CN110624949B - 利用土著微生物和植物联合修复磷矿废弃地过量磷污染的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用土著微生物和植物联合修复磷矿废弃地过量磷污染的方法。该方法首先从磷矿废弃地土壤中分离筛选出高效土著解磷微生物以及磷超富集植物，然后将磷超富集植物幼苗移栽到磷矿废弃地土壤中，以灌根的方式将高效土著解磷微生物接种到磷超富集植物幼苗根际土壤，栽种一段时间后即可完成磷矿废弃地过量磷污染的修复。本发明选用的高效土著解磷微生物和磷超富集植物均来自于磷矿废弃地，能很好的适应磷矿废弃地生态环境，且不会造成新污染或二次污染，通过两者联合作用能有效降低磷矿废弃地中的磷含量。该方法在磷矿废弃地过量磷污染的生态修复和治理方面效果显著且应用前景广阔。

Description

利用土著微生物和植物联合修复磷矿废弃地过量磷污染的 方法

技术领域

本发明涉及磷矿废弃地生态修复技术领域，具体涉及一种利用土著微生物和植物联合修复磷矿废弃地过量磷污染的方法。

背景技术

我国磷矿资源十分丰富，居世界第二位。目前磷矿主要采取钻井式开采方法，产生的大量废渣堆积形成磷矿废弃地。然而大部分矿区并没有采取相应的措施对磷矿废弃地进行治理，导致该地区生态环境遭到破坏，矿区生物多样性因此降低。近年来随着开采力度的加大这种现象更加明显，磷矿废弃地生态环境的治理和修复迫在眉睫。

磷矿废弃地往往伴随着水土流失，大量的磷元素不断流失到水体中，对该地区的水体富营养化造成了一定影响。研究发现磷矿废弃地土壤全磷含量明显高于周边地，较高的含磷量使其在雨水冲刷下极易导致水体富营养化。当水体中含氮充分时，磷浓度只要高于0.015mg/L就可能引起“水华”。另外，磷矿废弃地矿渣中的磷含量也远远高于能引起水体富营养化的阈值，因此磷矿废弃地过量磷污染不容忽视。开展磷矿废弃地过量磷污染的生态修复研究，对磷矿采选行业的健康可持续发展、保护磷矿废弃地生态环境以及保障人民生活安全等都具有重大的现实意义。

现阶段常见的土壤修复方法主要有物理、化学和生物修复法。物理和化学修复法虽然能在短时间内达到较好的效果，但是技术成本较高，不宜应用于大面积的场地修复，而且存在改变土壤结构、降低土壤肥力、影响当地物种多样性等缺点。生物修复法包括动物、植物和微生物修复，该方法成本低、适宜大面积应用，且对环境友好，具有良好的研究价值和发展前景。

发明内容

本发明针对磷矿废弃地过量磷污染的特点，创造性的选用土著解磷微生物和磷超富集植物对磷矿废弃地过量磷污染开展生态修复，取得了较好的效果。

本发明具体方案如下：

利用土著微生物和植物联合修复磷矿废弃地过量磷污染的方法，具体包括以下步骤：(a)磷矿废弃地土壤经筛选、活化和富集培养，得到土著解磷微生物；(b)从磷矿废弃地植被中筛选出土著磷超富集植物；(c)将步骤(b)所得土著磷超富集植物移栽到磷矿废弃地，接着将步骤(a)所得土著解磷微生物接种到土著磷超富集植物根际土壤中，修复一段时间即可。

进一步的，步骤(a)中从磷矿废弃地土壤中筛选土著解磷微生物的过程具体如下：将磷矿废弃地土壤与无菌水按照50-100g:1L的比例混合，所得混合物置于摇瓶中，利用恒温摇床振荡一段时间(20-30分钟)使其充分混匀，摇床温度控制在28-35℃，静置沉淀所得上清液即为菌悬液；按照1:3-5的重量比将菌悬液与微生物培养基混合均匀，所得混合物置于摇瓶中，利用恒温摇床振荡培养3-5天，摇床温度控制在28-35℃，得到培养好的解磷微生物悬液；将培养好的解磷微生物悬液接种至微生物固体培养基上，于28-35℃下培养2-4天，挑选单一菌落在同样条件下用微生物固体培养基传代培养3-5次，得到纯化的解磷微生物菌株；将纯化的解磷微生物菌株接种至含低品位磷矿粉的微生物培养基中，利用恒温摇床于28-35℃、120-170r/min条件下培养5-7天；取适量培养液离心过滤后测定上清液磷含量，以含量的高低为依据筛选出高效土著解磷微生物。

