一株粘质沙雷氏菌BSZ及应用
技术领域
本发明涉及生防的技术领域,具体涉及一株粘质沙雷氏菌BSZ及应用。
背景技术
玉米弯孢叶斑病又称黄斑病(Cuvrularialunata),是一种重要的世界性病害,在美洲欧洲亚洲及非洲的玉米产区都有发生,其病原菌属于有丝分裂孢子真菌弯孢霉属。近些年来,随着我国栽培制度改进作物品种更换气候条件的变化玉米弯孢叶斑病已成为继玉米大小斑病和黑穗病之后在我国发生的又一灾害性病害,该病害发展蔓延快,严重地块减产50%以上,甚至绝收,已在辽宁北京河北河南山东吉林和天津等地普遍发生并对玉米生产造成极为严重的影响。现已是我国玉米生产上新发生的一种危害性很大的病害。
生产上对于玉米弯孢叶斑病的防治主要以化学防治为主,化学防治可能导致玉米农药残留超标、玉米病菌抗药性加剧、环境污染和破坏生态环境等问题,而生物防治因具有环境友好、利于改善农业生态系统等特点而备受关注,是一种既经济又环保的病害防治方法。目前防治玉米弯孢叶斑病的生防菌主要有芽孢杆菌、假单胞菌等,还未见利用粘质沙雷氏菌防治玉米弯孢叶斑病的现有技术。
发明内容
本发明针对玉米弯孢叶斑病的防治问题,提供了一株粘质沙雷氏菌BSZ及应用。此菌株对玉米弯孢叶斑病有极强的抑制效果,而且具有安全环保,对农作物无害等特点。
本发明的技术方案为:
一株粘质沙雷氏菌BSZ,是一株内生细菌,在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏,其保藏编号是:CGMCC No.18934,保藏日期为2019年11月11日,地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所,邮编:100101,分类命名:粘质沙雷氏菌Serratia marcescens。
本发明的粘质沙雷氏菌BSZ在防治玉米弯孢叶斑病中的应用。
该粘质沙雷氏菌BSZ在防治玉米弯孢叶斑病中的应用,具体采用粘质沙雷氏菌BSZ制备得到的发酵液或菌剂。
所述的菌剂具体包括悬浮剂和种衣剂。
所述的粘质沙雷氏菌BSZ发酵液的制备方法,具体如下:
(1)取保藏的粘质沙雷氏菌BSZ划线于LB固体培养基上,28℃倒置活化培养1d,制得活化后的菌株;其中,LB固体培养基的组分,包括蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、琼脂10g,溶解并混匀,pH自然,加水定容至1000mL,121℃灭菌20min;
(2)取活化后的菌株接种于LB液体培养基中,在温度为28℃、转速为170rpm的条件下,摇床培养8h,制得种子液;其中,LB液体培养基的组分,包括蛋白胨5g、氯化钠5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖10g,溶解并混匀,pH自然,加水定容至1000mL,121℃灭菌20min,放冷至室温;
(3)取上述制得的种子液,接种量为5%(体积百分比),接种于LB液体培养基中,在温度为28℃、转速为200rpm的条件下,扩大培养2d,制得粘质沙雷氏菌BSZ发酵液。
具体的,粘质沙雷氏菌BSZ悬浮剂的制备方法如下:
将上述制得的粘质沙雷氏菌BSZ发酵液菌体浓度调至1×109CFU/mL,然后按照体积比1:250~1:230加入防紫外线的黄原胶,同时按照体积比1:200~1:180的比例加入润湿展布剂吐温-80,即制得BSZ悬浮剂。
具体的,粘质沙雷氏菌BSZ种衣剂的制备方法如下:玉米种子包衣选择颗粒饱满的玉米种子,用0.3%的NaClO溶液进行种子表面消毒35min,并用无菌水冲洗3~5次,风干;BSZ发酵液用无菌水调至1×108CFU/mL,按1:50~1:40(发酵液体积mL:种子质量g)的比例对玉米种子进行包衣处理,自然干燥后即为粘质沙雷氏菌BSZ种衣剂。包衣的玉米种子按照常规方式播种。
本发明的有益效果在于,
本发明的粘质沙雷氏菌BSZ从茶叶上分离所得,对环境友好,该生防菌株对玉米弯孢叶斑病具有极强的拮抗作用。针对玉米弯孢叶斑病的预防和防治分别研制了BSZ种衣剂和BSZ悬浮剂两种剂型。
本发明的BSZ种衣剂和BSZ悬浮剂均具有工艺简单,制作成本低廉,对玉米弯孢叶斑病防效高的优点,无污染无残留,安全性好,具有良好的市场应用前景。
所述的BSZ悬浮剂和BSZ种衣剂为微生物活菌制剂,田间防治效果突出。BSZ悬浮剂100倍对玉米弯孢叶斑病的田间防治效果为85.66%。BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的防效为83.31%。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案,下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,对于本领域普通技术人员而言,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1本发明的实施例3的对峙培养图。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明中的技术方案,下面将结合本发明实施例中的附图,对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
