CN111909708B - 一种矿区土壤修复剂及其制备方法与应用 - Google Patents

一种矿区土壤修复剂及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及土壤修复领域，具体涉及一种矿区土壤修复剂及其制备方法与应用。所述矿区土壤修复剂通过将污泥通过曝气发酵升温和嗜热微生物菌剂发酵获得腐熟污泥，从铅锌矿区自然生长的植物根部土壤中富集细菌，并通过含有根际土壤浸提液的选择培养基对富集获得细菌进行选择培养，获得具有耐重金属的菌剂并进行扩培，获得解磷菌剂，将腐熟污泥和解磷菌剂按比例混合获得矿区土壤修复剂，一方面能够改良土壤，构建出符合制备生长的修复层，另一方面各组分相互协同作用，提高修复过程种子发芽率，促进植被生长，提高植物抗病虫害能力。

Description

一种矿区土壤修复剂及其制备方法与应用
技术领域
本发明涉及土壤修复领域，具体涉及一种矿区土壤修复剂及其制备方法与应用。
背景技术
矿山开采过程中破坏生态环境，造成环境污染，矿区大片制备遭到破坏，表土剥离，水土流失严重，且该土壤中含有大量的重金属离子等有毒有害物质，对周边地区造成严重的影响。
现有技术中对矿区土壤修复主要通过利用某些农作物废弃物和动物粪便通过堆肥发酵获得修复剂，比如通过将矿上土壤翻整破碎并晾晒，并加入凹凸棒石、磷灰石、粉煤灰、生石灰和秸秆等基料，并加入聚丙烯酸铵、缓释肥等原料获得修复材料，并将该修复材料均匀的覆盖至矿山土壤表面，该方法能够大大改善矿山地质区的生态环境，提高制备的生存率。
但是上述修复剂易导致地区土壤碱化，长期修复效果差，无法实现矿区土壤的修复。
发明内容
针对现有技术中存在的不足，本发明提供了一种矿区土壤修复剂的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
腐熟污泥制备：将含水量小于70％的城市生活污泥与混合辅料按照质量比为1:0.8-1.5充分混匀后堆成圆锥形堆体，在堆体的底部进行曝气并进行温度监控，待堆体堆中温度达到65℃时，加入嗜热微生物菌剂，在温度为65-70℃条件下堆肥7-10天获得腐熟污泥；
解磷菌剂制备：
S1：将1-3g所述根际土壤加入至140-160ml所述富集培养基中，在28-32℃转速为100rpm条件下震荡培养20-26h，获得富集混悬液；其中，富集培养基由蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠和蒸馏水配置灭菌获得；
S2：将8-12ml所述富集混悬液加入至140-160ml所述富集培养基中，在28-32℃转速为100rpm条件下震荡培养20-26h，静置获取富集培养上清液即为细菌富集液；
S3：将所述细菌富集液进行稀释后涂布至所述选择培养基上在28-32℃条件下进行选择培养获得透明圈菌斑，并将所述透明圈菌斑接种至传代培养基上在28-32℃条件下进行传代扩大培养，获得解磷菌液；所述选择培养基由浸提液、蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁、琼脂和蒸馏水配置灭菌获得；所述浸提液为选取广东凡口铅锌矿区自然生长的植物根际土壤混合风干后，按照固液比为1：8-12的质量比加入至灭菌后的蒸馏水中，震荡处理后离心灭菌后的上清液，即为浸提液；所述传代培养基由蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、磷酸镁和蒸馏水配置灭菌获得；
将所述腐熟污泥和解磷菌液按照比例为1×109-1011CFU/kg腐熟污泥配制获得矿区土壤修复剂。
更进一步地，所述腐熟污泥制备中曝气量为4L/min。
更进一步地，所述腐熟污泥制备中嗜热微生物菌剂为CFU之比为1:0.8-1.2的嗜热脂肪芽孢杆菌与嗜热侧孢霉。
更进一步地，所述腐熟污泥制备中混合辅料由粒径小于5cm的玉米秸秆、木屑和蘑菇渣按照质量比为1:0.5-0.8:0.3-0.5混合制得。
更进一步地，解磷菌剂制备步骤S1、S2中所述所述富集培养基中各原料的浓度为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.4-7.6。
更进一步地，解磷菌剂制备步骤S3中所述选择培养基中各原料的浓度为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，浸提液40ml/L，琼脂20g/L，pH为7.2。