进一步的，步骤(a)中土著解磷微生物的活化过程具体如下：将筛选出的高效土著解磷微生物接种至微生物培养基中，所得混合物置于摇瓶中利用恒温摇床振荡培养得到活化菌液，其中摇床转速120-170r/min，振荡培养温度28-35℃，培养时间2-4天；将活化菌液接种于微生物培养基中，按照同样的方法振荡培养得到二次活化菌液；反复接种和振荡培养3-5次后，得到高效解磷微生物活化菌液。

进一步的，步骤(a)中土著解磷微生物的富集过程具体如下：将高效解磷微生物活化菌液接种于微生物培养基中，所得混合物置于摇瓶中利用恒温摇床振荡培养，摇床转速120-170r/min，振荡培养温度28-35℃，培养时间2-4天；培养完成后将菌液浓度调节至(1-2)×10⁸个/mL备用。

进一步的，微生物培养基的配方为(按照重量份数计)：葡萄糖6-10份，(NH₄)₂SO₄0.2-0.4份，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4份，KCl 0.1-0.3份，NaCl 0.1-0.3份，FeSO₄·7H₂O 0.02-0.04份，蒸馏水1000份，pH＝7。

进一步的，含低品位磷矿粉的微生物培养基的配方为(按照重量份数计)：低品位磷矿粉5-10份，葡萄糖6-10份，(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4份，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4份，KCl 0.1-0.3份，NaCl 0.1-0.3份，FeSO₄·7H₂O 0.02-0.04份，蒸馏水1000份，pH＝7。其中低品位磷矿粉中五氧化二磷的质量百分数含量为5％-20％，其粒径为50-200目。

进一步的，微生物固体培养基的配方为(按照重量份数计)：葡萄糖6-10份，(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4份，MgSO₄·7H₂O 0.2-0.4份，KCl 0.1-0.3份，NaCl 0.1-0.3份，FeSO₄·7H₂O0.02-0.04份，琼脂粉10-20份，蒸馏水1000份，pH＝7。

进一步的，步骤(b)中土著磷超富集植物的筛选过程具体如下：调查磷矿废弃地植物品种，取适量相应植物种子播种到含蛭石(5％-10％重量比)的土壤中，28-35℃下育苗6-10天，选取发芽率高、生长状态好的植物进行移栽；将选定的植物幼苗移栽至试验花钵中，定时施浇100-500mg/kg的可溶磷溶液，自然光照下生长30-40天后采样；将植株地上、地下部分分离并洗净、烘干至恒重，接着分别粉碎、灰化和酸解得到植株地上、地下样品，分别分析检测样品磷含量；采集完植株后取适量试验花钵中的土壤，自然风干后酸解得到土壤样品，检测其磷含量；计算植株的富集系数和转移系数，选择上述系数均大于1的植株，确定为土著磷超富集植物。

