KR101910275B1

KR101910275B1 - 신규한 스트렙토마이세스 그리세우스 knu-05 균주 및 이의 이용

Info

Publication number: KR101910275B1
Application number: KR1020170054265A
Authority: KR
Inventors: 신재호; 박영준; 박창언; 김민철; 조형우
Original assignee: 경북대학교 산학협력단
Priority date: 2017-04-27
Filing date: 2017-04-27
Publication date: 2018-10-19

Abstract

본 발명은 식물생장 촉진 활성, 항진균 활성, 또는 질소 고정 활성을 가지는 신규한 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주 및 이를 이용한 식물생장 촉진용 및 식물병제 방제용 미생물 제제 등에 관한 것이다. 상기 KNU-05 균주는 식물생장 촉진 활성 및 질소 고정 활성을 갖는 것으로 확인되었는바 친환경 비료로써 이용이 가능하고, 식물에 잎집무늬마름병과 뿌리썩음병을 유발하는 식물 병원성 진균인 Rhizoctonia solani 및 Pythium ultimum 에 대해 항진균 활성을 갖는 것으로 확인되었는바 친환경 농약으로써도 이용이 가능하다. 따라서 본 발명에 따른 상기 KNU-05 균주가 친환경적 농법으로써 다양하게 이용될 수 있을 것으로 기대된다.

Description

신규한 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주 및 이의 이용 {Novel Streptomyces griseus KNU-05 strain and uses thereof}

본 발명은 신규한 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주(수탁번호 KCTC 13234BP) 및 이의 이용에 관한 것이다.

식물의 생장에 가장 중요한 원소로는 질소, 인산, 및 칼륨 등이 알려져 있다. 이러한 원소들은 식물의 생장에 전반적으로 중요한 역할을 하므로 질소를 포함하는 비료를 식물의 재배에 많이 사용하고 있다. 하지만 질소 비료의 과량 시비는 토양의 영양집적현상을 야기하고, 이로 인해 식물의 황화현상이 발생하거나 웃자람이 발생하여 식물의 생장에 오히려 방해가 되고 있는 실정이다.

최근 이러한 문제를 해결하기 위해 질소 순환 능력을 가지고 있는 미생물에 대한 연구가 진행 중이며 대표적으로 광합성 세균이 여기에 해당한다. 광합성 세균이란 빛을 이용하여 탄소동화작용을 하는 미생물을 말한다. 이러한 광합성 세균들 중에는 질소를 고정하는 능력을 가진 광합성 세균이 존재하며 근권에 존재하여 식물의 생육 촉진, 토양의 비옥화, 연작장해의 개선과 같은 식물생장에 이로운 역할을 하는 것으로 알려져 있다.

최근 화학 농약에 대한 안전불감, 환경오염, 잔류성 문제 등과 같은 문제점이 화두가 되고 있어 친환경 농법에 대한 연구가 많이 진행 중이며 농업 유용 미생물을 이용한 친환경 농법의 개발 역시 진행 중에 있다. 이로 인하여 화학 농약 및 비료의 시비량에 따라 구분된 친환경 농산물 품질인증제도가 도입되었고, 이 제도를 시행하는 농가에서는 실제적으로 화학 농약 및 비료의 시비를 줄여 친환경적으로 식물을 재배하는 것으로 알려져 있다. 또한, 소비자 역시 well-being에 대한 관심이 증대되어 친환경 농산물 인증을 받은 농산물 수요는 꾸준히 증가하고 있는 추세이다.

현재 사용 가능한 화학 농약 및 비료의 종류가 줄어들고 있는 실정이며, 상용화된 농업 유용 미생물은 식물 병원성 미생물에 대한 길항효과, 토양 내 무기 영양분의 가용화, 다양한 식물생장 촉진 등의 효과 등을 가지고 있으나, 향후 화학 농약 및 비료를 대체할 수 있는 미생물 제제에 대한 꾸준한 연구 개발이 필요하다. 이와 관련하여 국내 공개특허 제2015-0105546호에서는 식물생장을 촉진하는 엔테로박터 루드위지아이 SJR3 균주를 제시한 바 있다.

