CN114921362A - 具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌及其应用 - Google Patents

具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌及其应用，该油茶内生放线菌的菌种保藏编号为CGMCC No.22968。本发明油茶内生放线菌能够溶解多种难溶性磷，特别是能够高效溶解难溶性磷—磷酸铁和磷酸铝，表现出非常优异的磷溶解能力，不仅可以高效地活化难溶性磷，增加有效磷的含量，从而提高植物对磷素的吸收和利用，同时该油茶内生放线菌还能促进植物的生长，可作为土壤改良剂和生物肥料，在减少肥料使用量的前提下也能显著促进植物(如油茶)的生长，为研制出适用于我国南方酸性红壤的微生物肥料、土壤改良剂等提供新的资源，对促进酸性土壤的开发利用以及促进酸性土壤中植物的生长和产量的提高具有重要意义。

Description

具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物肥料及酸性红壤作物逆境保护技术领域，涉及一株具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌及其应用。
背景技术
油茶是我国特有的木本食用油料树种，在我国区域经济中具有重要地位。磷是影响油茶生长的重要营养元素，然而，油茶种植区酸性红壤有效磷缺乏已成为限制油茶产量提升的重要因素之一。当前，解决酸性红壤缺磷问题主要是通过施加磷肥来解决，然而，南方油茶林地多为酸性红壤，由于其特殊的成土过程，酸性红壤具有很强的富铁铝化作用，使得当季施用的大部分磷肥被吸附和固定，成为难以被植物直接吸收利用的难溶性磷，严重制约着油茶产业的蓬勃发展。
土壤中难溶性磷的转化与活化受到诸多因素的影响，例如有机酸、根系分泌物、微生物活动等均对难溶性磷有较强的活化效应，可促进其向活性更高的磷组分转化。随着绿色农业可持续发展潮流的兴起，立足我国当前化肥农药零增长的战略需求，利用微生物活化土壤难溶性磷已成为重要的发展趋势。但由于土壤自身的缓冲能力、微生物分泌的磷酸酶受到分解、有机酸易吸附土壤颗粒等原因，普通土壤溶磷菌的实际应用效果并不理想。植物内生菌作为植物微生态系统的重要组成部分，与宿主植物之间存在着复杂的互利共惠关系。内生菌定殖于植物体内，由于占据有利的生态位，相比土壤微生物能更紧密地参与植物逆境胁迫调控，因此在促进植物生长发育方面扮演着重要角色。
目前，已报道的溶磷内生放线菌中，大多仅对难溶性磷中的磷酸钙具有溶解作用，但是它们并不能或者极难溶解如磷酸铁、磷酸铝等更难溶性磷，因而将它们作为生物肥料或改良剂施加到酸性土壤中时，仍然难以解决难溶性磷不能被植物直接吸收利用的现实问题。另外，尚未见到关于油茶内生放线菌在溶解难溶性磷的相关报道，因而其在林木生产中的应用也十分有限。
因此，如何合理利用植物内生菌资源，释放土壤中的难溶性磷，对于减少磷肥使用量，提高土壤中磷的有效性，促进油茶生长、提高产量具有重要意义。
发明内容
本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一株具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌及其应用，该油茶内生放线菌可以高效地活化难溶性磷，增加有效磷的含量，有利于提高植物对磷素的吸收和利用，进而能促进植物的生长，同时该油茶内生放线菌也具有固氮、产IAA和铁载体等多种促生长功能，也能进一步促进植物的生长。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：
一株具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌，所述油茶内生放线菌为链霉菌，命名为Streptomyces sp.CoT10，其菌种保藏编号为CGMCC No.22968。
上述的具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌，进一步改进的，所述油茶内生放线菌是从油茶无性系“湘林1号”的根部分离、纯化后获得。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种土壤改良剂，所述土壤改良剂包含上述的油茶内生放线菌。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的土壤改良剂在活化难溶性磷中的应用。