更进一步地，解磷菌剂制备步骤S3中所述传代培养基中各原料的浓度为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.2。
更进一步地，所述震荡处理后离心取上清液，获得浸提液的步骤具体包括：
将所述植物根际土壤风干后加入到蒸馏水中混合，在转速为100-120rpm条件下震荡25-35min后，在4000rpm条件下离心8-10min，取上清液，在121℃的条件下灭菌20min后得到的液体即为浸提液。
本发明还提供了一种矿区土壤修复剂，该矿区土壤修复剂按照上述制备方法获得。
本发明还提供了上述矿区土壤修复剂在修复矿区土壤的应用，所述应用具体包括：
将所述矿区土壤修复剂施加至矿区废弃地上；
选择类芦、醉鱼草、苜蓿种子并按照10:1:10的比例混合进行播种，并采用所述矿区土壤修复剂均匀覆盖，浇水灌溉。
有益效果：
本发明通过将污泥通过曝气发酵升温和嗜热微生物菌剂发酵获得腐熟污泥，从铅锌矿区自然生长的植物根部土壤中富集细菌，并通过含有根际土壤浸提液的选择培养基对富集获得细菌进行选择培养，获得具有耐重金属的菌剂并进行扩增，获得解磷菌剂，将腐熟污泥和解磷菌剂按比例混合获得矿区土壤修复剂，一方面能够改良土壤，构建出符合制备生长的修复层，另一方面各组分相互协同作用，提高修复过程种子发芽率，促进植被生长，提高植物抗病虫害能力。
本发明采用腐熟污泥和经细菌的富集、筛选获得的解磷菌剂复合获得矿区修复剂，在污泥腐熟的过程中先利用污泥中本身含有的细菌进行发酵，发酵过程中能够产生腐植酸以及解磷菌剂中的微生物细胞壁上存在有由蛋白质、多糖和脂质体形成的复合物，对矿区中重金属离子具有一定的吸附作用，防止重金属离子的流失，再通过嗜热细菌的作用下能够腐熟污泥和混合辅料，形成营养物质丰富的有机肥，并与解磷菌剂配合，将土壤中的磷转化为有效磷，使得植物能够更有效的对磷的吸收，且该解磷菌剂在重金属离子浓度较高的情况下生长良好，能够持续起到解磷作用，从而提高矿区土壤修复过程中种子的发芽率，促进植物生长，同时也能够提高植物抗病害能力，达到矿区土壤修复效果。
具体实施方式
为了更加清楚阐述本发明的技术内容，在此结合具体实施例予以详细说明，显然，所列举的实施例只是本技术方案的优选实施方案，本领域的技术人员可以根据所公开的技术内容显而易见地得出的其他技术方案仍属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，选取铅锌矿区中自然生长的植物醉鱼草的根和根际土壤作为原料富集原料。
取广东凡口铅锌矿区自然生长的植物醉鱼草的根际土壤风干后获得干燥土，干燥土样品磨制100目以下，经消解后采用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)测土壤重金属含量，获得土壤中重金属含量如表1所示。
表1铅锌矿区土壤重金属含量
Figure BDA0002665668860000041
Figure BDA0002665668860000051
实施例1
腐熟污泥制备：将城市生活污泥进行脱水处理获得含水量为65％的脱水污泥，与质量比为1：0.5:0.5玉米秸秆、木屑和蘑菇渣混合而成的混合辅料按照质量比为1:1的比例混匀，堆成圆锥形，底部直径约为1.5m，高约1m，在距堆体底部约0.3m处等距离埋入曝气管，管末端连接曝气头，曝气量为4L/min，并在堆体底部、中部、顶部等距离埋入无线温度传感器，设置检测时间间隔为5min，实时检测堆体温度，当堆体堆中部的温度达到65℃时，加入CFU之比为1:1的嗜热脂肪芽孢杆菌和嗜热侧孢霉，在温度为65-70℃条件下堆肥发酵8天，获得腐熟污泥。
解磷菌剂的制备：
选取广东凡口铅锌矿区自然生长的植物醉鱼草的根际土壤风干后获得干燥土，将干燥土按照1:10的质量比加入到蒸馏水中，100rpm下25℃荡30min后4000rpm条件下离心10min，121℃灭菌20min后获得浸提液。
