CN102728610A - 一株粘质沙雷氏菌强化蕈菌富集土壤重金属的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物修复技术领域中的一种抗性微生物强化蕈菌修复重金属污染土壤的技术，是在污染土壤上种植蕈菌，在其覆土后施用粘质沙雷氏菌强化蕈菌对土壤重金属的吸附速度和能力。采收成熟的重金属蕈菌，将其投入沼气池进行减量处理，减量后沼液采用化学沉淀析出重金属，沼液经检测后达标排放，重金属沉淀和沼渣采用可控制的集中填埋。本发明以蕈菌为生物富集器，充分利用蕈菌富集重金属离子能力强、生长周期短的特点，结合粘质沙雷氏菌所具有活化重金属的能力，以达到更高效的联合修复结果。重金属污染土样中种植蕈菌并联合喷洒粘质沙雷氏菌对土壤修复功效要大于单纯种植蕈菌修复效果，重金属去除率可达90%。

Description

一株粘质沙雷氏菌强化蕈菌富集土壤重金属的方法

技术领域

本发明属于环境微生物修复技术领域，具体涉及到利用重金属抗性微生物强化蕈菌富集土壤金属的方法。

背景技术

由于工业“三废”、机动车尾气的排放、污水的灌溉和农药、除草剂、化肥等的使用以及矿产的开发，重金属排放量与日俱增，严重污染了人类赖以生存的土壤、水体和空气。据统计，全球每年释放到各种环境中的重金属高达数百万吨，其中铅为34.6万吨，铜为14.7万吨，镉为3.9万吨，镍为34.6万吨，锌为27.6万吨，砷为12.5万吨，汞为1.2万吨^[1]。仅以我国土壤为例，全国受重金属污染的耕地面积约2500万公顷，每年被重金属污染的粮食高达1200万吨，直接经济损失超过100亿元^[2]。当然，重金属污染水体及土壤后，除了影响农作物的产量和品质外，还可能影响水陆生动植物生长，进而影响到生态系统。更加令人担忧的是，由于重金属不能被生物降解，在食物链的层层富集放大作用下，最终可能以较高浓度进入人体，对人体造成伤害。著名的日本富山县的“骨痛病”就是因为食用被含镉废水浇灌的土壤生产的“镉米”所致；

土壤重金属的修复方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。与物理化学方法相比，生物修复法具有成本低廉、来源广泛、不产生次级污染等优点，尤其适用于低浓度重金属的去除。根据其所利用的生物种类，生物修复可大体分为微生物修复、植物修复和动物修复三类。其中，微生物辅助植物修复以其特殊的优势引起了人们的研究兴趣。许多微生物通过产有机酸，生物表面活性剂等，提高土壤有效态重金属含量，进而促进植物富集土壤中相应重金属。但是，植物修复土壤重金属污染存在生长周期长，修复时间久，后处理困难，长期种植降低土壤肥力等植物共有缺点；

针对上述植物修复的不足，我们研究团队提出了利用重金属抗性微生物强化蕈菌富集土壤金属的方法。蕈菌是一种大型真菌，其具有重金属富集能力强，生长周期短，生物量大，易于后处理（沼气减量）等优点。再加上特异性重金属抗性微生物的辅助，使该方法应用于重金属污染土壤的治理具有更重要的现实意义和应用前景。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术未能有效地拔出土壤中重金属的不足，通过 “蕈菌-微生物”联合定向修复重金属污染土壤的方法，提高生物修复去除土壤重金属的效率，为重金属污染土壤的实地修复提供一种周期短、易于实施并充分利用土壤资源的“蕈菌-微生物”联合定向修复技术；

本发明的目的是通过下述技术方案来实现的；

本发明的一株粘质沙雷氏菌强化蕈菌富集土壤重金属的技术是在污染土壤上种植生物量大的蕈菌，在蕈菌覆土后喷洒适量的抗性微生物（可一次性喷洒完或者分批次喷洒定量的抗性微生物），再经过一段时间的生长，采集蕈菌的子实体，而后将采集的蕈菌投入沼气池进行沼气池厌氧微生物发酵减量处理，最终使蕈菌生物量的减量率达70-90%，从土壤中拔出的重金属全部浓缩于沼渣与沼液中，沼液采用化学沉淀或螯合沉淀（特指钝化螯合剂）析出重金属（减量后沼液中重金属离子得到浓缩，浓度提高，会大大降低化学沉淀剂的成本），沉淀后的沼液经检测达标后排放，重金属沉淀采用可控制的集中填埋。对于沼渣相对于减量前大大减少，可采用可控制的集中填埋（沼渣最大可焚烧制砖，因减量了80%，比直接焚烧修复植物环境友好得多）；