上述的应用，进一步改进的，包括以下步骤：将土壤改良剂与含有难溶性磷的土壤混合进行培育，完成对土壤中难溶性磷的活化。
上述的应用，进一步改进的，所述土壤为酸性土壤；所述酸性土壤为酸性红壤。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种生物肥料，所述生物肥料包含上述的油茶内生放线菌。
作为一个总的技术构思，本发明还提供了一种上述的生物肥料在促进植物生长中的应用。
上述的应用，进一步改进的，包括以下步骤：将生物肥料施加到土壤中，对植物进行培育。
上述的应用，进一步改进的，所述生物肥料以菌悬液的形式施加到土壤中；所述生物肥料菌悬液的施加量为30mL/株～100mL/株；所述生物肥料菌悬液中油茶内生放线菌孢子浓度为106个/mL～108个/mL；所述土壤为酸性土壤；所述酸性土壤为酸性红壤；所述植物为木本油料作物；所述木本油料作物为油茶。
上述的应用，更进一步改进的，所述生物肥料菌悬液的施加量为50mL/株；所述生物肥料菌悬液中油茶内生放线菌孢子浓度为107个/mL。
与现有技术相比，本发明的优点在于：
针对现有的放线菌难以溶解难溶性磷的缺陷问题，本发明创造性的提供了一株具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌，该油茶内生放线菌为链霉菌，其命名为Streptomyces sp.CoT10，它是从国家油茶种质资源收集保存库(湖南长沙)试验林场内的油茶根部分离和纯化获得植物内生放线菌。与其他现有常规内生菌或溶磷菌不同，本发明的油茶内生放线菌能够溶解多种难溶性磷，特别是能够高效溶解难溶性磷—磷酸铁和磷酸铝，表现出非常优异的磷溶解能力，因而可以高效地活化难溶性磷，增加有效磷的含量，从而提高植物对磷素的吸收和利用，进而能够促进植物的生长。同时该油茶内生放线菌还具有固氮、产IAA和铁载体等多种促生长功能，也能进一步促进植物的生长。在实际应用中，本发明的油茶内生放线菌菌株，可作为土壤改良剂和生物肥料，不仅可以用于活化土壤(如酸性红壤) 中的难溶性磷，增加土壤中有效磷的含量，其中对磷酸钙的溶解量高达345.55mg/L，对磷酸铁的溶解量高达72.49mg/L，对磷酸铝的溶解量高达45.38mg/L。而且该油茶内生放线菌IAA 产量高达11.39mg/L，铁载体产量高达89.06，因而可以在减少肥料使用量的前提下也能显著促进植物(如油茶等木本油料作物)的生长，为研制出适用于我国南方酸性红壤的微生物肥料、土壤改良剂等提供新的资源，对促进酸性土壤的开发利用以及促进酸性土壤中植物的生长和产量的提高具有重要意义。
附图说明
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整的描述。
图1为本发明实施例1中油茶内生放线菌菌株在不同类型培养基上的菌落形态图。
图2为本发明实施例1中油茶内生放线菌菌株的进化树图。
图3为本发明实施例2中油茶内生放线菌菌株对不同类型难溶性磷的溶解量对比图。
图4为本发明实施例3中油茶内生放线菌菌株对酸性红壤中难溶性磷的活化效果图。
图5为本发明实施例4中油茶内生放线菌菌株对油茶苗木生长的影响图。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体优选的实施例对本发明作进一步描述，但并不因此而限制本发明的保护范围。
以下实施例中，若无特别说明，所采用的原料和仪器均为市售，所采用工艺为常规工艺，所采用设备为常规设备。
实施例1
一株具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌，该油茶内生放线菌为链霉菌，命名为Streptomyces sp.CoT10，其菌种保藏编号为CGMCC No.22968，保藏日期为2021年7 月28日，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)。保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号。该油茶内生放线菌的16S rRNA基因序列，如序列表SEQ ID NO.1所示。
上述本实施例中的具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌，是从国家油茶种质资源收集保存库(湖南长沙)所在林场的油茶无性系“湘林1号”的根部分离纯化获得的植物内生放线菌，该油茶内生放线菌菌株的分离、纯化和筛选过程为：将油茶无性系“湘林1号”根部洗去泥沙后进行植物表面消毒，风干后将根切割为1厘米左右的小段，置于内生菌分离培养基(TWYE)，30℃恒温培养，待内生放线菌析出，再划线至固体PDA平板上进行纯化直至获得其纯培养物。将分离纯化得到的内生放线菌纯培养物接种于含有磷酸钙固体培养基中恒温静置培养，每天观察溶磷圈的产生情况，进而筛选得到溶磷效果好的菌株。
