 ASTM No. 230 mesh (체눈의 크기 = 63 μm) 정밀표준망체를 이용하여 균질화하였다. 원소분석은 탄소, 수소, 질소 및 황 함량을 결정하기 위하여 Flash 2000 원소분석기를 이용하여 2반복으로 실시하였다. 산소함량 계산은 탄소, 수소, 질소, 황 및 회분의 함량을 100%에서 뺄셈하여 계산하였다. 총발열량은 Friedl 등에 의해 제안된 공식에 의해 추산하였다: [총발열량 = 3.55C2 - 232C - 2,230H + 51.2C × H + 131N + 20,600 (MJ·kg-1)]
근사분석은 DTG-60A 열분석기를 이용하여 수행하였다. 30 mg 알파-알루미나 분말이 기준 물질로 사용되어 백금 팬을 이용하여 약 10 mg의 샘플을 분석하였다. 미세조류 분말이 산화되는 것을 방지하기 위하여 순도 99.999%의 질소가 25 ml· min-1 유속으로 운반 기체로 사용되었다. 시료는 50℃에서 900℃까지 분당 10℃씩 온도를 상승시켜가며 가열시켰다. 열중량분석 결과 데이터는 ta60 Ver. 2.21 소프트웨어로 분석하였다. 단백질 함량은 원소분석 결과에서 나온 질소함량에 6.25의 전환율을 곱하여 계산하였다.
TGA(thermogravimetric analysis)로 실시한 일반성분 분석에서, 수분 함량(moisture content, MC)는 N2 분위기에서 110℃까지의 무게 손실로 결정하였고, 유기물(orgamic matter, OM)은 N2 분위기에서 110-900℃ 사이의 열 분해 결과로 얻은 무게 손실을 말하며, 나머지 무게는 무기물(inorganic matter, IM)을 말한다. TGA 프로파일은 도 5에 나타나있으며, 균주 MM0011의 물질 조성은 표 6에 나타나 있다. 최종 분석에 근거한 GCV(Gross Calorific Value, 총발열량) 및 단백질 함량은 각각 20.3 MJ·kg-1 및 51.4%이었다(하기 표 6).
[표 6]
Figure pat00006
유기물(OM)은 가열하면 가스를 배출하는 고체 연료로 사용될 수 있다. 일반적으로 바이오매스로 사용되는 작물의 바이오매스는 63-80%이며, 나무는 72-78% 이다. 이와 비교하여 본원 미세조류의 OM 함량은 85.6%로 작물 및 나무와 비교하여 상당히 높은 것으로 나타났다. GCV 수치는 또한 육상 에너지 작물의 수치범위(17.0-20.0 MJ·kg-1)보다 높아 목질계 바이오연료 원료를 대체할 수 있는 가능성을 제시하였다. 또한 단백질 함량이 높으므로(51.4%) 바이오매스 그 자체로 훌륭한 동물 사료가 될 수 있다.
실시예 6. 전질소 (total nitrogen, TN) 및 전인(total phosphorus, TP) 소모
0일차와 8일차의 R2A 배지의 전질소와 전인 농도는 HS-TN(CA)-L 및 HS-TP-L 수질 테스트 키트(Humas, Daejeon, Korea)를 제조사의 설명서대로 분석하였다.
R2A에서 각각 40.5%의 TN 및 27.9%의 TP를 미세조류가 제거한 것으로 나타났다(표 7).
[표 7]
Figure pat00007
이러한 결과는 본원에 따른 균주는 배양액으로부터 40.5%의 총질소와 27.9%의 총인을 각각 제거할 수 있음을 나타낸다. 따라서 본원의 분리 균주는 바이오연료 원료물질 생산 및 오·폐수 처리에 효과적으로 사용될 수 있다.