이에, 본 발명자들은 식물생장을 촉진하는 미생물을 분리하고, 상기 분리된 미생물에 식물생장 촉진, 인산 가용화, 식물에 잎집무늬마름병과 뿌리썩음병을 유발하는 식물 병원성 진균인 Rhizoctonia solani 및 Pythium ultimum 에 대한 항진균 활성을 확인함으로써 친환경 농법 미생물로 사용될 수 있도록 하였다.

본 발명자들은 친환경적인 식물생장 촉진용 또는 항진균용 미생물 제제를 개발하고자 노력한 결과, 본 발명의 신규한 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주에 식물생장 촉진 활성, 질소 고정 활성, 및 항진균 활성이 있다는 것을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

이에, 본 발명의 목적은 식물생장 촉진 효과 또는 항진균 효과를 갖는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주(수탁번호 KCTC 13234BP) 및 이를 이용한 미생물 제제를 제공하는데 있다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제 조성물을 이용하여 식물병해 방제방법 및 식물생장 촉진방법을 제공하는 것을 다른 목적으로 한다.

그러나 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당해 기술분야의 통상의 기술자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 식물생장 촉진 효과 또는 항진균 효과를 갖는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주(수탁번호 KCTC 13234BP)을 제공한다.

본 발명의 일구현예로서, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열 또는 그에 상보적인 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 다른 구현예로서, 상기 식물생장 촉진은 옥신 생성능, 질소 고정능, 또는 사이드로포어 활성능에 의해 달성되는 것을 특징으로 한다.

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물병해 방제용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물생장 촉진용 미생물 제제를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 포함하는 식물생장 촉진용 미생물 비료를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물생장 촉진방법을 제공한다.

본 발명에 따른 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주는 식물생장 촉진 활성 및 질소 고정 활성을 갖는 것으로 확인되었는바, 친환경 비료로써 이용이 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주는 식물에 잎집무늬마름병과 뿌리썩음병을 유발하는 식물 병원성 진균인 Rhizoctonia solani 및 Pythium ultimum 에 대해 항진균 활성을 갖는 것으로 확인되었는바, 친환경 농약으로써 이용이 가능하다.

이에 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주가 갖는 식물생장 촉진 활성, 질소 고정 활성, 및 항진균 활성을 이용하여 상기 KNU-05 균주를 친환경 농법으로 유용하게 이용할 수 있을 것으로 기대된다.

도 1은 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus) KNU-05 균주의 옥신 생성량을 나타낸 것이다.
도 2는 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주의 질소 고정 활성을 확인한 사진이다.
도 3은 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주의 사이드로포어 활성을 확인한 사진이다.
도 4는 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주의 식물 병원성 진균인 Rhizoctonia solani 및 Pythium ultimum 에 대한 항진균 활성을 확인한 사진이다.
도 5는 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주의 형태적 특성을 그람 염색법을 이용하여 확인한 사진이다.
도 6은 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자(16S rRNA gene)의 염기서열을 나타낸 것이다.
도 7은 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주의 계통분류학적 모식도를 나타낸 것이다.

본 발명은 식물생장 촉진 효과 및/또는 항진균 효과를 가지는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주(수탁번호 KCTC 13234BP)를 제공한다.

상기 KNU-05 균주의 16S rRNA를 암호화하는 유전자(16S rRNA gene)의 서열은 서열번호 1로 표시되는 것이다.

상기 KNU-05 균주의 16S rRNA의 염기서열은 공시 균주인 Streptomyces griseus subsp . griseus KCTC 9080^T의 16S rRNA gene과 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 신규한 균주로 판명되었다. 이에 본 발명자는 상기 수득된 신규한 균주를 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus) KNU-05 균주로 명명하고, 2017년 3월 30일자로 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC)에 기탁하여 수탁번호 KCTC 13234BP 를 부여 받았다.

본 발명의 상기 KNU-05 균주는 토양시료로부터 분리 및 동정하여 얻을 수 있으며, 질산을 환원시키고, 혐기 조건하에서 포도당을 에너지원으로 사용하며, D-만노오스, D-솔비톨, D-만니톨, D-글루코오스, D-슈크로오스 등의 탄소원을 에너지원으로 사용함을 확인하였다(표 1 참조).

한편, 식물은 생장과 발달을 조절하여 여러 환경 변화에 대처 및 적응하는 시스템을 가지고 있는데, 특히 식물의 발달 조절은 주로 외부 환경과 식물의 내재적 발달 프로그램과의 상호작용을 통해 일어나는 것으로, 다양한 식물 호르몬이 상기 상호작용에 필수적인 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다. 특히 옥신(Auxin, IAA)은 식물의 생장 및 신장에 관여하는 대표적인 식물생장 촉진 호르몬으로 알려져 있다.