上述本实施例中的具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌的生物学鉴定及生理生化特性：
1.菌株的形态特征
菌株形态特征：将分离纯化得到的油茶内生放线菌CoT10划线接种至不同类型的固体培养基中，将平板倒置于恒温培养箱，30℃培养7天，菌株的基内菌丝和气生菌丝详细情况如图1所示。由图1可知，油茶内生放线菌CoT10在不同类型的固体培养基中均能生长且产生基内和气生菌丝，其中该菌株在ISP2、ISP3、ISP4、ISP5和葡萄糖天门冬素这5种固体培养基上的生长状况要优于其他3种固体培养基，并且CoT10在这5种适宜生长的固体培养基中均能产生白色或黄色气生菌丝和大量孢子以及透明的基内菌丝，相比较而言，CoT10最适宜生长的培养基为ISP2固体培养基。
2.菌株分子生物学鉴定
制备油茶内生放线菌CoT10的孢子悬液，并将其添加于ISP2液体培养基中30℃、170rpm 摇菌培养5天。使用上海生工DNA提取试剂盒并按照说明书方法提取CoT10的基因组DNA。采用聚合酶链反应(PCR)扩增16S rRNA序列，通用引物为27f和1492r。对纯化后的PCR产物送公司测序，结果如序列表SEQ ID NO.1。将菌株的16S rRNA序列与NCBI网站中的模式菌株核酸数据库进行Blast同源性比对(www.ncbi.nlm.nih.gov/Blast)，利用MEGA 5.1软件采用邻接法构建系统发育树，结果如图2所示。由图2可知，CoT10在系统进化树中处于独立的分支，进一步利用TYPE(STRAIN)GENOME SERVER网站(https://tygs.dsmz.de/)将CoT10与其他模式菌株进行基因组比较，发现可能是一个潜在的新种，将其鉴定为链霉菌属(Streptomyces)，并命名为Streptomyces sp.CoT10。该油茶内生放线菌的全基因组信息已上传至NCBI网站(https://www.ncbi.nlm.nih.gov)，GenBank登录号：JAIQYX000000000.1。
3.菌株相关生理生化鉴定
分别对油茶内生放线菌CoT10进行产明胶检测、产蛋白酶检测、产淀粉酶检测、产纤维素酶检测、产半纤维素酶检测、产黑色素检测、产IAA检测、溶磷能力检测、固氮能力检测、产铁载体能力检测等一系列生理生化实验，结果如表1所示。由表1可知，该菌株能够产生一系列酶，主要包括：过氧化氢酶、明胶酶、蛋白酶、淀粉水解酶、纤维素酶、半纤维素酶。同时该菌株具有产IAA、固氮、溶磷、铁载体等多种促生长相关的物质。进一步通过色氨酸比色法定量检测该菌株的IAA产量为11.39mg/L；CAS检测液定量检测该菌株所产铁载体的产量为89.06。
表1CoT10菌株的促生长特性及所产活性物质检测
酶与次生代谢产物检测 CoT10
几丁质酶 -
过氧化氢酶 +
明胶酶 +
蛋白酶 +
淀粉水解酶 +
纤维素酶 +
半纤维素酶 ±
酪蛋白酶 -
HCN -
H<sub>2</sub>S -
IAA +
黑色素 +
溶磷 +
固氮 +
解钾 -
铁载体 +
注：表1中，+表示阳性结果；±表示弱阳性结果；-表示阴性结果
实施例2:
考察油茶内生放线菌CoT10菌株对不同类型难溶性磷的溶解能力
将实施例中1的油茶内生放线菌CoT10接种到含有不同类型难溶性磷(磷酸钙、磷酸铁、磷酸铝)液体培养基中，30℃，170rpm震荡培养7天，培养结束后4000rpm离心20min，取上清液用钼锑抗比色法，在波长700nm下测定发酵液中的有效磷含量。结果如图3所示，CoT10能够有效地溶解不同类型的难溶性磷，对磷酸钙的溶解度最高(345.55mg/L)，其次是磷酸铁(72.49mg/L)和磷酸铝(45.38mg/L)。
