CN104946554A - 一种粘质沙雷氏菌及其用途 - Google Patents

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Abstract

本申请涉及一种粘质沙雷氏菌，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.10711。菌株Sa从土壤中分离获得，通过观察菌株Sa的形态学特征，分析其生理生化特性以及同时结合16Sr DNA序列同源性分析鉴定该菌株Sa为粘质沙雷氏菌。本发明提供的粘质沙雷氏菌，对植物枯萎病有良好的防治效果；还能够在植物幼苗内定殖并对幼苗有显著的促生作用；此外，通过原子吸收仪测定培养基中Pb2+的浓度变化，可以得知该粘质沙雷氏菌可以吸附培养基中的Pb2+，吸附效果好。

Description

一种粘质沙雷氏菌及其用途
技术领域
本发明涉及微生物领域，更具体的涉及一种促生兼具生物修复土壤的粘质沙雷氏菌及其用途。
背景技术
植物根际促生菌(Plant Growth Promoting Rhizobacteria，PGPR)是指自由生活在土壤或附生于植物根系的一类可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。当病害发生时施用PGPR微生物可以干扰植物与病原的互作，形成有益于植物的新的平衡。
PGPR微生物防病促生机制是多种方式综合作用下的结果，包括PGPR微生物转化土壤中植物不能直接利用的养分、产生调节植物生长的植物激素、产生挥发性气体、产生抑制病原菌侵染的抑菌物质以及诱导植物产生抗病性等。目前许多PGPR菌株已被广泛应用并成功商业化。
另外，目前，在我国各地区的土壤中有不同程度的铅污染现象。土壤、水和肥料中重金属铅可被植物吸收，然后通过农产品进入人体，从而危害人体健康。
针对土壤重金属污染，植物-微生物修复技术由于效果显著、消耗小、无二次污染等优点受到广大科研工作者的青睐。研究表明，微生物，尤其是植物根际微生物与植物相互作用，可以有效地提高土壤修复效果。筛选可以富集重金属铅的微生物，在防治植物病害、促进植物生长的同时，为污染土壤的修复提供微生物资源。
发明内容
为了解决上述问题，本发明人进行了锐意研究，结果发现：从土壤中分离获得菌株Sa，通过观察菌株Sa的形态学特征，分析其生理生化特性以及同时结合16Sr DNA序列同源性分析鉴定该菌株Sa为粘质沙雷氏菌， 同时研究了菌株Sa在防病、促生、定殖及对Pb2+的吸附方面的作用，从而完成本发明。
本发明的目的在于提供一种促生兼具生物修复土壤的粘质沙雷氏菌，其中，该粘质沙雷氏菌在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.10711。
本发明所提供的从土壤中分离出来的菌株Sa经过形态学鉴定、生理生化特征分析以及16s rDNA序列同源性分析被鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，该菌株Sa已于2015年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC NO.10711。
本发明的另一目的在于提供一种植物枯萎病的防治剂，其中，包含保藏编号为CGMCC NO.10711的粘质沙雷氏菌。作为葫芦科植物的实例，具体可举出葫芦、瓢瓜、黄瓜、冬瓜，南瓜、丝瓜、西瓜以及甜瓜中的一种多种。
特别的，作为黄瓜，可举出品种为津绿11号的黄瓜。
本发明的又一目的在于提供一种植物生长促进剂，其中，包含保藏编号为CGMCC NO.10711的粘质沙雷氏菌。
作为葫芦科植物的实例，具体可举出葫芦、瓢瓜、黄瓜、冬瓜，南瓜、丝瓜、西瓜以及甜瓜一种或多种。
特别的，作为黄瓜，可举出品种为津绿11号的黄瓜。
本发明的在一目的在于提供一种土壤修复剂，其中，包含保藏编号为CGMCC NO.10711的粘质沙雷氏菌。
由本发明提供的粘质沙雷氏菌菌株Sa能够吸附重金属，特别的，粘质沙雷氏菌菌株Sa能够对土壤中的二价铅离子进行吸附、沉淀、氧化和还原，从而有效的降低土壤中铅的毒性。经本发明人研究发现，粘质沙雷氏菌菌株Sa能够加快植物对土壤中重金属污染物的富集作用，从而获得更好的效果。
本发明提供的一种保藏号为CGMCC NO.10711的粘质沙雷氏菌，对黄瓜枯萎病有良好的防治效果，防治效果可高达57.3％；还能够在黄瓜幼苗内定殖并对幼苗有显著的促生作用；此外，通过原子吸收仪测定培养基 中Pb2+的浓度变化，可以得知该粘质沙雷氏菌可以吸附培养基中的Pb2+，吸附效果好，吸附率可达47.63％。
保藏说明
菌种名称：粘质沙雷氏菌
拉丁名：(Serratia marcescens)