이상에서 본원의 예시적인 실시예에 대하여 상세하게 설명하였지만 본원의 권리범위는 이에 한정되는 것은 아니고 다음의 청구범위에서 정의하고 있는 본원의 기본 개념을 이용한 당업자의 여러 변형 및 개량 형태 또한 본원의 권리범위에 속하는 것이다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
<110> National Marine Biodiversity Institute of Korea <120> Auxenochlorella protothecoides MM0011 and use thereof <130> DP201711005P <160> 3 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1802 <212> DNA <213> Auxenochlorella protothecoides MM0011 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1802) <223> rRNA <400> 1 gtcatatgct tgtctcaaag attaagccat gcatgtctga gtataacctg tttactactg 60 tgaaactgcg aatggctcat taaatcagtt atagtttatt tgatggtacc tgctactggg 120 atacccgtag taattctaga gctaatacct gcgcaaaccc cgactttggt ggaaggggtg 180 tatttattag atccaaggcc gaccgggctc gcccgactcg cggtgactca tgataacttt 240 acgaatcgca tggtctctgc accggcgatg tttcattcaa atttctgccc tatcaacttt 300 gtcggtagga tagaggccta ccgaggtgtt cacgggtgac ggaggatcag ggttcgattc 360 cggagaggga gcctgagaaa cggctaccac atccaaggaa ggcagcaggc gcgcaaatta 420 cccaatcctg acacagggag gtagtgacaa taaataacaa taccgggcct cacaggtctg 480 gtaattggaa tgagtacaat ctaaacccct taacgaggat caattggagg gcaagtctgg 540 tgccagcagc cgcggtaatt ccagctccaa tagcgtatat ttaagttgct gcagttaaaa 600 agctcgtagt cgaacttcgg ggggcccggg ccggtccttt ggcgcggtgg gttcacgccc 660 ccgccctctg cgcactggca ttccggcgcc cccctgttgc tggggacggc gctcctgggc 720 tttgctgtcc ggggcccgga gtcagcgagg ttactttgag taaattagag tgttcaaagc 780 aggcatccgc tctgaataca ttagcatgga ataacatgat aggactctgg cttatcacgt 840 tggtctgtaa gaccggagta atgattgaga gggacagtcg ggggcattcg tatttcattg 900 tcagaggtga aattcttgga tttatgaaag acgaactact gcgaaagcat ttgccaagga 960 tgttttcatt gatcaagaac gaaagttggg ggctcgaaga cgattagata ccgtcctagt 1020 ctcaaccgta aacgatgccg actcgggatc ggtggtcgtt cattcaatga caccaccggc 1080 acctcatgag aaatcaaagt ttttgggttc cggggggagt atggtcgcaa ggctgaaact 1140 taaaggaatt gacggaaggg caccaccagg cgtggagcct gcggcttaat ttgactcaac 1200 acgggaaaac ttaccaggtc cagacatagt gaggattgac agattgagag ctctttcttg 1260 attctatggg tggtggtgca tggccgttct tagttggtgg gttgccttgt caggttgatt 1320 ccggtaacga acgagacctc agcctgctaa atagttttgg ttgcggtttc accccagcct 1380 tgtaagactt cttagaggga ctctcggcga ctagccgagg gaagcttgag gcaataacag 1440 gtctgtgatg cccttagatg ttctgggccg cacgcgcgct acaatgatgc ggtcaacgag 1500 cccagccttg gccgacaggc ccgggtaatc tcgcaacccg catcgtgatg gggatagatc 1560 attgcaatta ttgatcttca acgaggaatg cctagtaagc gcaagtcatc agcttgcgtt 1620 gattacgtcc ctgccctttg tacacaccgc ccgtcgctcc taccgattga gtgtgctggt 1680 gaagtgttcg gattggcagc tcgatcgcgg ttctccgcga ccagcagccg agaagttcat 1740 taaaccctcc cacttagagg aaggagaagt cgtaacaagg tttccgtagg tgaacctgcg 1800 ga 1802 <210> 2 <211> 826 <212> DNA <213> Auxenochlorella protothecoides MM0011 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(826) <223> ITS <400> 2 tccgtaggtg aacctgcgga aggatcattg atttacattg atttttatac agtagtttga 60 ttcagaacac catcacgttg ttgcaacgtg tgacgagttt ttttattgtc aggtggacgc 120 gagtcccctg tcgctctcac acgctgcaca aacccaacaa ccttgaccca accaacccat 180 gcctgaagaa tcatgcgagc gtgcgtacta cccatgtaca cccctcgcca accagagaca 240 actctcaaca acggatatct tggctcccgt atcgacgaag aacgcagcga aatgcgatac 300 gtagtgtgaa ttgcagaatt ccgtgaacca tcgaatcttt gaacgcaact