此菌株由福建铁观音叶片分离得到,经生理生化实验和16SrDNA序列比对鉴定为粘质沙雷氏菌(Serratiamarcescens)。
经过16SrDNA序列鉴定,本发明的粘质沙雷氏菌分类命名为Serratiamarcescens,细胞呈短杆状,革兰氏染色阴性,无芽孢。在LB固体培养基上单菌落为圆形,菌落中央凸起,不透明,湿润,边缘整齐,白色。该菌株的生理生化特性为:吲哚、MR、氧化酶、乳糖发酵产酸、硝酸盐还原和淀粉还原实验结果为阴性;酯酶试验、明胶液化、VP、过氧化氢和硫化氢、葡萄糖发酵产酸实验结果为阳性。
实施例2
粘质沙雷氏菌(内生细菌)BSZ的分离纯化
分别称取茶树新叶、老叶和叶斑病叶各1.0g;茶叶表面先用70%(体积分数)酒精清洗后,再用2%-3%(质量分数)次氯酸浸泡处理10-15min,再用无菌水漂洗3次;晾干后放入研钵,叶片加入5mL无菌水研磨成浆后静置15min,作为母液,然后稀释100倍;分别取1mL稀释液涂抹于牛肉膏蛋白胨固体培养基平板上,每处理3次重复;放入光照培养箱28℃培养24-36h,计算每个培养皿菌落数。对照取1mL无菌水冲洗液涂布平板,观察有无菌落产生,以验证该消毒方法是否能杀死供试材料表面微生物。计算每个培养皿菌落数,并根据菌落形态挑取单菌落,按常规方法反复纯化后获得茶树内生细菌BSZ(即获得本发明的应用菌株,冷藏保存。
实施例3
防治植物真菌病害的拮抗细菌的筛选:
玉米弯孢叶斑病病原菌用PDA培养基活化。粘质沙雷氏菌BSZ用LB活化。
将LB平板上活化好的粘质沙雷氏菌BSZ用无菌水稀释,将其制成浓度为1×108CFU/mL的BSZ菌悬液备用。配制PDA固体培养基待温度冷却至50℃以下,每100mLPDA中加入2mLBSZ菌悬液混匀,倒入直径8.5cm的培养皿内,每皿约20-25mL培养基即为对峙平板。
将活化好的病原菌用5mm打孔器打成菌饼,接种至上述对峙平板的中央位置,在28℃暗培养7天,测量菌株生长直径。以不加BSZ的纯PDA平板中央接入病原菌菌饼为对照,设三个实验重复。
实验结果表明,对峙培养7d后粘质沙雷氏菌BSZ对玉米弯孢叶斑病的抑制率为100%(图1),左图为处理,右图为对照。
PDA培养基:马铃薯200g,葡萄糖20g,琼脂10g,补足1L水。培养基在115℃下高压灭菌30min。
实施例4
BSZ发酵液的制备
(1)取保藏的粘质沙雷氏菌BSZ划线于LB固体培养基上,28℃倒置活化培养1d,制得活化后的菌株;其中,LB固体培养基的组分,包括蛋白胨10g、氯化钠10g、酵母提取物5g、琼脂10g,溶解并混匀,pH自然,加水定容至1000mL,121℃灭菌20min;
(2)取活化后的菌株接种于LB液体培养基中,在温度为28℃、转速为170rpm的条件下,摇床培养8h,制得种子液;其中,LB液体培养基的组分,包括蛋白胨5g、氯化钠5g、酵母提取物2.5g、葡萄糖10g,溶解并混匀,pH自然,加水定容至1000mL,121℃灭菌20min,放冷至室温;
(3)取上述制得的种子液,接种量为5%(体积百分比),接种于LB液体培养基中,在温度为28℃、转速为200rpm的条件下,扩大培养2d,制得粘质沙雷氏菌BSZ发酵液。
实施例5
粘质沙雷氏菌BSZ悬浮剂的制备:
将上述制得的粘质沙雷氏菌BSZ发酵液菌体浓度调至1×109CFU/mL,然后按照体积比1:250加入防紫外线的黄原胶(郑州隆鑫生物科技有限公司),同时按照体积比1:200的比例加入润湿展布剂吐温-80,即制得BSZ悬浮剂。
实施例6
BSZ悬浮剂对玉米弯孢叶斑病的温室盆栽实验
试验药剂和对照药剂:粘质沙雷氏菌BSZ悬浮剂由实施例5提供。对照化学药剂为75%百菌清可湿性粉剂,玉米品种:登海605。
本试验共设3个处理,每处理6次重复,粘质沙雷氏菌BSZ悬浮剂(1×109CFU/mL)100倍稀释液、75%百菌清500倍稀释液和清水对照。
玉米弯孢菌孢子悬浮液制备:将玉米弯孢菌(采集地为山东省泰安市马庄镇玉米田,玉米叶斑病的病原菌鉴定为新月弯孢菌(Curvularia lunata))菌丝悬浮液接种于灭菌的玉米粒上进行产孢培养,8d后用含有吐温-80(5‰)的无菌水冲洗玉米粒并经纱布过滤制得106个/mL的孢子悬浮液备用,也同样可施用下述实施例。