进一步的，调查确定的磷矿废弃地植物品种包括艾蒿、小蓬草、小苔草、苦苣、藜和黑麦草等，最终分析确定的土著磷超富集植物为黑麦草、苦苣。

进一步的，步骤(c)中土著解磷微生物接种方式为定期灌根，灌根次数为10-20次，灌根间隔时间为6-12天，磷矿废弃地修复总时间为60-240天。

本发明基于磷矿废弃地过量磷污染的特点，成功开发了一种磷矿废弃地土著微生物和植物联合修复磷矿废弃地过量磷污染的方法。该方法一方面充分利用磷矿废弃地土著解磷微生物溶解大量处于难溶态的磷，使其转化为可溶态从而有利于植物吸收和富集，且这些解磷微生物的存在还能促进植物对营养元素的吸收；另一方面，植物可迅速吸收被微生物溶解的可溶态磷并快速生长，将磷从磷矿废弃地转移到植物中，大幅度降低了磷矿废弃地中的磷含量，且植物根系分泌物又能为微生物提供大量营养，进一步促进微生物对难溶态磷的溶解，实现良好的治理和修复效果。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：(1)本发明选用的高效土著解磷微生物和磷超富集植物均来自于磷矿废弃地，能很好的适应磷矿废弃地生态环境，且不会对磷矿废弃地环境带来新污染或造成二次污染；(2)本发明通过磷矿废弃地土著微生物和植物的联合协同修复作用，能有效降低磷矿废弃地中的磷含量，实践表明该方法对磷矿废弃地总磷去除率可达50％-75％，能有效修复磷矿废弃地过量磷污染；(3)本发明操作简单，成本低，环境友好，应用前景广阔。

具体实施方式

为使本领域普通技术人员充分理解本发明的技术方案和有益效果，以下结合具体实施例进行进一步说明。

本发明各实施例所使用的几种培养基配方如下(重量份数计)：

微生物培养基：葡萄糖10份，(NH₄)₂SO₄ 0.4份，MgSO₄·7H₂O 0.2份，KCl 0.3份，NaCl 0.3份，FeSO₄·7H₂O 0.03份，蒸馏水1000份，pH＝7。含低品位磷矿粉的微生物培养基在此基础上加入了5-10份低品位磷矿粉，所述磷矿粉中P₂O₅的质量百分数含量为5-20％，其粒度为50-200目。

微生物固体培养基：葡萄糖10份，(NH₄)₂SO₄ 0.4份，MgSO₄·7H₂O 0.2份，KCl 0.3份，NaCl 0.3份，FeSO₄·7H₂O 0.03份，琼脂粉10份，蒸馏水1000份，pH＝7。

高效土著解磷微生物的筛选、活化和富集培养过程如下：按照50-100g:1L的比例，将磷矿废弃地土壤与无菌水混合后分装在摇瓶中，放入恒温摇床中于28-35℃下振荡20-30分钟，接着静置沉淀得到上清液，即为菌悬液。按照1:3-5的重量比，将上一步的菌悬液与微生物培养基混合后分装在摇瓶中，利用恒温摇床于28-35℃下振荡培养3-5天，得到培养好的解磷微生物悬液。将上一步培养好的解磷微生物悬液接种至微生物固体培养基上，于28-35℃培养2-4天，挑选单一菌落在同样条件下用微生物固体培养基传代培养3-5次，得到纯化的解磷微生物菌株。将上一步得到的纯化的解磷微生物菌株接种至含低品位磷矿粉的微生物培养基中，利用恒温摇床于28-35℃、120-170r/min条件下发酵培养5-7天。将培养液离心过滤，取样测定上层清液磷含量。采用钼锑抗比色法测定培养液中有效磷含量，以磷含量的高低为依据筛选出高效土著解磷微生物。

不同磷矿废弃地土壤筛选出来的菌株种类不同，发明人实际筛选出来的菌株主要包括棘孢木霉、沙雷氏菌及其混合物。得到的高效土著解磷微生物菌株需用微生物固体培养基保存在-4℃的冰箱中备用。

土著磷超富集植物的筛选过程具体如下：发明人团队于2018年10月对湖北宜昌地区磷矿废弃地进行了实地调查，统计发现的植物有艾蒿、小蓬草、小苔草、苦苣、藜和黑麦草等，分别选取这些植物的种子进行育苗。种子先用无菌水漂洗干净，播种至含蛭石的花钵中，然后置于28-35℃环境中育苗6-10天，选取发芽率高、生长状态好的植株移栽至试验花钵中。移栽后的植株每天傍晚浇无菌水，待幼苗成活后隔天浇水，每隔10天浇一次100-500mg/kg可溶磷溶液(可溶磷量为磷酸二氢钾含量)，植物生长期间自然光照。