이에, 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주가 다른 균주와 비교하였을 때 현저하게 많은 양의 옥신을 생성하는 것을 옥신량 측정 실험을 통해 확인하였는바(도 1 및 실시예 1-2 참조), 이는 상기 KNU-05 균주가 식물의 생장 및 신장을 촉진할 가능성이 있음을 시사한다.

한편, 질소(N)는 식물의 생장에 필수적인 원소로, 대기 중에 질소의 비율은 약 70%를 차지하지만, 식물의 경우 대기 중의 질소를 그대로 이용하지 못하므로, 식물 생존에 있어 대기 중에 질소를 토양에 고정시킬 수 있는 미생물이 필요하다. 현재 농가에서는 질소가 포함된 화학비료를 이용하여 토양에 질소를 공급하고 있으나, 이는 토양의 영양집적현상 및 환경오염의 문제가 있다. 따라서 질소 고정능을 갖는 미생물을 이용하면 화학비료의 사용량을 줄이면서 토양의 비옥화, 식물 생육 촉진의 효과를 기대할 수 있다.

이에, 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주가 질소가 없는 배지에서 생존 및 생장하는 것을 관찰하여, 상기 KNU-05 균주에 질소 고정능이 있음을 확인하였는바(도 2 및 실시예 1-3 참조), 이는 상기 KNU-05 균주가 식물의 생장을 촉진할 가능성이 있음을 시사한다.

한편, 사이드로포어(siderophore)는 토양 내의 불용성 미네랄을 가용화할 수 있는 화합물로써, 특히 토양 내의 미생물에 의해 합성되고 분비되는 사이드로포어는 토양 내의 미네랄 중에서도 철(Fe)과 결합하여 식물의 뿌리로 흡수되어 식물의 생장에 이용될 수 있도록 한다. 철은 식물체 내에서 효소 반응, 산소 물질대사 (oxygen metabolism), 전자전달계, 및 DNA와 RNA 합성을 촉진시키는 역할을 수행하는 것으로, 식물체 내로 사이드로포어에 의한 철의 흡수는 식물의 생육을 촉진시킨다.

이에, 본 발명의 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주가 siderophore plate assay 실험을 통해 사이드로포어 활성을 갖는 것을 확인하였는바(도 3 및 실시예 1-4 참조), 이는 상기 KNU-05 균주가 식물의 생장을 촉진할 가능성이 있음을 시사한다.

상기에 따라, 상기 KNU-05 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물은 식물의 생장을 촉진하기 위한 미생물 제제에 이용될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

또한, 상기 KNU-05 균주는 다양한 식물에 입짚무늬마름병과 뿌리썩음병을 유발하는 식물 병원성 진균인 Rhizoctonia solani 및 Pythium ultimum 에 대해 항진균 활성을 갖으며, 상기 항진균 활성은 균주와 식물 병원성 진균의 대치배양을 통해 확인하였다(도 4 및 실시예 1-5 참조). 따라서 상기 KNU-05 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 및 상기 배양물의 건조물은 식물병해 방제용 미생물 제제에 포함될 수 있으며, 바람직하게는, 입짚무늬마름병과 뿌리썩음병 방제용 미생물 제제에 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 KNU-05 균주의 형태학적 특성은 그람 염색법(gram staining)을 통해 확인하였고(도 5 및 실시예 2-1 참조), 상기 KNU-05 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자는 16S rRNA gene sequencing을 통해 확인하였다(도 6 및 실시예 3 참조). 상기 KNU-05 균주의 16S rRNA를 암호화 하고 있는 유전자 (16S rRNA gene)를 이용한 계통분류학적 모식도를 Molecular Evolutionary Genetics Analysis 6.0 version에서 확인하였다(도 7 및 실시예 3 참조).