菌株编号：Sa
保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心
保藏机构简称：CGMCC
地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号
保藏日期：2015.4.10
保藏中心登记入册编号：CGMCC NO.10711。
附图说明
图1为实施1中通过MEG5.0软件构建获得的系统发育树。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明进行详细说明，本发明的特点和优点将随着这些说明而变得更为清楚、明确。
在下述实施例中：
黄瓜品种为“津绿11号”，由天津市绿丰园艺心技术开发有限公司提供；黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)，由天津农学院植物病理实验室提供；DNA分子标记(DNA Marker)以及PCR扩增试剂，由宝生物工程(大连)有限公司提供；细菌基因组DNA提取试剂盒，由北京索莱宝科技有限公司(Solarbio)提供；Bio-Tek胶回收试剂盒，由美国Omega生物技术有限公司提供；细菌通用引物，由上海生工生物工程有限公司提供；PCR仪，由美国Bio-Rad公司提供；电泳仪，由日本Mupid公司提供；凝胶成像系统，由英国UVItec公司提供；原子吸收分光光度计(AA-6300C)，由岛津(Shimadzu)公司提供；PD培养基：马铃薯200g/L，葡萄糖20g/L。
实施例一粘质沙雷氏菌菌株Sa的分离以及鉴定
1、粘质沙雷氏菌菌株Sa的分离
通过包括下述步骤的方法从天津市西青区黄瓜根际土壤中分离获得：
(1)取10g黄瓜根际土壤先加入到90mL无菌水中，然后接着加无菌水进行稀释，分别形成无菌水的稀释度为1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106的土壤稀释液，最后进行充分振荡；
(2)吸取步骤(1)中稀释度为1∶102、1∶103、1∶104、1∶105、1∶106的土壤稀释液各100μL相应的涂布于分别含有400、600、800、1000、1200、1400mg/l的硝酸铅的LB固体培养基中，然后置于28℃下培养1d；
(3)挑取经1d培养后长出的单菌落，然后在LB培养基平板上纯培养，获得菌株Sa。
2、粘质沙雷氏菌菌株Sa的形态学鉴定 
对上述步骤1中处于对数生长期的菌株Sa采用革兰氏染色法进行染色，然后通过光学显微镜观察粘质沙雷氏菌菌株Sa的形态学特征。
通过观察，菌株Sa的单菌落为圆形，菌落中央凸起，红色，不透明，湿润，边缘整齐。另外，菌株Sa的细胞呈短杆状，革兰氏染色阴性，无芽孢。
3、粘质沙雷氏菌菌株Sa的生理生化特征分析
参考《伯杰氏系统细菌学手册》(第九版)，同时参照《微生物学实验》(沈萍，范秀容，李广武.微生物学实验(第四版).北京：高等教育出版社，2007.)对菌株Sa的生理生化特性进行测定，结果如下表1所示。
表1
注：在上述表1中，“+”表示阳性，“-”表示阴性。
4、粘质沙雷氏菌菌株Sa的16s rDNA序列同源性分析
菌株Sa的PCR扩增：采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取步骤1中分离得到的菌株Sa的16s rDNA作为PCR扩增模板后，利用PCR仪并以细菌通用引物27F 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′，1527R5′-AGAAAGGAGGTGATCCAGCC-3′进行16s rDNA的扩增。
在上述扩增过程中，扩增体系为100μL：10×Buffer10μL，脱氧核糖 核苷三磷酸(dNTP)4μL，细菌通用引物(primer)27F 4μL，细菌通用引物(primer)1527R 4μL，TaqDNA聚合酶1μL，扩增模版DNA 1μL，加灭菌去离子水补至100μL；PCR扩增程序为：94℃预变性5min，然后94℃变性40s，50℃复性40s，72℃延伸45s循环35次，最后72℃充分延伸10min，4℃保存。
PCR扩增产物的纯化：取5μLPCR扩增产物在1％琼脂糖凝胶上进行电泳测试。
目的片段测序：在电泳仪上进行电泳测试后，用Bio-Tek胶回收试剂盒回收目的片段后由北京华大基因进行测序，将测定的序列提交至GenBank，获得序列号为：KM596774，再通过B1AST进行序列同源性检索分析。将测序结果与GenBank数据库中相关菌株的16S rDNA进行比较后，使用MEGA5.0软件来构建系统发育树，从而确定出菌株Sa的分类学地位。