30-40天后采集样品，采样时间分别为植株生长3-4周，每次每个样品至少采集3个试样。采样时将整个植株从花钵中取出，用剪刀将植物地上部与地下根系分离，获得植物地上部和地下部。分别用清水冲洗掉植物体及根系上的泥土与杂物，再转移至烘箱中于100-120℃杀青20-40分钟后降温至60-100℃烘干至恒重，称量植株地上部和地下部的干质量。将烘干后的植物样品粉碎，称取一定量样品粉末置于马弗炉中于600-800℃下灰化6-10小时，再加入10-15mL浓盐酸进行消解得到植株样品，用钼锑抗比色法测定其中磷含量。采集植物样的同时，将试验花钵中的土壤混合均匀，取适量土样自然风干。称取1-1.5g土壤样品，加入王水消解得到土壤样液，用钼锑抗比色法测定其中全磷含量。

植物地上部磷累积量为地上部干质量与磷含量的乘积，即磷累积量(g)＝干质量(g)×磷含量(g·kg^-1)×1000，植物地下部磷累积量同理。富集系数指植物地上部磷含量(也就是前述磷累积量)与相应土壤中磷含量的比值，转移系数则是植物地上部磷含量与地下部磷含量的比值，两者综合反映了植物对土壤中磷的吸收和转移能力。我们需要筛选出富集系数、转移系数均大于1的植株作为磷超富集植物。实验测得符合要求的植株有黑麦草和苦苣，其具体实验数据如下：

表1土著微生物与植物的磷富集系数与转移系数

对比例1

以筛选出来的黑麦草为植物原料，以含磷矿粉的土壤模拟废弃磷矿地土壤，进行了修复实验，具体过程如下：

对试验土(湖北黄棕壤，未被过量磷污染的土壤)进行灭菌，接着加入磷矿粉得到模拟土，每500g土壤中含20g磷矿粉(同前)。将模拟土装入花钵中，选取株高根长一致、生长状态较好的黑麦草幼苗(种子来源：宜昌地区某磷矿废弃地)进行移栽，每盆栽种三株黑麦草，移栽后每2天浇施适宜无菌水，保持苗的正常生长状态。期间每隔10天进行一次灌根，灌根所使用的溶液为无菌蒸馏水，每次用量为10mL。最后一次灌根满10天且修复120天后取样，按照上述方法分析计算富集系数、转移系数、磷去除率。

单一黑麦草修复结果表明，黑麦草的生物量为11.82±0.86g/株，地上部分磷含量为7.09±1.12g/kg，地下部分磷含量为3.46±0.20g/kg，土壤全磷含量为12.91±1.12g/kg，富集系数为0.55±0.14，转移系数为1.96±0.12，总磷的去除率为35.45％。

实施例1

以筛选出来的黑麦草和棘孢木霉为原料，以含磷矿粉的土壤(模拟土)为修复对象，进行了修复实验，具体过程如下：

将模拟土(制法与对比例1相同)装入花钵中，选取株高根长一致、生长状态较好的黑麦草进行移栽，每盆栽种3株黑麦草，移栽后每2天浇施适宜无菌水，保持苗的正常生长状态。期间每隔10天进行一次灌根，灌根所使用的溶液为1.0×10⁸个/mL的棘孢木霉高效土著解磷微生物菌液，每次用量为10mL。最后一次灌根满10天且修复120天后取样，按照上述方法分析计算富集系数、转移系数、磷去除率。

黑麦草+棘孢木霉联合修复结果表明，黑麦草的生物量为16.92±0.50g/株，地上部分磷含量为11.97±0.48g/kg，地下部分磷含量为5.68±0.52g/kg，土壤全磷含量为8.03±0.48g/kg，富集系数为1.49±0.16，转移系数为1.97±0.22，总磷的去除率为59.85％。通过各项指标的对比，表明黑麦草+棘孢木霉联合修复效果明显好于单一黑麦草的修复效果。