上述方案中所述蕈菌为双孢菇（Agaricus bisporus）、金福菇（Tricholoma Lobynsis）、鸡腿菇（Coprinus comatus）、长根菇（Oudemansiella radicata）等生物量大、人工栽培技术成熟的蕈菌；

上述方案中所述重金属为环境污染方面所指的重金属，主要指生物毒性显著的镉、铅、铬，还包括具有毒性的重金属锌、铜、钴、镍、锡等污染物；

上述方案中，采收的蕈菌投入沼气池进行沼气池厌氧微生物发酵减量化处理，最终使蕈菌生物量减量率达70-90%；

上述方案中，减量后富含重金属离子的蕈菌沼液经浓缩或不经浓缩后，再采用化学沉淀法或螯合沉淀（特指钝化螯合剂）方法将蕈菌沼液中的重金属离子去除；

上述方案中，化学沉淀法是指利用特定的化学试剂与重金属反应生成沉淀，然后得到重金属离子化合物沉淀；

上述方案中，螯合剂沉淀方法是指蕈菌沼液经酸化后，加钝化螯合剂进行螯合反应，再加沉淀剂或絮凝剂得到重金属离子化合物沉淀；

上述方案中，抗性微生物的施用是在蕈菌覆土后进行的，抗性微生物的施用浓度依照不同的土壤性质，蕈菌种类，重金属污染状况而有所不同；

本发明的发明人经过大量的实验研究，发现了要从土壤快速、彻底拔除重金属，可以结合蕈菌的生物修复和微生物的生物强化来实现。在蕈菌生长的过程中施用适量的具有较强活化土壤重金属功能的微生物，使得重金属离子从土壤颗粒上解离，形成易被蕈菌菌丝吸收的有效态，从而使蕈菌在生长过程中能快速、超量吸收积累土壤中的重金属。吸收重金属的蕈菌采收后经过沼气池的生物减量化处理，蕈菌生物量减量率达70-90%。形成的沼液和沼渣分别经过恰当的处理（如前所述），从而达到从环境中高效、快速、彻底拔除重金属；

本发明的微生物强化蕈菌修复重金属污染土壤的技术，以生物量大、生长周期短的蕈菌为主要生物富集器，充分利用蕈菌耐受重金属离子能力强、可以吸附多种重金属、生长周期短（3-5月）、田间栽培蕈菌技术成熟的特点，配合使用添加微生物的生物措施强化蕈菌吸收重金属的速度和能力，使其在较短的生命周期内吸附积累更多的重金属，从而更好更快地拔除土壤的重金属污染。

具体实施方式：

 实施例一

本例是在含镉（Cd）、铅（Pb）、铜(Cu)的污染土壤上种植双孢菇（Agaricus bisporus），同时联合抗性微生物（粘质沙雷氏菌）来强化原位富集土壤中镉（Cd）、铅（Pb）、铜(Cu)三种重金属离子；

修复工艺过程：双孢菇培养基料配制→基料发酵→双孢菇菌种制备→发酵基料在土壤中铺底→双孢菇菌种播种于污染土壤→双孢菇覆土→在双孢菇菌丝生长的土壤上施用抗性微生物（粘质沙雷氏菌）→双孢菇生长并富集重金属→出菇采收→双孢菇菌体投入沼气池进行厌氧沼气池减量化处理→形成富集了重金属的沼液和沼渣→沼液采用化学沉淀或螯合沉淀（特指钝化螯合剂）析出重金属→沉淀后的沼液经检测达标后可排放，重金属沉淀和沼液采用可控制的集中填埋；

