CN111117892B - 绿藻Auxenochlorella sp.BSC-01及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公布了一种原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC‑01及其应用。本发明提供的原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC‑01藻种属于绿藻门原壳藻属，能够形成具有显著固沙效果的生物土壤结皮，为人工结皮固沙技术提供了新的生物资源。该藻种分离自天然形成的生物土壤结皮，不会对环境造成二次污染。因此，利用该藻种进行生物土壤结皮的人工培育，是一种生态友好的生物固沙技术，可为我国的防沙治沙工作服务，在沙区荒漠化防治及生态环境修复中具有极为重要的应用价值。

Description

绿藻Auxenochlorella sp.BSC-01及其应用
技术领域
本发明涉及荒漠化防治和生态环境修复领域，特别涉及一株原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC-01，包括该藻种的培养方法及利用该藻种人工培育生物土壤结皮在防治荒漠化中的应用。
背景技术
土地荒漠化是我国目前面临的最严重的生态环境问题之一。根据2015年国家林业局公布的《中国荒漠化和沙化状况公报》显示，我国荒漠化土地面积为261.16万平方公里，沙化土地面积为172.12万平方公里，分别占国土总面积的27.20％及17.93％。土地荒漠化导致的土壤肥力、生产力下降，生物多样性丧失等后果，直接威胁着人们赖以生存的环境，给国家和社会经济带来了巨大损失。因此，荒漠化防治是国家推进生态文明建设和保护环境的迫切需求。
国内外常见的荒漠化防治措施为工程固沙、化学固沙及生物固沙。由于工程及化学固沙存在经济成本高、可持续性差、对环境有二次污染等问题，近年来，人工培育生物土壤结皮等生物固沙技术得到了高度重视及广泛应用。生物土壤结皮是指由蓝藻、绿藻、地衣、藓类和土壤微生物以及相关的其他生物体，用过菌丝体、假根和分泌物等与土壤表层微小颗粒胶结形成的皮壳状结构。土壤生物结皮可抵御风蚀水蚀，提高土壤稳定性，对流沙有持续的固定作用，阻止就地起沙进而切断沙尘暴来源。此外，生物土壤结皮作为荒漠的“生态系统工程师”，还能为其他物种在沙区的拓殖、发展提供生境，提高荒漠生态系统的生物多样性。基于生物土壤结皮所发挥的诸多复杂的生态和水文功能，人工培育生物土壤结皮固沙技术在荒漠化防治中具有极为重要的研究和应用价值。
人工培育生物结皮固沙技术是将自然形成的生物土壤结皮中的主要生物体(藻类、藓类和地衣)进行人工培育并接种到沙地表面，通过养护成活，形成生物土壤结皮，进而起到防风固沙的作用。目前，利用生物土壤结皮防治荒漠化的专利技术，主要以细菌(如中国发明专利ZL 201810609500.3)，蓝藻(如中国发明专利ZL 200510091252.0)及地衣(如中国发明专利ZL 201110262012.8)为种源。而自然生物土壤结皮的生物资源丰富，对其中所包含的其他生物(如绿藻等)进一步的开发利用，能够提供新的有效的荒漠化防治措施。
发明内容
本发明的目的是提供一株能形成生物土壤结皮并且有效固沙的新藻种，为人工结皮固沙技术提供新的生物资源，服务于我国的防沙固沙工作，促进荒漠化的防治及沙区的生态环境修复。
在中科院内蒙奈曼沙漠化研究站采集天然形成的生物土壤结皮样本，对其中的藻类进行连续多次的培养、分离及纯化后，获得本发明中提供的藻种原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC-01，该藻种属于绿藻门原壳藻属。通过在光学显微镜100倍油镜下观察，发现该藻种的细胞呈圆形，绿色，大小不一，色素体周生，细胞直径为2至10μm。
本发明提供的原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC-01，已于2019年9月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏中心登记号为CGMCC No.18510。
本发明提供的原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC-01可以用BG11培养基进行培养。在1L所述BG11培养基含有如下成分：NaNO3 1.5g，CaCl2 0.027g，K2HPO4·3H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.075g，柠檬酸铁铵0.006g，柠檬酸0.006g，Na2CO3 0.02g，EDTANa2 0.001g，A5溶液1mL；其中每100mL A5溶液包含H3BO3 0.286g，MnCl2·4H2O 0.186g，ZnSO4·7H2O0.022g，NaMoO4·2H2O 0.039g，CuSO4·5H2O 0.008g，CO(NO3)2·6H2O 0.005g；pH至7.1-7.5。培养条件为：20～25℃下光照培养2～3周。