实施例2

以筛选出来的黑麦草和沙雷氏菌为原料，以含磷矿粉的土壤(模拟土)为修复对象，进行了修复实验，具体过程如下：

将模拟土(制法与对比例1相同)装入花钵中，选取株高根长一致、生长状态较好的黑麦草进行移栽，每盆栽种3株黑麦草，移栽后每2天浇施适宜无菌水，保持苗的正常生长状态。期间每隔10天进行一次灌根，灌根所使用的溶液为1.0×10⁸个/mL的沙雷氏菌高效土著解磷微生物液，每次用量为10mL。最后一次灌根满10天且修复120天后取样，按照上述方法分析计算富集系数、转移系数、磷去除率。

黑麦草+沙雷氏菌联合修复结果表明，黑麦草的生物量为15.15±0.60g/株，地上部分磷含量为10.16±0.43g/kg，地下部分磷含量为9.90±0.45g/kg土壤全磷含量为9.83±0.43g/kg，富集系数为1.03±0.09，转移系数为1.25±0.11，总磷的去除率为50.85％。通过各项指标的对比，表明黑麦草+沙雷氏菌联合修复效果也明显好于单一黑麦草的修复效果。

实施例3

以筛选出来的黑麦草和棘孢木霉、沙雷氏菌为原料，以含磷矿粉的土壤(模拟土)为修复对象，进行了修复实验，具体过程如下：

将模拟土(制法与对比例1相同)装入花钵中，选取株高根长一致、生长状态较好的黑麦草进行移栽，每盆栽种3株黑麦草，移栽后每2天浇施适宜无菌水，保持苗的正常生长状态。期间每隔10天进行一次灌根，灌根所使用的溶液为棘孢木霉、沙雷氏菌复合菌液(两者浓度均为1.0×10⁸个/mL，等体积混合)，每次用量为10mL。最后一次灌根满10天且修复120天后取样，按照上述方法分析计算富集系数、转移系数、磷去除率。

黑麦草+棘孢木霉+沙雷氏菌联合修复结果表明，黑麦草的生物量为18.22±0.27g/株，地上部分磷含量为14.98±0.50g/kg，地下部分磷含量为5.05±0.51g/kg土壤全磷含量为5.02±0.50g/kg，富集系数为3.00±0.40，转移系数为1.14±0.09，总磷的去除率为74.9％。通过各项指标的对比，表明黑麦草+棘孢木霉+沙雷氏菌联合修复效果明显好于单一黑麦草或黑麦草+单一菌株的修复效果。

实施例4

以筛选出来的黑麦草和棘孢木霉、沙雷氏菌为原料，以湖北宜昌地区某磷矿废弃地土壤为修复对象，进行了修复实验，具体过程如下：

对收集来的磷污染土壤(总磷含量约为10.43g/kg)进行灭菌，将污染土壤装入花钵中，每盆500g污染土壤。选取株高根长一致、生长状态较好的黑麦草进行移栽，每盆栽种三株黑麦草，移栽后每2天浇施适宜无菌水，保持苗的正常生长状态。期间每隔10天进行一次灌根，灌根所使用的溶液为棘孢木霉、沙雷氏菌复合菌液(两者浓度均为1.0×10⁸个/mL，等体积混合)，每次用量为10毫升。最后一次灌根满10天且修复120天后取样，按照上述方法分析计算富集系数、转移系数、磷去除率。

黑麦草+棘孢木霉+沙雷氏菌联合修复结果表明，黑麦草的生物量为17.21±0.15g/株，地上部分磷含量为4.13±0.33g/kg，地下部分磷含量为2.72±0.04g/kg，土壤全磷含量为2.97±0.41g/kg，富集系数为1.32±0.46，转移系数为1.51±0.09，总磷的去除率为68.17％。

Claims (2)