众所周知，磷酸钙普遍存在于石灰性土壤中，酸性土壤中所占比例最大的难溶性磷是磷酸铁和磷酸铝，而后两种难溶性磷在正常情况下很难被普通的溶磷菌所溶解，况且溶解磷酸铁所需要的pH值要达到2.0至2.5，普通的溶磷菌很难达到这么低的pH水平。通过将CoT10 与其他溶磷细菌、溶磷放线菌和溶磷真菌进行溶磷能力比对，结果如表2所示。例如，溶磷细菌Bacillus coagulans C45对磷酸铝的溶解量只有9.5mg/L，对磷酸铁的溶解量也只有6.4 mg/L。虽然Brevibacillus borstelensis SH168表现出较高的磷酸铝溶解活性(37.0mg/L)，但它却不能溶解磷酸铁。溶磷放线菌Streptomyces thermophilus J57也只能溶解磷酸钙，不能溶解磷酸铝和磷酸铁，这些溶磷菌都远远低于CoT10对磷酸铁和磷酸铝的溶解能力。因此， CoT10除溶解磷酸钙以外，还明显具有很强的溶解磷酸铁和磷酸铝的能力，特别适合用于改善富含磷酸铁和磷酸铝的南方酸性红壤中有效磷缺乏的问题。
表2不同溶磷菌对不同无机磷溶解能力的对比
Figure BDA0003604108310000061
注：表2中，ND表示未检测到。
实施例3：
一种土壤改良剂，具体为油茶内生放线菌。
上述本实施中的土壤改良剂在活化难溶性磷中的应用，具体为利用实施例1中的油茶内生放线菌活化土壤中的难溶性磷，包括以下步骤：
将酸性土壤经过2毫米孔径的标准筛子并将其进行灭菌处理，之后再在40℃下干燥至恒重。收集ISP2液体培养5天后的CoT10菌丝体(实施例1)，加入到装有60克过筛灭菌的红壤土的瓶子中，将土壤和菌丝体充分混合，再在30℃下恒温静止培养，只加水作为对照。分别在0、7、14、21和28天收集土壤样品，每个处理三个重复。按照Hedley磷分级的操作方法，从0.5克干土中依次提取Hedley磷组分并测量磷含量，以此来确定CoT10菌株对酸性红壤中磷活化的影响。土壤中的磷成分是复杂的，不同的磷组分通过相互转化，并始终保持着磷动员和固定化之间的动态平衡。在Hedley磷分级的基础上，无机磷组分可以归纳为易溶磷(Resin-P、NaHCO3-Pi)、中等易溶磷(NaOH-Pi)和稳定态磷(D.HCl-Pi、C.HCl-Pi 和Residual-P)。根据Hedley磷分级的结果，如图4所示。由图4可知，在CoT10的作用下，易溶和中度易溶的无机磷含量升高，而稳定态磷D.HCl-Pi、C.HCl-Pi和Residual-P含量则成反比下降，表明稳定的难溶性磷的正向转化是由CoT10的活化作用引起的，这也进一步说明CoT10可有效提高酸性红壤中有效磷的含量，为植物的生长提供充足的磷源，进而促进植物的生长，可用于制备适用于南方酸性红壤地区的土壤改良剂。因此，本发明油茶内生放线菌可作为改良剂用于活化土壤中的难溶性磷。
实施例4:
一种生物肥料，具体为由油茶内生放线菌培育得到的油茶内生放线菌菌悬液。
上述本实施中的生物肥料在促进植物生长中的应用，具体为利用油茶内生放线菌的孢子悬液促进植物在土壤中的生长，包括以下步骤：
将实施例中的油茶内生放线菌CoT10接种至大豆甘露醇琼脂培养基(MS)平板上，生长10-14天待孢子成熟后，将孢子制成浓度为107个/mL的孢子悬液。将孢子悬液对油茶苗木进行灌根处理，每株苗施加50mL孢子液。试验期间所有试验苗木只进行正常浇水，不进行其他施肥。待油茶苗木生长一段时间后对油茶苗木的相关指标进行测定，测量油茶苗木株高、地径、鲜重、干重等生长指标，结果见图5。由图5可知，CoT10的施加能明显地促进油茶苗木的生长，其中CoT10处理组的油茶苗木春梢长度连续3个月明显高于对照组，平均增长了41.64％；同时，与对照组相比，CoT10处理组的鲜重和干重也显著增加，尤其是根系生物量增加了超过1倍，地径也比对照组增加了40.48％，说明内生菌CoT10接入油茶根部后，能迅速地与油茶形成共生关系，并进一步促进油茶苗木的生长。因此，本发明油茶内生放线菌可作为生物肥料用于促进植物的生长。
综合上述结果可知，与其他现有常规放线菌不同，本发明的油茶内生放线菌能够溶解多种难溶性磷，特别是能够高效溶解难溶性磷—磷酸铁和磷酸铝，表现出非常优异的磷溶解能力，因而可以高效地活化难溶性磷，增加有效磷的含量，从而提高植物对磷素的吸收和利用，进而能够促进植物的生长，同时该油茶内生放线菌还具有固氮、产IAA和铁载体等多种促生长功能，也能进一步促进植物的生长。在实际应用中，本发明的油茶内生放线菌菌株，可作为土壤改良剂和生物肥料，不仅可以用于活化土壤(如酸性红壤)中的难溶性磷，增加土壤中有效磷的含量，因而可以在减少肥料使用量的前提下也能显著促进植物(如油茶等木本油料作物)的生长，为研制出适用于我国南方酸性红壤的微生物肥料、土壤改良剂等提供新的资源，对促进酸性土壤的开发利用以及促进酸性土壤中植物的生长和产量的提高具有重要意义。
以上实施例仅是本发明的优选实施方式，本发明的保护范围并不仅局限于上述实施例。凡属于本发明思路下的技术方案均属于本发明的保护范围。应该指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下的改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 湖南大学