tgcgcccgag 360 gtcctagacc gagggcatgt ctgcctcagc gtcggcttta acccttccat ccagttgttg 420 gatgcattcc gcaactgcct gggacctggc tctcacgacc accaccccgg tggtcgtgtt 480 tgctgaagca cagaggcttg agcgaggacc ccgtttgcag ggcgctggct tggtaggtag 540 gcgaccccta caccacccgc cgacgcccga ggtgtccttg ctggaggccc agcaggaatt 600 gggaggtact ttttggtgag gttggtttgt tggggtgtgt gtgttgctgg atggatggat 660 ggattacaag ggttggtctt tgatcttccc tcttctcctc cctcatcatc atacaccccc 720 tactactact cctcaccacc caaaacaacc tcccaacccc caaacccttc gacctgagct 780 caggcaagac cacccgctga acttaagcat atcaataagc ggagga 826 <210> 3 <211> 340 <212> DNA <213> Auxenochlorella protothecoides MM0011 <220> <221> misc_structure <222> (1)..(340) <223> rbcL <400> 3 ccacaaactg aaacaaaagc cagttcaggt tttaaagcag gtgttaaaga ttatcgttta 60 acttattata ctcctgatta ccaaacaaaa gatacggata ttttagcagc tttccgtatg 120 actcctcaac caggcgttcc accagaagaa tgtggtgcag ctgttgcagc agaatcttca 180 acaggtactt ggacgactgt ttggactgat ggtttaacta gtttagaccg ttataaagga 240 cgttgctatg atcttgaacc agtagcaggc gaagaaaatc aatatattgc atatgttgca 300 tatccaattg atctttttga agaaggctct gtaacaaact 340

Claims (14)

  1. 서열번호 1로 표시되는 18S rRNA (ribosomal ribonucleic acid), 서열번호 2로 표시되는 ITS(internal transcribed spacer) 및 서열번호 3으로 표시되는 rbcL (the large subunit of the ribulose-bisphosphate carboxylase gene)의 염기서열을 갖는, 기탁번호 KCTC13291BP로 기탁된 미세조류 옥세노클로렐라 프로토테코이드(Auxenochlorella protothecoides) MM0011 균주.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 균주는 고농도의 다중불포화지방산 및 포화지방산을 포함하는 바이오오일 생산능, 고농도의 유기물 및 단백질을 포함하는 바이오매스 생산능, 우수한 전질소 및 전인의 제거능, 및 고농도의 루테인 생산능을 갖는 것인, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주.
  3. 제 2 항에 있어서,
    상기 다중불포화지방산은 오메가-3 및 오메가-6이며, 상기 오메가-3 및 오메가-6은 전체 지질 중량의 60% 내지 70%인, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주.
  4. 제 2 항에 있어서,
    상기 포화지방산은 팔미트산이며, 상기 팔미트산은 전체 지질 중량의 약 10 내지 15%인, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주.
  5. 제 2 항에 있어서,
    상기 루테인의 함량은 상기 미세조류의 건조 중량 기준으로 3.5±0.1 mg·g-1 인, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주.
  6. 제 2 항에 있어서, 상기 바이오매스에 포함된 유기물은 85 중량% 이상이고, 상기 단백질은 50 중량% 이상 포함되는 것인, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주.
  7. 제 2 항에 있어서,
    상기 전질소 및 전인의 제거능은 각각 40% 이상 및 27% 이상인, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주.
  8. 제 2 항에 있어서,
    상기 미세조류는 5-35℃의 배양 온도, 0 내지 1.5 M의 NaCl 농도의 배양조건을 갖는 것인, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 균주 또는 이의 배양액을 포함하는 미생물 제제로,
    상기 미생물 제제는 바이오오일 생산, 바이오매스 생산, 루테인 생산, 동물 사료 생산, 또는 전질소 및 전인의 제거용인, 미생물 제제.
  10. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 균주를 배양하는 단계; 및 상기 균주로부터 지질을 분리하는 단계를 포함하는 지질 생산 방법.
  11. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 균주를 오·폐수와 배양하는 단계를 포함하는, 상기 오·폐수로부터 질소 및 인의 제거 방법.
  12. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 따른 균주를 배양하는 단계; 및 상기 균주로부터 색소를 추출하는 단계; 및 상기 색소로부터 루테인을 분리하는 단계를 포함하는 루테인 생산 방법.
  13. 서열번호 1로 표시되는 18S rRNA, 서열번호 2로 표시되는 ITS 및 서열번호 3으로 표시되는 rbcL 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주 검출용 핵산.
  14. 서열번호 1로 표시되는 18S rRNA, 서열번호 2로 표시되는 ITS 및 서열번호 3으로 표시되는 rbcL 구성되는 군으로부터 선택되는 하나 이상 유전자의 검출용 물질을 포함하는, 옥세노클로렐라 프로토테코이드 MM0011 균주 검출용 조성물.
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