本发明的原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC-01能够形成具有显著固沙效果的生物土壤结皮。实验发现，将原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC-01接种至BG11液体培养基，25℃下光照培养2周后，将培养液浓缩；然后将浓缩藻液喷洒至沙土表面，25℃下光照培养1个月，沙土表面能观察到明显的生物土壤结皮，结皮的厚度显著高于未喷洒藻液的对照组形成的物理结皮的厚度。在体式镜下放大20倍、40倍及50倍观察发现，未喷洒藻液的对照组所形成的物理结皮极易破碎，表面沙粒极为松散，稳定性差，在风吹蚀下容易形成流沙；而喷洒于沙土表面的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01能在沙粒表面快速生长，填充沙粒间的空隙并且产生黏结力，使原本松散的沙粒相互胶结在一起，形成生物土壤结皮，提高沙土的稳定性，起到良好的固沙效果。
抗压强度能够反应生物土壤结皮抗击风蚀和雨滴溅蚀的能力，在上述结皮培育结束后，测定土壤的抗压强度发现，喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组抗压强度显著高于未喷洒藻液的对照组。此结果说明未喷洒藻液的对照组形成的物理结皮，固结层松散，抗压强度小。而通过喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液，在沙土表面形成生物土壤结皮后，能显著提高沙土的抗压强度及其抗蚀能力，起到固定流沙的作用。
为验证原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01形成的生物土壤结皮的抗风蚀性能，本发明进一步开展了风洞实验。风洞实验的结果表明，在相同风速下，喷洒藻液的实验组其风蚀量及风蚀速率均显著低于未喷洒藻液的对照组。此外，尽管喷洒藻液及未喷洒藻液的固沙试样其风蚀速率均会随着风速的提高而增加，但喷洒藻液能显著降低提高风速对固沙试样风蚀速率造成的影响。由此证明了本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01在沙土表面形成生物土壤结皮后，可以显著增强沙面的抗风蚀性能，保护沙面免于风蚀，减少原地起沙，具有优秀的固定流沙的作用。
进一步的，本发明还提出了一种固定流沙的方法，将原壳藻(Auxenochlorellasp.)BSC-01藻液喷洒在沙土表面形成生物土壤结皮。
上述固定流沙的方法中，可以先用BG11培养基培养原壳藻(Auxenochlorellasp.)BSC-01，20～25℃下光照培养2～3周后，将培养液浓缩为藻体鲜重60～80g/L，干重10～14g/L的藻液，然后将该浓缩藻液均匀地喷洒至沙土表面形成生物土壤结皮。为了更快速地形成生物土壤结皮，在喷洒浓缩藻液后，可以每隔一段时间(例如2天)用喷雾器浇水，使沙地表面湿润即可，降雨期间停止浇水，一段时间后即可形成具有明显固沙效果的生物土壤结皮。
综上所述，本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01能够形成具有显著固沙效果的生物土壤结皮。本发明首次公开了利用绿藻门中的藻种培育生物土壤结皮在荒漠化防治中的应用。该藻种分离自天然形成的生物土壤结皮，不会对环境造成二次污染。因此，利用该藻种进行生物土壤结皮的人工培育，是一种生态友好的生物固沙技术，可为我国的防沙治沙工作服务，在沙区荒漠化防治及生态环境修复中具有极为重要的应用价值。
生物材料的保藏
本发明的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01于2019年9月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC No.18510。
附图说明
图1为野外采集天然形成的生物土壤结皮的样点及样本。
图2为原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01的照片，其中(a)为在固体平板上的形态，(b)为光学显微镜100倍油镜下观察的形态。
图3为基于测序的序列构建的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01的系统发育树。