상기에 따라, 본 발명은 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군에서 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물생장 촉진용 및 식물병해 방제용 미생물 제제를 제공할 수 있는 것이고, 상기 미생물 제제를 처리함으로써, 식물생장을 촉진하는 방법 및 진균의 생육을 억제하는 방법을 제공할 수 있는 것이다. 상기 미생물 제제는 그 사용 목적에 부합하게 미생물 농약 및/또는 비료의 유효성분으로 포함될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명에서 상기 배양물은 균주를 배양한 PDK(potato dextrose peptone) 배지, 또는 YM (Yeast Malt) 배지로부터 분리하여 얻은 것이 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 미생물 제제는 통상적인 방법으로 식물생장 촉진용 또는 항진균용으로 제형화할 수 있으며 건조분말 형태 또는 액상형태로 제조할 수 있는 것이다. 구체적으로, 본 발명에 의한 미생물 제제 조성물은 액상 비료 또는 농약 형태로 제조될 수 있으며, 이에 증량제를 첨가하여 가루분말의 형태로 이용하거나 이를 제형화하여 과립화시킬 수도 있다. 그러나 그 제형에 특별히 한정되지는 않는다. 바람직하게는 화학비료를 대체하기 위한 식물생장 촉진 생물비료로 제형화 할 수 있고, 즉 화학비료 공급이 제한된 친환경 유기농업에서 이를 극복하기 위한 생물비료로 제형화가 가능하다.

상기 미생물 제제는 균주 또는 이의 배양물에 첨가제, 증량제, 영양제 등의 부가제를 첨가하여 제조할 수 있다. 이때, 첨가제로는 폴리카복실레이트, 소듐 리그노설포네이트, 칼슘 리그노설포네이트, 소듐 다이알킬 설포석시네이트, 소듐 알킬 아릴 설포네이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 페닐 에테르, 소듐 트리폴리포스페이트, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 포스포릭 에스테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 에테르, 폴리옥시에틸렌 알킬 아릴 폴리머, 폴리옥시알킬온 알킬 페닐 에테르, 폴리옥시에틸렌 노닐 페닐 에테르, 소듐 설포네이트 나프탈렌 포름알데히드, 트리톤 100, 및 트윈 80으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있고, 증량제 및 영양제로는 skim milk(배지), 콩가루, 쌀, 밀, 황토, 규조토, 벤토나이트(bentonite), 덱스트린, 포도당, 전분, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용하며, 붕해제로는 벤토나이트(bentonite), 탈크(talc), 다이아라이트(dialite), 카올린(kaolin), 및 칼슘 카보네이트(calcium carbonate)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 미생물 제제는 토양 또는 식물에 처리함으로써 식물의 생장을 촉진하고 진균의 생육을 억제하는 방법을 제공한다. 이때, 처리방법에는 일반적으로 행하고 있는 방법, 즉 살포(예를 들면 분무, 미스팅, 아토마이징, 분말 살포, 과립 살포, 수면시용, 상시용 등), 토양시용(예를 들면 혼입, 관주 등), 표면사용(예를 들면 도포, 도말법, 피복 등), 침지, 독이, 훈연 시용 등에 의해 행할 수 있으며, 그 사용량은 그 제형, 피해상황, 적용방법, 적용장소 등에 따라 적절히 결정할 수 있다.

상기 방법에 따라 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 경작지 면적(㎡) 당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 수로 포함될 수 있다. 또한, 상기 방법 중 살포에 의해 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 농도로 포함될 수 있으며, 침지에 의해 처리되는 미생물 제제에 함유된 미생물의 유효량은 ㎖당 1 내지 1×10¹⁰⁰의 미생물 농도로 포함될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실시예 1. 스트렙토마이세스 그리세우스 (Streptomyces griseus) KNU-05 균주의 분리 및 동정

1-1. 토양으로부터 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU -05 균주의 분리 및 동정

식물생장 촉진제로써 활용 가능한 미생물을 분리하기 위해 경북 상주시 소재에 품질이 좋다고 알려진 콩밭의 근권으로부터 토양 시료를 수집하였다. 상기 수집된 토양 시료로부터 미생물을 분리하기 위하여 상기 토양 시료 1g을 0.85% NaCl 용액 9mL에 넣어 충분히 교반 하고, 9mL의 새로운 0.85% NaCl 용액을 이용하여 단계별 희석을 실시하였다. 희석의 각 단계에서 100μL를 덜어 내어 PDK(potato dextrose peptone)에 도말하였다. 상기 배지에서 단일 콜로니로 자란 미생물들을 외형을 이용한 형태학적 분류방법을 이용하여 분리하였고, 분리된 미생물을 이용하여 식물생장 촉진제로써의 활성을 평가하여 최종 분리균주를 선정하였다. 최종 분리된 균주는 16S rRNA gene 영역을 증폭하여 염기서열을 분석하여 동정하였다.