称取原料蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠和蒸馏水，配制成蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.4-7.6的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得富集培养基；量取原料浸提液并称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁、琼脂和蒸馏水，配制成蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，浸提液40ml/L，琼脂20g/L，pH为7.2的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得选择培养基；称取蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁和蒸馏水配置成蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.2的培养基，在115℃条件下灭菌30min获得传代培养基。
称取2g新鲜的根际土壤，置于含有150ml富集培养基的玻璃三角瓶中，置于摇床上在100rpm，30℃的富集条件下震荡培养24h，吸取震荡悬浮液10ml接种至装有140ml富集培养基的三角瓶中进行第二次富集培养，接种后放入摇床上在相同条件下继续震荡培养24h，静置获取富集培养基的上清液为细菌富集液。
取细菌富集液1ml进行以10倍梯度进行稀释，最低稀释至106倍，并取每一个稀释梯度的稀释液200μl，均匀的涂抹在选择培养基上，每个稀释梯度三个平板，在30℃条件下选择培养至每个培养基平板出现透明圈(磷酸钙为不可溶的沉淀，在固体培养基中呈现为白色沉淀，出现透明圈即微生物对；磷酸钙进行了解磷的作用，即为本实施例中需要的微生物)，将所有透明圈的全部挑出，接种至传代培养基上在30℃条件下进行传代扩大培养获得解磷菌液。
将上述腐熟污泥和解磷菌液按照比例为1×1010CFU/kg腐熟污泥混合获得矿区土壤修复剂。
实施例2
腐熟污泥制备：将城市生活污泥进行脱水处理获得含水量为65％的脱水污泥，与质量比为1：0.8:0.3玉米秸秆、木屑和蘑菇渣混合而成的混合辅料按照质量比为1:0.8的比例混匀，堆成圆锥形，底部直径约为1.5m，高约1m，在距堆体底部约0.3m处等距离埋入曝气管，管末端连接曝气头，曝气量为4L/min，并在堆体底部、中顶部等距离埋入无线温度传感器，设置检测时间间隔为5min，实时检测堆体温度，当堆体堆中部温度达到65℃时，加入CFU之比为1:1.2的嗜热脂肪芽孢杆菌和嗜热侧孢霉，在温度为65-70℃条件下堆肥发酵7天，获得腐熟污泥。
取用实施例1获得的浸提液、配制的富集培养基、选择培养基和传代培养基，称取3g新鲜的根际土壤，置于含有150ml富集培养基的玻璃三角瓶中，置于摇床上在100rpm，30℃的富集条件下震荡培养24h，吸取震荡悬浮液10ml接种至装有140ml培养基的三角瓶中进行第二次富集培养，接种后放入摇床上在相同条件下继续震荡培养26h，静置获取富集培养基的上清液为细菌富集液。
取细菌富集液1ml进行以10倍梯度进行稀释，最低稀释至106倍，并取每一个稀释梯度的稀释液200μl，均匀的涂抹在选择培养基上，每个稀释梯度三个平板，在30℃条件下培养培养至每个培养基平板出现透明圈(磷酸钙为不可溶的沉淀，在固体培养基中呈现为白色沉淀，出现透明圈即微生物对；磷酸钙进行了解磷的作用，即为本实施例中需要的微生物)，将所有透明圈的全部挑出，接种至传代培养基上在30℃条件下进行传代扩大培养获得解磷菌液。
将上述腐熟污泥和解磷菌剂按照比例为1×1011CFU/kg腐熟污泥混合获得矿区土壤修复剂。
实施例3
腐熟污泥制备：将城市生活污泥进行脱水处理获得含水量为65％的脱水污泥，与质量比为1:0.6:0.4玉米秸秆、木屑和蘑菇渣混合而成的混合辅料按照质量比为1:1.2的比例混匀，堆成圆锥形，底部直径约为1.5m，高约1m，在距堆体底部约0.3m处等距离埋入曝气管，管末端连接曝气头，曝气量为4L/min，并在堆体底部、中顶部等距离埋入无线温度传感器，设置检测时间间隔为5min，实时检测堆体温度，当堆体堆中部温度达到65℃时，加入CFU之比为1:0.8的嗜热脂肪芽孢杆菌和嗜热侧孢霉，在温度为65-70℃条件下堆肥发酵10天，获得腐熟污泥。
取用实施例1获得的浸提液、配制的富集培养基、选择培养基和传代培养基，称取1.5g根际土壤，置于含有150ml富集培养基的玻璃三角瓶中，置于摇床上在100rpm，30℃的富集条件下震荡培养24h，吸取震荡悬浮液10ml接种至装有140ml培养基的三角瓶中进行第二次富集培养，接种后放入摇床上在相同条件下继续震荡培养22h，静置获取富集培养基的上清液为细菌富集液。