图4为沙土表面形成的结皮照片及其在体式镜下分别放大20倍、40倍及50倍观察的照片，其中(a)为未喷洒藻液的对照组沙土表面形成的物理结皮，(b)为喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组沙土表面形成的生物土壤结皮。
图5为未喷洒藻液的对照组及喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组在培养1个月后形成的结皮厚度对比图。
图6为未喷洒藻液的对照组及喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组在培养1个月后固沙试样的抗压强度对比图。
图7为5m/s、10m/s、15m/s风速下吹蚀10min后未喷洒藻液的对照组及喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组的风蚀速率对比图。
图8为未喷洒藻液的对照组及喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组在风洞装置中风蚀前后的对比照片。
具体实施方式
下述实验方法如无特别说明均为常规方法，所有培养基中的溶剂均为水。
BG11培养基的储备液为：①NaNO3,15g/100mL；②CaCl2,2.718g/100mL；③K2HPO4·3H2O,4g/100mL；④MgSO4·7H2O,7.5g/100mL；⑤柠檬酸铁铵,0.6g/100mL；⑥柠檬酸,0.6g/100mL；⑦Na2CO3,2g/100mL；⑧EDTANa2,0.1g/100mL；⑨A5溶液100mL,其中包括：H3BO3(0.286g),MnCl2·4H2O(0.186g),ZnSO4·7H2O(0.022g),NaMoO4·2H2O(0.039g),CuSO4·5H2O(0.008g),CO(NO3)2·6H2O(0.005g)。配置BG11培养基时，①号储备液10mL/L，②-⑨号储备液各1mL/L，若配置BG11固体培养基则再加入20g/L的琼脂粉。
仪器设备：光照培养箱，气候培养箱。
实施例1：原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01的分离、纯化和鉴定
本发明提供的原壳藻分离自中科院内蒙奈曼沙漠化研究站采集的天然生物土壤结皮(图1)。准确称取10g生物土壤结皮样品，放入有90mL无菌水并放有小玻璃珠的250mL三角瓶中，置于摇床于在温度25℃，转速为150r/min恒温振荡培养箱中振荡摇匀20min。静置1min后，取1mL样品悬液加入到含有9mL无菌水的灭菌离心管中，依次进行梯度稀释，稀释度为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6。将稀释度10-4，10-5，10-6的菌悬液各取0.1mL涂布到BG11固体培养基的平板上，每个稀释度涂布三个平板。将涂布的平板倒置于25℃的恒温培养箱中进行光照培养。培养5～7天后，根据平板上生长的藻类的形态，用灭菌的解剖针对不同的藻种进行分离、筛选，并在新鲜的固体培养基上进行划线纯化。连续经历数次的分离、纯化后得到获得纯化的藻种BSC-01(图2(a))。通过在光学显微镜100倍油镜下观察，本发明的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01细胞呈圆形，绿色，大小不一，色素体周生，细胞直径为2至10μm(图2(b))。
使用DNA抽提试剂盒提取藻种BSC-01的DNA进行扩增及测序。将测序得到的基因序列在NCBI数据库上进行blast比对(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，并且利用邻接法构建系统发育树，迭代次数1000次。结果表明该藻种BSC-01与绿藻门中的原壳小球藻Auxenochlorella protothecoides(AY553213.1)的相似度高达98.02％，并且在系统发育树上能组成一个单系类群，其自展值为96％(图3)。因此，本发明的藻种属于绿藻门原壳藻属(Auxenochlorella)，将其命名为原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01。本发明提供的原壳藻(Auxenochlorella sp.)BSC-01，已于2019年9月20日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(简称为CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所)，保藏中心登记号为CGMCC No.18510。
实施例2：原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01形成生物土壤结皮厚度测定