1-2. 식물생장 촉진 호르몬 생성량 측정

옥신 생성을 확인하기 위해 상기 최종 분리균주를 3mg/mL의 L-Tryptophan이 포함된 5mL의 nutrient broth 배지에 접종한 다음 동일한 배양 조건에서 16시간 동안 배양하였다. 이 중 1mL을 회수하여 12,000rpm에서 5분간 원심분리 하고 상등액을 0.20μm membrane filter로 여과하여 배양 상등액을 준비하고, 상기 배양 상등액 500μL를 test tube에 옮기고 1mL의 salkowski regent와 혼합한 후 30분간 암조건에서 반응한 후 535nm에서 흡광도를 측정하였다. 옥신의 정량은 IAA 표준품 (Sigma Aldrich, Germany)을 이용하여 제조한 검량곡선에 대입하여 계산되었다. 대조군으로 식물생장호르몬을 생성하는 것으로 확인되었지만 동정되지 않은 균주 SF5, SE-CAS-1, SE-U-1, SE-LB-2, 및 No. 1 균주를 사용하였다.

그 결과, 도 1에서 확인할 수 있는 바와 같이, 최종 분리균주인 KNU-05 균주의 옥신 생성량이 대조군으로 사용된 다른 분리균주들의 옥신 생성량보다 월등히 높았다.

1-3. 질소 고정능력 측정

질소 고정능력 확인을 위해 상기 최종 분리균주를 영양한천배지에 획선도말 하고 동일한 배양조건에서 배양하여 단일 콜로니를 분리하였다. 상기 분리된 단일 콜로니를 질소원이 첨가되지 않은 nitrogen fixation agar (Sucrose 6 g, MgSO₄·7H₂O 0.2 g, Na₂HPO₄ 13.9 g, KH₂PO₄ 1.7 g, NaCl 2 g, FeCl₃·6H₂O 8 mg, Na₂MoO₄·2H₂O 3 mg, Thiamin 1 mg, Agar 15 g)에 멸균된 이쑤시개를 이용하여 획선도말을 실시하고 생육 여부를 기준으로 하여 질소 고정능을 확인하였다. 대조군으로는 질소 고정능이 없는 Lactobacillus sp. 를 사용하였다.

그 결과, 도 2에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군과 달리 최종 분리균주인 KNU-05 균주가 질소 영양원이 없는 nitrogen fixation agar 배지에서도 생육하였는바, 상기 KNU-05 균주에 대기 중의 질소를 질소원으로 사용하는 질소 고정능력이 있는 것으로 판단된다.

1-4. Siderophore 활성 측정

사이드로포어(Siderophore) 활성 확인을 위해 상기 최종 분리균주를 영양한천배지에 획선도말 하고 동일한 배양조건에서 배양하여 단일 콜로니를 얻었다. 상기 분리한 단일 콜로니를 CAS agar (PIPES 27.216 g, nutrient broth 8 g, Chromeazurol S 60.5 mg, Hexadecyltrimethyl ammounium bromide 72.9 mg, FeCl₃ 0.027 g, Agar 20 g)에 멸균된 이쑤시개를 이용하여 획선도말을 실시하였다. 사이드로포어는 Fe³ ⁺이온을 킬레이트화(chelating)하여 CAS agar에서 파란색을 없애므로, CAS agar에서 생육한 콜로니 주위에 투명환이 생긴다면 사이드로포어 활성이 있는 것을 의미한다. 대조군으로는 사이드로포어 활성이 없는 Lactobacillus sp.를 사용하였다.

그 결과, 도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 대조군과 달리 CAS agar에서 최종 분리균주인 KNU-05 균주의 콜로니를 중심으로 투명환이 형성되었는바, 상기 KNU-05 균주에 사이드로포어 활성이 있는 것으로 판단된다.