1.    培养料配制、发酵与菌种制备

（1）    配方：（按100m²计算）

粪草培养料：干稻麦草2000kg，干牛（猪）粪700kg，尿素30kg，菜饼100kg，磷肥50kg，石膏25kg，石灰30kg；

无粪合成料：干稻麦草2500kg，尿素30kg，复合肥20kg，菜饼200kg，石膏75kg，石灰30-50kg；

（2）堆制发酵

堆制过程：培养料预湿→建堆→翻堆→后发酵

后发酵结束后，培养料有香味无氨味，有弹性，不粘手，含水量62%（用手紧捏有水渗出而不滴为宜）；

（3）菌种制备

     发酵后基料，装袋，灭菌，接入试管菌种，待菌袋长满白色菌丝；

2、播种及发酵管理

（1）播种：将培养料充分抖松抖匀后平铺于菇床上，料厚20-25cm，播种菌种量1500-1850ml/m²，先将2/3的菌种播于料面，用五个手指将菌种耙入1/3料层深，再把1/3菌种播在料面，拍平料面；

（2）发酵管理：播种后控温20-25℃，关闭门窗4天，第5天后开始适度通气，相对湿度70%左右，播后16-20天即可覆土；

3、原位覆土修复

将发好的菌，播散于重金属污染土壤中，覆土总厚度3-3.5cm，保持土壤含水量18-20%。并用石灰水调节pH至中性；

4、施用抗性微生物（粘质沙雷氏菌）

双孢菇覆土后，在土壤表层喷洒微生物菌剂；

5、后续处理

约2-3个月后，双孢菇成熟。按平均亩产鲜菇3500kg，采收双孢菇，将采收的菌体投入沼气池，进行沼气厌氧微生物减量化处理。减量后剩下的沼液和沼渣，总质量较减量前减少了70-90%；

沼液采用化学沉淀或螯合沉淀（特指钝化螯合剂）析出重金属，沉淀后的沼液经检测达标后可排放，重金属沉淀采用可控制的集中填埋；

剩余少量的沼渣则进行集中可控制的填埋，大大降低了对环境的危害；

本例中，在含Cd、Pb、Cu的污染土壤中生长的双孢菇，对其生物量和重金属含量进行测量发现，其生物量和重金属含量与对照组相比均有提高。其中生物量平均增加了40%，对Cd的平均富集量比对照提高了70%，对Pb的平均富集量比对照提高了40%，对Cu的平均富集量比对照提高了50%；

本例中，应根据双孢菇生长条件来安排季节和修复地点。适合我国中部、南部、东部大部分地区，一般在8月中旬开始堆料，9月上旬播种，9月底覆土，10月上中旬开始采收秋菇，第三年3-4月还可采收春菇，5月中旬收菇结束，秋春两季出菇期历时约100天。由于本实施例为自然条件，一年栽培一次；

实施例二

本例是在含镉（Cd）、锌（Zn）的污染土壤上种植金福菇（Tricholoma Lobynsis），并且联合抗性微生物（粘质沙雷氏菌）来强化富集污染土壤重金属Cd和Zn。按一般条件栽培，可达到亩产鲜菇3200kg；

本例金福菇栽培工艺：配制培养料（稻草生料）→浸草预堆→建堆发酵→装袋灭菌→接种养菌→脱袋覆土→施用抗性微生物（粘质沙雷氏菌）→25-30天后出菇，采收。金福菇属高温菇，一般选在3-5月份播种，5-10月份出菇；

本例中，后续处理同实施例一；

本例中，喷洒抗性微生物（粘质沙雷氏菌）后，金福菇的生物量平均增加了35%，其对Cd的平均富集量比对照提高了200%，对Zn的平均富集量比对照提高了150%；

实施例三

     本例是在含铅（Pb）镉（Cd）、铜（Cu）的污染土壤上种植鸡腿菇（Coprinus comatus），并且联合抗性微生物（粘质沙雷氏菌）来强化富集污染土壤重金属铅（Pb）、镉（Cd）和铜（Cu），种植2-3个月后，鸡腿菇成熟，按一般条件栽培，可达到亩产鲜菇8000kg。采收鸡腿菇，投入沼气池进行厌氧减量化发酵处理；