将本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01接种至灭菌后的BG11液体培养基中，25℃下光照培养。培养2周后，将培养液通过0.8μm的灭菌滤膜进行抽滤，并将滤膜上的藻洗脱至无菌水中，浓缩成为藻液，该浓缩制成的藻液的浓度为：藻体鲜重70.56±5.74g/L，藻体干重11.83±1.54g/L。
将在荒漠中采集的沙土样品过10目(筛孔2mm)的筛子，去除沙土样品中的石头及植物根系后，将其分装于不同的玻璃烧杯中，121℃高温高压灭菌25min。将灭菌后的土壤分别装入1L的塑料烧杯，每个烧杯中装入1kg沙土。取50mL上述浓缩制成的藻液均匀地喷洒至沙土表面，通过称重计算沙土的含水率，并用无菌水调节至10％的含水率，作为实验组。对照组喷洒50mL无菌水，并且也调节至10％的含水率。将喷洒藻液的实验组及未喷洒的对照组都置于气候培养箱中，在25℃下，光照培养，培养过程中保持10％的含水率。
培养1个月后，喷洒藻液的实验组在沙土表面可观察到明显的生物土壤结皮，而未喷洒藻液的对照组仅有一层很薄的物理结皮。去掉表层结皮下的沙土后，将表层结皮置于体式镜下依次放大20倍、40倍及50倍观察，如图4所示，未喷洒藻液的对照组所形成的物理结皮极其容易破碎，表面沙粒极为松散，稳定性差，在风吹蚀下容易形成流沙；相反，喷洒藻液的实验组在光照条件下，本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01能在沙粒表面快速生长，填充沙粒间的空隙并且产生黏结力，使原本松散的沙粒相互胶结在一起，形成生物土壤结皮，提高沙土的稳定性，阻止原地起沙进而起到良好的固沙效果。
用游标卡尺测量喷洒藻液的实验组及未喷洒藻液的对照组形成的结皮的厚度。如图5所示，在喷洒本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液，光照培养1个月后，能形成厚度在4.5～7.5mm之间的生物土壤结皮。该结皮的厚度显著高于未喷洒藻液的对照组形成的物理结皮的厚度(P<0.05)。
实施例3:原壳藻(Auxenochlorellas sp.)形成的生物土壤结皮抗压能力测定
将本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01接种至灭菌后的BG11液体培养基中，25℃下光照培养。培养两周后，将培养液通过0.8μm的灭菌滤膜进行抽滤，并将滤膜上的藻洗脱至无菌水中，浓缩成为藻液，该浓缩制成的藻液的浓度为：藻体鲜重70.56±5.74g/L，藻体干重11.83±1.54g/L。
将采集的沙土样品过10目(筛孔2mm)的筛子，去除沙土样品中的石头及植物根系后，将其分装于不同的玻璃烧杯中，121℃高温高压灭菌25min。将灭菌后的土壤分别装入1L的塑料烧杯，每个烧杯中装入1kg沙土。取50mL上述浓缩制成的藻液均匀地喷洒至沙土表面，通过称重计算沙土的含水率，并用无菌水调节至10％的含水率，作为实验组。对照组喷洒50mL无菌水，并且也调节至10％的含水率。将喷洒藻液的实验组及未喷洒的对照组都置于气候培养箱中，在25℃下，光照培养。培养过程中，保持10％的含水率。
培养1个月后，喷洒藻液的实验组在沙土表明可以观察到明显的生物土壤结皮，而未喷洒藻液的对照组仅有一层很薄的物理结皮。抗压强度能够反应生物土壤结皮抗击风蚀和雨滴溅蚀的能力，用土壤硬度来表征土壤的抗压强度，采用土壤硬度计(TYD-1型，浙江托普仪器有限公司)测定结皮的抗压强度。如图6所示，相较于未喷洒藻液的对照组，喷洒藻液的实验组在形成生物土壤结皮后，其土壤的抗压强度有显著提高，说明本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01，在形成生物土壤结皮后能显著提高沙土的抗压强度及其抗蚀能力，起到固定流沙的作用。
实施例4:原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01形成的生物土壤结皮抗风蚀能力测定
取上述实施例中的灭菌沙土2kg，将其均匀地摊平在尺寸为33.7cm×21.7cm×3cm的沙盘中，并且均匀地喷洒200mL上述实施例中浓缩制成的原壳藻(Auxenochlorellassp.)BSC-01藻液到沙盘上。用称重法测定含水率，利用无菌水将调节至10％含水率，共准备9个喷洒藻液的实验组。同时，通过喷洒无菌水准备9个对照组，对照组的含水率也调节至10％。将喷洒藻液及未喷洒藻液的沙盘，均放置在气候培养箱中，25℃光照培养，培养过程中保持10％的土壤含水率。培养6周，待沙盘表面形成生物土壤结皮后，在风洞中测定结皮的抗风蚀性能。风洞洞体总长37.8m，其中试验段长16m，横截面面积1m×1m，两侧和顶部为透明玻璃，风洞顶班的倾角为0.5°。测定时将1个喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组及1个未喷洒藻液的对照组的固沙试样倾斜15°同时放置在风洞的试验段上，测定其在不同风速(5m/s，10m/s，15m/s)下，吹10min后的风蚀量。根据风蚀量计算固沙试样的风蚀速率，风蚀速率的计算公式如下：