根据图1所示的结果，发现菌株Sa与GenBank登录号为M59160和KF155286的粘质沙雷氏菌株(Serratia marcescens)同源性高达100％。
注：GenBank是美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)建立的DNA序列数据库，从公共资源中获取序列数据，
MEGA5.0为专用于构建系统发育树的软件，
BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)是一套在蛋白质数据库或DNA数据库中进行相似性比较的分析工具，
一般以同源性≥99％作为种水平的鉴定标准。
鉴于上述对菌株Sa的形态学鉴定、生理生化特征分析和16s rDNA序列同源性分析结果，将步骤1中分离得到的细菌Sa鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)。该粘质沙雷氏菌菌株Sa已于2015年4月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号)，保藏编号为CGMCC No.10711。
实施例二粘质沙雷氏菌菌株Sa的对黄瓜枯萎病的防治能力测定
1、黄瓜枯萎病菌孢子悬浮液制备：取在PDA培养基上采用常规培养方法培养的黄瓜枯萎病菌后接种于PD培养基中，在25℃、100r/min的条件下培养7d。然后，培养液过滤后置于离心机中4000r/min离心10min，倒去上清，加无菌水稀释，血球计数板测定孢子量，镜检，稀释至5.8×106CFU/ml；
2、菌株Sa发酵液制备：将在28℃的条件下，在LB固体培养基划线培养24h后的菌株Sa单菌落接种到5mL的LB液体培养基中，再在28℃和200r/min的条件下振荡培养12h，即为菌株Sa种子液，然后取100μL菌株Sa种子液接入100mL LB液体培养基中，在28℃和200r/min的条件下培养40h，获得菌株Sa发酵液，其中，菌株Sa发酵液菌株浓度为2.8×108CFU/ml；
3、黄瓜幼苗的培养：将黄瓜种子置于55℃温水中浸泡，搅拌至30℃后，取沉淀种子用5％NaClO浸泡4min，然后用无菌水冲洗5次，在28℃下保湿催芽，将萌芽的种子种植在育苗盘中育苗3周，选取长势一致的健康幼苗；
4、实验例：将步骤3中得到的黄瓜幼苗浸泡在菌株Sa发酵液中1h后，种植在混有黄瓜枯萎病菌孢子的土壤中，其中黄瓜枯萎病菌孢子悬浮液的添加量为使得黄瓜枯萎病菌孢子在土壤中的含量为5.8×104CFU/g，按照上述方法重复16盆，每盆3株；
5、对比例：将步骤3中得到的黄瓜幼苗直接种植在混有黄瓜枯萎病菌孢子的土壤中，其中，黄瓜枯萎病菌孢子悬浮液的添加量为使得黄瓜枯萎病菌孢子在土壤中的含量为5.8×104CFU/g，按照上述方法重复16盆，每盆3株；
6、观察实验例与对比例：持续观察实验例和对比例中黄瓜幼苗的生长情况以及枯萎病的发病情况，并在35d后调查每一盆黄瓜植株生长情况，同时按照下述计算公式以及病情分级标准定义计算实施例和对比例中黄瓜植株的发病率、死亡率、病情指数和防治效果，结果如下表2所示；
发病率＝叶片萎蔫株数/总株数×100％
死亡率＝全株枯死株数/总株数×100％
病情指数＝[∑(相应病情分级的株数×病情分级代表值)/(总株数×统 计中最高病情分级代表值)]×100％，
防治效果＝[(对比例病情指数-实验例病情指数)/对比例病情指数]×100％，
其中，病情分级标准为：0级，全株无病，1级，全株1/4以下叶片萎蔫，2级，全株1/4～1/2叶片萎蔫，3级，全株1/2以上叶片萎蔫，4级，全株枯死。
表2
由上述表2可以得知：菌株Sa可以通过竞争或分泌抗生物质来减轻病原真菌对植物的危害。通过实验例和对比例中的相关数据表明，被菌株Sa处理后的黄瓜幼苗有效地抑制了黄瓜枯萎病的发病情况，并且防治效果达到57.3％。
实施例三粘质沙雷氏菌菌株Sa对黄瓜幼苗的促生作用以及定殖能力的测定
实验例：将实施例二中培养得到的黄瓜幼苗的根浸泡在制备得到的菌株Sa发酵液(菌株Sa发酵液菌株浓度为2.8×108CFU/ml)中1h后，再种植到无菌土中，重复处理16盆，每盆3株；
对比例：将以直接栽种在无菌土中的黄瓜幼苗作为对比例，同样重复处理16盆，每盆3株。
在第35d时，取上述栽种的各盆中的黄瓜幼苗的根和茎各0.5g，分别均进行下述处理：用无菌水冲洗干净后，选用72％酒精浸泡30s，再用无菌水冲洗3次，用0.1％升汞浸泡1.5min，无菌水冲洗3次，剪碎后置于盛有1mL无菌水的无菌研钵中充分研磨，然后分别取100μL均匀涂布于LB固体培养基上，做3次平行试验，在28℃下培养24h。