<120> 具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1485
<212> DNA
<213> 链霉菌属放线菌（Streptomyces sp. CoT10）
<400> 1
aaaagagaga gggggggccg ctcaggacga acgccaattg gcggcgtgct taacacatgc 60
aagtcgaacg atgaaccact tcggtgggga ttagtggcga acgggtgagt aacacgtggg 120
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caaggcttga catacaccgg aaagcattag agatagtgcc ccccttgtgg tcggtgtaca 1020
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cgcaaccctt gttctgtgtt gccagcatgc ccttcggggt gatggggact cacaggagac 1140
cgccggggtc aactcggagg aaggtgggga cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct 1200
tgggctgcac acgtgctaca atggccggta caatgagctg cgataccgtg aggtggagcg 1260
aatctcaaaa agccggtctc agttcggatt ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg 1320
agtcgctagt aatcgcagat cagcattgct gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac 1380
accgcccgtc acgtcacgaa agttggtaac acccgaagcc ggtggcccaa ccccttgtgg 1440
gagggagctg tcgaaggtgg gactagcgat tgggacgaag tcgca 1485

Claims (10)

1.一株具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌，其特征在于，所述油茶内生放线菌为链霉菌，命名为Streptomyces sp.CoT10，其菌种保藏编号为CGMCC No.22968。
2.根据权利要求1所述的具有溶解难溶性磷和促生长功能的油茶内生放线菌，其特征在于，所述油茶内生放线菌是从油茶无性系“湘林1号”的根部分离、纯化后获得。
3.一种土壤改良剂，其特征在于，所述土壤改良剂包含权利要求1或2所述的油茶内生放线菌。
4.一种如权利要求3所述的土壤改良剂在活化难溶性磷中的应用。
5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将土壤改良剂与含有难溶性磷的土壤混合进行培育，完成对土壤中难溶性磷的活化；所述土壤为酸性土壤；所述酸性土壤为酸性红壤。
6.一种生物肥料，其特征在于，所述生物肥料包含权利要求1或2所述的油茶内生放线菌。
7.一种如权利要求6所述的生物肥料在促进植物生长中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，包括以下步骤：将生物肥料施加到土壤中，对植物进行培育。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述生物肥料以菌悬液的形式施加到土壤中；所述生物肥料菌悬液的施加量为30mL/株～100mL/株；所述生物肥料菌悬液中油茶内生放线菌孢子浓度为106个/mL～108个/mL；所述土壤为酸性土壤；所述酸性土壤为酸性红壤；所述植物为木本油料作物；所述木本油料作物为油茶。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述生物肥料菌悬液的施加量为50mL/株；所述生物肥料菌悬液中油茶内生放线菌孢子浓度为107个/mL。
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