1-5. 항진균 활성 측정

항진균 활성은 다양한 식물에서 잎집무늬마름병과 뿌리썩음병을 유발하는 식물 병원성 진균인 Rhizoctonia solani 및 Pythium ultimum 과의 대치배양을 통해 확인하였다. 먼저 식물 병원성 진균 Rhizoctonia solani 와 Pythium ultimum 을 곰팡이 배양에 최적인 PDA agar 배지에서 5일간 충분히 배양하였다. 상기 최종 분리균주인 KNU-05 균주는 PDK (potato dextrose broth + 1% peptone) agar에서 배양한 단일 콜로니를 PDK broth에 접종한 다음 30℃에서 24시간 동안 배양한 후 원심분리를 실시하여 균체를 회수하고 0.85% NaCl 용액에 재 현탁하여 만든 최종 분리균주의 균체 현탁액을 실험에 사용하였다. 대치배양은 PDA 배지와 영양한천배지의 혼합배지인 PDNA 고체 배지에서 실시하였다. 상기 PDNA 고체 배지의 한 쪽에는 상기 식물 병원성 진균을 배양하고 다른 한쪽에는 분리균주의 액체 배양액을 부어 균주를 배양하였다. 항진균 활성의 확인은 최종 분리균주에 의한 식물 병원성 진균의 생육 저해 유무를 기준으로 판단하였다.

그 결과, 도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 최종 분리균주인 KNU-05 균주를 도말 한 쪽으로는 상기 두 병원성 진균이 생육하지 못하는바, 상기 KNU-05 균주에 식물 병원성 진균인 Rhizoctonia solani 및 Pythium ultimum 의 생육을 억제하는 활성이 있는 것으로 확인되었다.

실시예 2. 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주의 형태적 및 생화학적 특성

2-1. 형태적 특성 확인

본 발명에 따른 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주의 형태학적 특성을 확인하기 위하여 그람 염색법(gram staining)을 실시하였다. 영양한천배지에서 획선 도말법을 이용하여 상기 KNU-05 균주를 배양한 다음 단일 콜로니를 회수하고, 상기 회수된 단일 콜로니를 0.85% NaCl 용액에 현탁한 다음 slide glass에 올려 알코올 램프를 이용하여 열 고정을 실시하고, crystal violet 염색, iodine 염색, ethanol 탈색, safranin 염색 순으로 염색을 실시한 후, 마지막으로 증류수로 염색약을 씻어낸 다음 광학현미경으로 상기 KNU-05 균주의 형태적 외형을 확인하였다.

그 결과, 도 5에서 확인할 수 있는 바와 같이, 상기 KNU-05 균주의 경우 보라색으로 염색되었는바, 그람 양성균(gram positive)으로 확인되었다.

2-2. 당 대사 특성 확인

상기 KNU-05 균주의 당 대사능은 API 20 NE 키트(Bio Merioux사)를 이용하여 공급회사의 실험방법에 따라 실험하였으며, 30℃ 배양기에서 48시간 동안 배양한 후 비교하였다. API 20 NE 키트의 색깔 변화 및 균주 생육에 따른 혼탁도를 이용하여 결과를 작성하였고, 이의 결과를 표 1에 나타내었다.

하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 상기 KNU-05 균주는 D-만노오스, D-솔비톨, D-만니톨, D-글루코오스, D-슈크로오스를 에너지원으로 사용함을 확인하였다.

유효성분	결과	유효성분	결과
D-이노시톨	-	D-만니톨	+
D-멜리비오스	-	D-글루코오스	+
L-아라비노오스	-	D-멜리비오스	-
D-만노오스	+	D-슈크로오스	+
D-솔비톨	+	L-람노서스	-

실시예 3. 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU -05 균주의 16S rRNA gene 염기서열 및 그 계통 확인

식물생장 촉진, 인산 가용화, 항진균 활성이 우수한 균주의 동정을 위하여 회수한 균체로부터 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출한 후(Thompson, 1980), 분리한 유전체 DNA를 주형으로 사용하여 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction; PCR)에 의하여 16S rRNA gene을 증폭하였다. 이 때 사용한 다용도 프라이머(universal primer)는 27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')와 1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')이다(Lane 1991). 증폭한 PCR 산물은 PCR 정제 시스템(Solgent, Daejeon, Korea)을 이용하여 정제하였다. 정제한 PCR 산물의 전체 염기서열을 분석하기 위한 염기서열분석(sequencing)은 솔젠트(Solgent, Daejeon, Korea)에 의뢰하여 실시하였다.