Re＝(m0-m1)/(s×t)
式中Re为风蚀速率(g·m-2·min-1)，m0为风蚀前沙土的质量(g)，m1为风蚀前后沙土的质量(g)，s为固沙试样面积(m2)，t为风蚀时间(min)。
结果如表1所示，喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组在风蚀前后，固沙试样的质量变化远低于未喷洒藻液的对照组，说明喷洒本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01形成的生物土壤结皮可以明显降低沙土的风蚀量，提高沙土的抗风蚀性能。进一步计算风蚀速率表明，喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组及未喷洒藻液的对照组，风蚀速率均随风速的提高而增加，但喷洒藻液的实验组风蚀速率的变化量远低于未喷洒藻液的对照组，说明本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01形成的生物土壤结皮能明显地降低风速提高对沙土风蚀速率的影响。此外，在相同风速条件下，未喷洒藻液的对照组其风蚀速率均显著高于喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液的实验组(图7)。尤其是在较高的风速吹蚀下(15m/s)，未喷洒藻液的对照组固沙试样受到明显风蚀(图8)，风蚀速率高达154.52～362.37g·m-2·min-1，而喷洒藻液的实验组风蚀速率仍然维持在相对较低的水平(图7)。以上结果说明，喷洒本发明提供的原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01在沙粒表面形成生物土壤结皮后，能显著提高固沙试样的抗风蚀性能，保护沙面免于风蚀，具有显著的固沙效果。
表1.喷洒原壳藻(Auxenochlorellas sp.)BSC-01藻液及未喷洒藻液的固沙试样的风蚀速率
Figure GDA0002602967850000081

Claims (8)

1.一种绿藻，为Auxenochlorella sp.BSC-01，保藏中心登记号为CGMCC No.18510。
2.一种培养保藏中心登记号为CGMCC No.18510的Auxenochlorella sp.BSC-01的方法，用BG11培养基进行光照培养，培养温度为20～25℃。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，在1L所述BG11培养基的溶质由如下成分组成：NaNO3 1.5g，CaCl2 0.027g，K2HPO4·3H2O 0.04g，MgSO4·7H2O 0.075g，柠檬酸铁铵0.006g，柠檬酸0.006g，Na2CO3 0.02g，EDTANa2 0.001g，A5溶液1mL；其中每100mL A5溶液包含H3BO3 0.286g，MnCl2·4H2O 0.186g，ZnSO4·7H2O 0.022g，NaMoO4·2H2O 0.039g，CuSO4·5H2O 0.008g，CO(NO3)2·6H2O 0.005g；pH至7.1-7.5。
4.保藏中心登记号为CGMCC No.18510的Auxenochlorella sp.BSC-01在荒漠化防治中的应用。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，通过Auxenochlorella sp.BSC-01藻液，在沙土表面形成生物土壤结皮，起到固沙作用。
6.一种固定流沙的方法，将保藏中心登记号为CGMCC No.18510的Auxenochlorellasp.BSC-01藻液喷洒在沙土表面形成生物土壤结皮。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，用BG11培养基培养保藏中心登记号为CGMCCNo.18510的Auxenochlorella sp.BSC-01，20～25℃下光照培养2～3周后，将培养液浓缩为藻体鲜重60～80g/L，干重10～14g/L的藻液，然后将该浓缩藻液喷洒至沙土表面形成生物土壤结皮。
8.保藏中心登记号为CGMCC No.18510的Auxenochlorella sp.BSC-01在制备用于固定流沙的生物制剂中的应用。
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