1.利用土著微生物和植物联合修复磷矿废弃地过量磷污染的方法，具体包括以下步骤：

（a）磷矿废弃地土壤经筛选、活化和富集培养，得到土著解磷微生物；

（b）从磷矿废弃地植被中筛选出土著磷超富集植物；

（c）将步骤（b）所得土著磷超富集植物移栽到磷矿废弃地，接着将步骤（a）所得土著解磷微生物接种到土著磷超富集植物根际土壤中，修复一段时间即可；

步骤（a）中从磷矿废弃地土壤中筛选土著解磷微生物的过程具体如下：将磷矿废弃地土壤与无菌水按照50-100g:1L的比例混合，所得混合物置于摇瓶中，利用恒温摇床振荡使其充分混匀，摇床温度控制在28-35℃，静置沉淀所得上清液即为菌悬液；按照1:3-5的重量比将菌悬液与微生物培养基混合均匀，所得混合物置于摇瓶中，利用恒温摇床振荡培养3-5天，摇床温度控制在28-35℃，得到培养好的解磷微生物悬液；将培养好的解磷微生物悬液接种至微生物固体培养基上，于28-35℃下培养2-4天，挑选单一菌落在同样条件下用微生物固体培养基传代培养3-5次，得到纯化的解磷微生物菌株；将纯化的解磷微生物菌株接种至含低品位磷矿粉的微生物培养基中，利用恒温摇床于28-35℃、120-170r/min 条件下培养5-7天；然后取适量培养液离心过滤后测定上清液磷含量，以含量的高低为依据筛选出高效土著解磷微生物；

步骤（a）中土著解磷微生物的活化过程具体如下：将筛选出的高效土著解磷微生物接种至微生物培养基中，所得混合物置于摇瓶中利用恒温摇床振荡培养得到活化菌液，其中摇床转速120-170r/min，振荡培养温度28-35℃，培养时间2-4天；将活化菌液接种于微生物培养基中，按照同样的方法振荡培养得到二次活化菌液；反复接种和振荡培养3-5次后，得到高效解磷微生物活化菌液；

步骤（a）中土著解磷微生物的富集培养过程具体如下：将高效解磷微生物活化菌液接种于微生物培养基中，所得混合物置于摇瓶中利用恒温摇床振荡培养，摇床转速120-170r/min，振荡培养温度28-35℃，培养时间2-4天；培养完成后将菌液浓度调节至(1-2)×10⁸个/mL备用；

按照重量份数计的微生物培养基配方为：葡萄糖6-10份，(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4份，MgSO₄•7H₂O 0.2-0.4份，KCl 0.1-0.3份，NaCl 0.1-0.3份，FeSO₄•7H₂O 0.02-0.04份，蒸馏水1000份，pH=7；按照重量份数计的含低品位磷矿粉的微生物培养基配方为：低品位磷矿粉5-10份，葡萄糖6-10份，(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4份，MgSO₄•7H₂O 0.2-0.4份，KCl 0.1-0.3份，NaCl0.1-0.3份，FeSO₄•7H₂O 0.02-0.04份，蒸馏水1000份，pH=7；所述低品位磷矿粉中五氧化二磷的质量百分数含量为5%-20%，磷矿粉的粒径为50-200目；按照重量份数计的微生物固体培养基的配方为：葡萄糖6-10份，(NH₄)₂SO₄ 0.2-0.4份，MgSO₄•7H₂O 0.2-0.4份，KCl 0.1-0.3份，NaCl 0.1-0.3份，FeSO₄•7H₂O 0.02-0.04份，琼脂粉10-20份，蒸馏水1000份，pH=7；

步骤（b）中土著磷超富集植物的筛选过程具体如下：首先调查磷矿废弃地植物品种，取适量相应植物种子播种到含蛭石的土壤中，28-35℃下育苗6-10天，选取发芽率高、生长状态好的植物进行移栽；将选定植物移栽至试验花钵中，定时施浇100-500mg/kg的可溶磷溶液，自然光照下生长30-40天后采样；将植株地上、地下部分分离并洗净、烘干至恒重，接着分别粉碎、灰化和酸解得到植株地上、地下样品，分别分析检测样品磷含量；采集完植株后取适量试验花钵中的土壤，自然风干后酸解得到土壤样品，检测其磷含量；计算植株的富集系数和转移系数，选择上述系数均大于1的植株，确定为土著磷超富集植物；调查确定的磷矿废弃地植物品种包括艾蒿、小蓬草、小苔草、苦苣、藜和黑麦草，最终分析确定的土著磷超富集植物为黑麦草、苦苣。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤（c）中土著解磷微生物接种方式为定期灌根，灌根次数为10-20次，灌根间隔时间为6-12天，磷矿废弃地修复总时间为60-240天。