상기 균주는 Streptomyces griseus subsp . griseus KCTC 9080^T의 16S rRNA gene과 99%의 상동성을 가지고, 양 균주간 1%의 상이성이 인정되어 Streptomyces griseus KNU-05로 명명하였다. 분석한 염기서열 결과는 NCBI의 BLASTN을 이용하여 비교하였으며, 그 결과는 도 6에 나타내었다. 또한, 상기 KNU-05 균주의 계통발생학적 모식도(phylogenetic tree)는 MEGA6 프로그램을 통해 인접결합방법(neighbor-joining methods)을 사용하여 분석하였고, 이의 결과를 도 7에 나타내었다.

전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가지는 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

한국생명공학연구원

KCTC13234BP

20170330

<110> Kyungpook National University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Novel Streptomyces griseus KNU-05 strain and uses thereof <130> MP17-085 <160> 1 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 1329 <212> DNA <213> Streptomyces griseus KNU-05 16S rRNA gene <400> 1 tagtggcgaa cgggtgagta acacgtgggc aatctgccct tcactctggg acaagccctg 60 gaaacggggt ctaataccgg ataacactcc tgcctgcatg ggcgggggtt gaaagctccg 120 gcggtgaagg atgagcccgc ggcctatcag cttgttggtg gggtaatggc ctaccaaggc 180 gacgacgggt agccggcctg agagggcgac cggccacact gggactgaga cacggcccag 240 actcctacgg gaggcagcag tggggaatat tgcacaatgg gcgaaagcct gatgcagcga 300 cgccgcgtga gggatgacgg ccttcgggtt gtaaacctct ttcagcaggg aagaagcgca 360 agtgacggta cctgcagaag aagcgccggc taactacgtg ccagcagccg cggtaatacg 420 tagggcgcaa gcgttgtccg ggaattattg ggcgtaaaga gctcgtaggc ggcttgtcac 480 gtcggatgtg aaagcccggg gcttaacccc gggtctgcat tcgatacggg ctagctagag 540 tgtggtaggg gagatcggaa ttcctggtgt agcggtgaaa tgcgcagata tcaggaggaa 600 caccggtggc gaaggcggat ctctgggcca ttactgacgc tgaggagcga aagcgtgggg 660 agcgaacagg attagatacc ctggtagtcc acgccgtaaa cgttgggaac taggtgttgg 720 cgacattcca cgtcgtcggt gccgcagcta acgcattaag ttccccgcct ggggagtacg 780 gccgcaaggc taaaactcaa aggaattgac gggggcccgc acaagcagcg gagcatgtgg 840 cttaattcga cgcaacgcga agaaccttac caaggcttga catataccgg aaacggccag 900 agatggtcgc ccccttgtgg tcggtataca ggtggtgcat ggctgtcgtc agctcgtgtc 960 gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt gttctgtgtt gccagcatgc 1020 ccttcggggt gatggggact cacaggagac tgccggggtc aactcggagg aaggtgggga 1080 cgacgtcaag tcatcatgcc ccttatgtct tgggctgcac acgtgctaca atggccggta 1140 caatgagctg cgatgccgtg aggcggagcg aatctcaaaa agccggtctc agttcggatt 1200 ggggtctgca actcgacccc atgaagtcgg agttgctagt aatcgcagat cagcattgct 1260 gcggtgaata cgttcccggg ccttgtacac accgcccgtc acgtcacgaa agtcggtaac 1320 acccgaagc 1329

Claims

식물생장 촉진 효과 및 항진균 효과를 갖는 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주(수탁번호 KCTC 13234BP)로서,
상기 균주는 서열번호 1의 16S rDNA 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는, 스트렙토마이세스 그리세우스 KNU-05 균주.
삭제
제 1 항에 있어서,
상기 식물생장 촉진은 옥신 생성능, 질소 고정능, 또는 사이드로포어 활성능에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는, 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주.
삭제
제 1 항의 스트렙토마이세스 그리세우스(Streptomyces griseus) KNU-05 균주, 상기 균주의 배양물, 상기 배양물의 농축물, 상기 배양물의 건조물, 및 이들의 조합으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 식물생장 촉진용 미생물 제제.
제 5 항의 미생물 제제를 포함하는, 식물생장 촉진용 미생물 비료.
제 5 항의 미생물 제제를 토양, 식물, 또는 식물의 종자에 처리하는 단계를 포함하는, 식물생장 촉진방법.