本例中，后续处理同实施例一；

本例中，鸡腿菇的生物量平均增加了31%，其对Pb的平均富集量比对照提高了38%，对Cd的平均富集量比对照提高了28%，对Cu的平均富集量比对照提高了47%；

实施例四

本例是在含镉（Cd）、铜（Cu）、汞（Hg）的污染土壤上种植长根菇（Oudemansiella radicata），同时联合抗性微生物（粘质沙雷氏菌）来强化富集污染土壤中的重金属镉（Cd）、铜（Cu）、汞（Hg），种植2-3个月后长根菇成熟，按一般条件栽培，亩产鲜菇2500kg。采收长根菇，投入沼气池进行厌氧微生物减量发酵处理；

本例长根菇栽培工艺：配制培养料（木腐质基质）→装袋、灭菌和接种→脱袋覆土→施用抗性微生物（粘质沙雷氏菌）→出菇，采收。长根菇属中高温型菌类，一般选择在6-9月播种，出菇；

本例中，后续处理同实施例一；

本例中，长根菇的生物量平均增加了32%，其对Cd的平均富集量比对照提高了50%，对Cu的平均富集量比对照提高了60%，对Hg的平均富集量比对照提高了50%。

Claims (5)

1.一株粘质沙雷氏菌强化蕈菌富集土壤重金属的方法，其特征在于：

（一）筛选特异性重金属抗性菌粘质沙雷氏菌

针对受损土壤的污染物为重金属，其抗性菌的筛选过程包括采样、驯化、平板分离与纯化；

（1）采样

取受重金属污染严重地区的土样，存放于4℃冰箱中；

（2）驯化

取10 g土样加入100 mL灭菌水中，于30 ℃、150 r/min摇床振荡培养；

1h后，分别取50 mL培养液分装到含有重金属的100 mL SLP培养基中，于30 ℃、150 r/min摇床振荡培养；

一周后，再分别取50 mL培养液分装到含重金属的100 mL SLP培养基中，再于30 ℃和150 r／min摇床振荡培养一周；

（3）平板分离与纯化

各取10μL驯化好的菌液加入含有190μL SLP培养基的离心管中，摇匀；

从中各取100μL分别涂布到含相同浓度重金属的SLP平板上，放入30 ℃恒温恒湿培养箱，培养2 d；观察微生物的生长情况，并从中挑取形态不同的菌落进行平板划线纯化，分离纯菌株；

在筛选的起始阶段培养基中添加的重金属较低，为50 mg/L，驯化阶段逐渐增加重金属浓度；在平板分离过程中，选取长势较快并且回试仍有较强重金属抗性的菌株；

以上其中：

SLP培养基：蔗糖 1%; (NH₄)₂SO₄ 0.1%; K₂HPO₄ 0.05%; MgSO₄ 0.05%; NaCl 0.01%; 酵母膏 0.05%; pH 7.2

（二）蕈菌—特异性重金属抗性菌联合修复污染土壤

在重金属污染土壤上栽种蕈菌，覆土后喷洒适量的抗性微生物菌剂，即可达到修复污染土壤。

2. 根据权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌强化蕈菌富集土壤重金属的方法，其特征在于所述重金属为环境污染方面所指的重金属，指生物毒性显著的镉、铅、铬、锌或铜。

3.根据权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌强化蕈菌富集土壤重金属的方法，其特征在于所述蕈菌为双孢菇（Agaricus bisporus）、金福菇（Tricholoma lobynsis）、鸡腿菇（Coprinus comatus）、长根菇（Oudemansiella radicata）等生物量大、人工栽培技术成熟的蕈菌。

4.根据权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌强化蕈菌富集土壤重金属的方法，其特征在于所述的蕈菌采收后，投入沼气池进行减量化处理，最终使蕈菌生物量减量率达70-90%，减量后得到沼液和沼渣。

5.根据权利要求1所述的一株粘质沙雷氏菌强化蕈菌富集土壤重金属的方法，其特征在于所述沼气减量后得到的沼液采用化学沉淀或螯合沉淀（特指钝化螯合剂）析出重金属，沉淀后的沼液经检测达标后排放，重金属沉淀和沼渣采用可控制的集中填埋。