在花盆内(花盆直径30cm,高19cm)育苗,每盆3棵苗为1个处理,当玉米长至7叶期时,将各处理用喷雾器均匀喷洒于玉米苗叶面。接种玉米弯孢菌孢子悬浮液干燥后立即喷施BSZ悬浮剂和百菌清;接种孢子悬浮液24h后再次喷施BSZ悬浮剂和百菌清;每个处理随机区组排列。待清水对照充分发病后调查病级(7~10d),并计算病情指数和防效。玉米叶斑病病叶级别划分标准和防效计算方法参照《中华人民共和国国家标准》GB/T17980.107-2004。BSZ悬浮剂对玉米弯孢叶斑病的温室盆栽实验结果见表1。
表1 BSZ悬浮剂对玉米弯孢叶斑病的盆栽实验
从表1的温室盆栽试验结果可以看出,本发明提供的BSZ悬浮剂100倍施用后处理组的玉米弯孢叶斑病未发病,玉米防效为100.00%,略优于化学药剂百菌清97.66%的防效,生防菌BSZ悬浮剂具有良好的田间应用价值。
实施例7
BSZ悬浮剂对玉米弯孢叶斑病的田间小区实验(实验田位于山东省乐陵市铁营镇玉米田,玉米品种为郑单958)
试验药剂、对照药剂和清水对照同例6中的温室盆栽试验。田间每小区三行,3次重复,采用背负式手动喷雾器接病原菌和生防菌。处理方法同温室生测,接种玉米弯孢叶斑病病原菌后浇足水。待清水对照充分发病后调查病级,并计算病情指数和防治效果。
表2 BSZ悬浮剂对玉米弯孢叶斑病的田间实验
从表2中可以看出BSZ悬浮剂100倍对玉米弯孢叶斑病的田间防治效果为85.66%,而对照药剂75%百菌清500倍稀释液对玉米弯孢叶斑病的田间防治效果为80.33%,两者的田间防治效果相当。
实施例8
BSZ种衣剂的制备
玉米种子包衣处理选择颗粒饱满的玉米种子,用0.3%的NaClO溶液进行种子表面消毒35min,并用无菌水冲洗8次,风干。BSZ发酵液用无菌水调至1×108CFU/mL,按1:50(发酵液体积mL:种子质量g)的比例对玉米种子进行包衣处理,待干燥后备用。百菌清(500倍稀释液)种衣剂也按照1:50(农药体积mL:种子质量g)对玉米种子进行包衣处理。
实施例9
BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的温室盆栽实验
盆栽试验:分别将处理后的玉米种子播种于直径20cm,高19cm装有无菌土(V土:V沙=2:1)的花盆里。共3个处理,以空白培养基包衣为对照(CK),每个处理6盆,每盆播种3粒玉米种子。置于温室中16h光照,8h黑暗条件下生长。待玉米生长30d时,将玉米弯孢叶斑病孢子悬浮液均匀喷于玉米幼苗叶片的正反面,25℃黑暗条件下保湿培养24h,3-5d后调查其发病情况。BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的盆栽实验结果见下表3。
表3 BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的盆栽实验
从表3中可以看出本发明提供的BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的防效为83.31%,而百菌清种衣剂对玉米弯孢叶斑病的防效为76.56%,BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的防效比百菌清防效提高了8.82%,这是因为BSZ种衣剂是微生物活菌制剂,可以在植物表面存活并繁殖。
实施例10
BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的田间小区(实验田位于山东省乐陵市铁营镇玉米田,玉米品种为郑单958)
本试验共设3个处理3个重复,BSZ种衣剂、百菌清种衣剂和清水对照。采用常规播种方式。玉米叶斑病病叶级别划分标准和防效计算方法参照《中华人民共和国国家标准》GB/T17980.107-2004。病情指数和防效的计算公式同实施例6。
表4 BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的田间小区实验
通过生防菌处理种子诱导玉米抗全株病害是国内外生物防控研究的热点之一。BSZ种衣剂在田间对玉米弯孢叶斑病的防效为72.45%,对照药剂百菌清的防效为66.52%,如表4所示,BSZ种衣剂对玉米弯孢叶斑病的防效显著,BSZ种衣剂具有良好的田间应用价值。
本发明的BSZ种衣剂具有工艺简单,制作成本低廉,对玉米弯孢叶斑病的防效高的优点,具有良好的市场应用前景。
尽管通过参考附图并结合优选实施例的方式对本发明进行了详细描述,但本发明并不限于此。在不脱离本发明的精神和实质的前提下,本领域普通技术人员可以对本发明的实施例进行各种等效的修改或替换,而这些修改或替换都应在本发明的涵盖范围内/任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内,可轻易想到变化或替换,都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此,本发明的保护范围应所述以权利要求的保护范围为准。