取细菌富集液1ml进行以10倍梯度进行稀释，最低稀释至106倍，并取每一个稀释梯度的稀释液200μl，均匀的涂抹在选择培养基上，每个稀释梯度三个平板，在30℃条件下培养培养至每个培养基平板出现透明圈(磷酸钙为不可溶的沉淀，在固体培养基中呈现为白色沉淀，出现透明圈即微生物对；磷酸钙进行了解磷的作用，即为本实施例中需要的微生物)，将所有透明圈的全部挑出，接种至传代培养基上在30℃条件下进行传代扩大培养获得解磷菌液。
将上述腐熟污泥和解磷菌液按照比例为1×109CFU/kg腐熟污泥混合获得矿区土壤修复剂。
应用例1
根据实施例1-3的方法制备的菌剂进行细菌种类分析：提取菌剂DNA后，采用带标签(barcode)的引物对515F(5’-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3’)和806R(5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’)扩增16S rRNA片段，利用Miseq高通量测序获得扩增子序列，在RDP数据库比对获得OTU分类，分析得到其组成为假单胞菌、寡养单胞菌、泛菌、芽孢杆菌、肠杆菌以及其它细菌。其中，以实施例1得到的菌剂做具体的阐述，其中，将实施例1获得解磷菌剂，利用UPARSE软件对扩增子进行聚类分析获取OTU丰度表格，获得细菌种类及丰度比分别为假单胞菌13.2％、寡养单胞菌20.4％、泛菌22.3％、芽孢杆菌35.7％、肠杆菌8.1％、其它0.3％。
应用例2
分别配置并稀释获得浓度为100、500、1000、2000mg/L的铅重金属溶液和锌重金属溶液，另配置两个混合重金属溶液，其浓度为：Zn2+2000mg/L+Pb2+100mg/L、Zn2+2000mg/L+Pb2+500mg/L，配置蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠浓度分为10g/L、3g/L、5g/L的培养基，并分别加入等量的上述配置的铅重金属溶液、锌重金属溶液和混合重金属溶液，每组配置两个培养基，向每组的两个培养基分别加入不同浓度的磷酸钙，分别为10g/L、20g/L，接种实施例1获得的解磷菌液，培养5天后，采用Olsen法(pH 8.5 0.5mol/L NaHCO3浸提-钼锑抗比色法)测定各培养基中有效磷含量，如表2所示。
表2解磷菌剂在不同浓度重金属条件下的解磷效率
Figure BDA0002665668860000091
Figure BDA0002665668860000101
由表2可知，该解磷制剂在较高重金属浓度下的解磷效果良好，在铅浓度达到1000mg/L时，解磷效率可达50％以上，在锌离子浓度为2000mg/L时，解磷效率可达62％以上，且在铅锌离子浓度同时存在且浓度较大时，仍具有良好的解磷效果，因此，本发明获得的解磷菌剂不仅对重金属离子具有较高的耐受性，同时能够在重金属浓度条件下体现良好的解磷效率，可应用于重金属矿区土壤的改良制剂，尤其是铅锌矿区土壤的改良剂。
应用例3
将实施例1获得的矿区修复剂施加至类芦植物生长的土壤中，并以施加腐熟污泥组和空白对照组为对比应用例，在类芦生长14天后测定其发芽率、根系数量、最长根长、根相对生长速率(RGR)、叶相对生长速率(RGR)、根系结构(RSA)，结果如表3所示。
表3类芦d-14生长状况
组别 对照 腐熟污泥 矿区修复剂
发芽率 67.42％±3.45％ 78.24％±4.71％ 87.47％±5.41％
根系数量 21.55±2.65 32.19±3.21 36.43±7.12
最长根长cm 279±4 273±11 295±21
根RGR 10.43％±1.42％ 12.72％±1.78％ 15.44％±1.22％
叶RGR 8.21％±0.77％ 10.12％±0.98％ 16.75％±1.36％
RSA(10<sup>-3</sup>m<sup>2</sup>) 3.87±0.35 4.56±0.54 5.87±1.29
根据表3可知，本发明的矿区土壤修复剂相较于空白组以及仅施加腐熟污泥组，其对植物的发芽率、根系生长具有较强的促进作用，能够增加矿区修复过程中绿植的覆盖率，并促进植物生长速度。