在28℃下培养24h后，对实施例和对比例中的培养基上的红色菌落进 行计数，并进一步分别计算实施例和对比例中的每克黄瓜幼苗的根、茎中的红色菌落数以及株高、茎粗、叶面积、鲜重、茎部定殖量和根部定殖量，结果如下表3所示。
表3
注：鲜重表示黄瓜幼苗的根或茎采集下来后立刻测出的重量，
茎部定殖量的含义为在每克黄瓜幼苗的根或茎中所定殖的菌株Sa的含量，
根部定殖量的含义为在每克黄瓜幼苗的根或茎中所定殖的菌株Sa的含量，
在上述表3中，选用a和b不同的小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)。
由表3可以得知：粘质沙雷氏菌菌株Sa能够在黄瓜幼苗的根部和茎部内定殖，其中茎部定殖量较根部多，并高达7.20×103CFU/g。此外，被制备得到的菌株Sa发酵液沾根处理后的黄瓜幼苗在株高、叶面积和鲜重方面表现良好，说明菌株Sa可以促进黄瓜幼苗的生长。
实施例四菌株Sa对重金属铅的吸附效果的测定
1、铅标准溶液的配制：吸取100μg/ml的铅标准溶液0、100、200、300、400、500、600μl，分别置于10mi容量瓶中进行定容，相应的得到0、1、2、3、4、5、6μg/ml的铅标准溶液，然后进行铅标准曲线的绘制，结果如下表4所示。
表4
2、实验例：配制含有硝酸铅的LB液体培养基，其中，硝酸铅的浓度为200mg/l，将上述LB液体培养基每5ml分装入试管，在每一支试管中均接入5μl菌株Sa种子液，做3次平行实验，在30℃和200r/min摇床条件下培养40h后静置。
对比例：在含有硝酸铅的LB液体培养基中不接入菌株Sa种子液，在30℃和200r/min摇床条件下培养40h后静置，其中，硝酸铅的浓度为200mg/l。
3、样品的硝煮：将步骤2中静置后的样品在室温和10000r/min条件下离心10min后，分别取1ml上清液，将上清液、19ml去离子水和1ml浓硝酸加入到250ml锥形瓶中，然后在电炉上硝煮近干，放置稍凉后再加入5ml浓硝酸和2ml 70％的高氯酸，继续硝煮至近干，冷却后用0.2％的稀硝酸溶解，选用过滤膜定容到50ml容量瓶中。最后，利用原子吸收仪对选用硝煮处理后的各个样品中的Pb2+浓度进行检测，得到的Pb2+浓度值利用定容量回到原始测定浓度，并利用步骤1中得到的Pb2+标准曲线和下述公式计算处理后的各个样品中的Pb2+的吸附率，结果如表5所示：
P＝[C0(Pb2+)-C(Pb2+)]/C0(Pb2+)×100％
注：在上述公式中，P为吸附率，C0(Pb2+)为实验例或对比例中未培养前的LB液体培养基中的Pb2+的浓度(mg/L)，C(Pb2+)为经过硝煮 后的样品中的Pb2+的浓度(mg/L)。
表5
注：在上述表5中，选用a和b不同的小写字母表示处理间差异显著(P＜0.05)。
通过上述表5可以得知：加入菌株Sa后，培养基中Pb2+含量急剧下降，Sa吸附率可达47.63％，则说明菌株Sa对Pb2+的吸附效果好。
根据上述说明书的揭示，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本申请的权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.一种粘质沙雷氏菌，其特征在于，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的保藏编号为CGMCC NO.10711。
2.一种植物枯萎病的防治剂，其特征在于，包含保藏编号为CGMCCNO.10711的粘质沙雷氏菌。
3.根据权利要求2所述的植物枯萎病的防治剂，其特征在于，所述植物为葫芦科植物。
4.根据权利要求3所述的植物枯萎病的防治剂，其特征在于，所述植物选自葫芦、瓢瓜、黄瓜、冬瓜，南瓜、丝瓜、西瓜以及甜瓜中的一种或多种。
5.一种植物生长促进剂，其特征在于，包含保藏编号为CGMCCNO.10711的粘质沙雷氏菌。
6.根据权利要求5所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述植物为葫芦科植物。
7.根据权利要求6所述的植物生长促进剂，其特征在于，所述植物选自葫芦、瓢瓜、黄瓜、冬瓜，南瓜、丝瓜、西瓜以及甜瓜中的一种或多种。
8.一种土壤修复剂，其特征在于，包含保藏编号为CGMCC NO.10711的粘质沙雷氏菌。
9.根据权利要求8所述的土壤修复剂，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌吸附重金属。
10.根据权利要求9所述的土壤修复剂，其特征在于，所述重金属为铅。
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