本发明采用腐熟污泥和经细菌的富集、筛选获得的解磷菌剂复合获得矿区修复剂，在污泥腐熟的过程中先利用污泥中本身含有的细菌进行发酵，发酵过程中能够产生腐植酸，对矿区中重金属离子具有一定的吸附作用，防止重金属离子的流失，再通过嗜热细菌的作用下能够腐熟污泥和混合辅料，形成营养物质丰富的有机肥，并与解磷菌剂配合，将土壤中的磷转化为有效磷，使得植物能够更有效的对磷的吸收，且该解磷菌剂在重金属离子浓度较高的情况下生长良好，能够持续起到解磷作用，从而提高矿区土壤修复过程中种子的发芽率，促进植物生长，同时也能够提高植物抗病害能力，达到矿区土壤修复效果。
以上所述实施例，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明的技术范围内，根据本发明的技术方案及其构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。

Claims (4)

1.一种矿区土壤修复剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括：
腐熟污泥制备：将含水量小于70%的城市生活污泥与混合辅料按照质量比为1:0.8-1.5充分混匀后堆成圆锥形堆体，在堆体的底部进行曝气并进行温度监控，待堆体堆中温度达到65℃时，加入嗜热微生物菌剂，在温度为65-70℃条件下堆肥7-10天获得腐熟污泥；所述腐熟污泥制备中嗜热微生物菌剂为CFU之比为1:0.8-1.2的嗜热脂肪芽孢杆菌与嗜热侧孢霉，所述腐熟污泥制备中混合辅料由粒径小于5cm的玉米秸秆、木屑和蘑菇渣按照质量比为1:0.5-0.8:0.3-0.5混合制得；
解磷菌剂制备：
S1：将1-3g根际土壤加入至140-160ml富集培养基中，在28-32℃转速为100rpm条件下震荡培养20-26h，获得富集混悬液；其中，所述富集培养基由蛋白胨、牛肉浸膏、氯化钠和蒸馏水配置灭菌获得；所述根际土壤选取铅锌矿区中自然生长的植物醉鱼草的根和根际土壤；
S2：将8-12ml所述富集混悬液加入至140-160ml所述富集培养基中，在28-32℃转速为100rpm条件下震荡培养20-26h，静置获取富集培养上清液即为细菌富集液；
S3：将所述细菌富集液进行稀释后涂布至选择培养基上在28-32℃条件下进行选择培养获得透明圈菌斑，并将所述透明圈菌斑接种至传代培养基上在28-32℃条件下进行传代扩大培养，获得解磷菌液；所述选择培养基由浸提液、蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、硫酸镁、琼脂和蒸馏水配置灭菌获得；所述浸提液为选取广东凡口铅锌矿区自然生长的植物根际土壤混合风干后，按照固液比为1：8-12的质量比加入至灭菌后的蒸馏水中，震荡处理后离心灭菌后的上清液，即为浸提液；所述传代培养基由蛋白胨、葡萄糖、磷酸钙、磷酸镁和蒸馏水配置灭菌获得；
所述富集培养基中各原料的浓度为：蛋白胨10g/L，牛肉浸膏3g/L，氯化钠5g/L，pH为7.4-7.6；
所述选择培养基中各原料的浓度为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙 10g/L，硫酸镁0.5g/L，浸提液40 ml/L，琼脂20g/L，pH为7.2；
所述传代培养基中各原料的浓度为：蛋白胨5g/L，葡萄糖10g/L，磷酸钙 10g/L，硫酸镁0.5g/L，pH为7.2；
将所述腐熟污泥和解磷菌液按照比例为1×109-1011CFU/kg腐熟污泥配制获得矿区土壤修复剂；
解磷菌剂制备步骤S3中所述震荡处理后离心取上清液，获得浸提液的步骤具体包括：
将所述植物根际土壤风干后加入到蒸馏水中混合，在转速为100-120rpm条件下震荡25-35min后，在4000rpm条件下离心8-10min，取上清液，在121℃的条件下灭菌20min后得到的液体即为浸提液。
2.根据权利要求1所述的矿区土壤修复剂制备方法，其特征在于，所述腐熟污泥制备中曝气量为4L/min。
3.一种矿区土壤修复剂，其特征在于，所述修复剂按照权利要求1或2所述制备方法获得。
4.一种矿区土壤修复剂在修复矿区土壤的应用，其特征在于，所述应用具体包括：
将权利要求3所述的矿区土壤修复剂施加至矿区废弃地上；
选择类芦、醉鱼草、苜蓿种子并按照10:1:10的比例混合进行播种，并采用所述矿区土壤修复剂均匀覆盖，浇水灌溉。
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