CN101928685A - 白色链霉菌mc-15菌株及该菌株制备发酵液的方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种白色链霉菌MC-15菌株及其该菌株制备发酵液的方法和应用。白色链霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株，保藏号为CGMCC No.3652。将保存在高氏一号斜面培养基上的菌株转接在高氏一号培养基平板上进行活化培养后，再接种于50mL液体高氏一号培养基中进行种子液培养后，再接种于装有100mL液体高氏一号培养基的250mL三角瓶中进行扩大培养，再过滤除菌获得发酵液。该发酵液不仅表现出强烈的抑制马铃薯晚疫病菌菌丝生长的作用，且在促进马铃薯种薯萌发、幼苗生长、植株生长、抗晚疫病及增加产量方面，效果显著。
Description
技术领域
本发明涉及一种预防马铃薯晚疫病的白色链霉菌MC-15菌株及其该菌株制备的发酵液及应用，属于微生物发酵及植物病害生物防治领域，专用于植物病害的生长防治。
背景技术
马铃薯(Solanum tuberosum L.)是世界四大粮食作物之一，由马铃薯晚疫病菌引起的晚疫病是发展马铃薯产业最主要的制约因子之一。马铃薯晚疫病由马铃薯晚疫病菌引起，可发生于叶、叶柄、茎及块茎上，种子块茎感染病菌是导致大田马铃薯晚疫病发生最主要的因素甚至被认为是唯一的因素，因为落入田间的病残体、土壤中的病原菌存活时间最长为90天，均不能作为初侵染来源。该病菌有性生殖需要A1和A2两种交配型结合才能完成，通常只有A1交配型，缺少A2交配型，但马铃薯晚疫病菌A2交配型在各地的出现使有性生殖具备了条件，因而导致病菌新的变异不断出现，如致病型发生变化产生新的生理小种，造成马铃薯品种的抗性不断丧失，使得晚疫病的控制难度更大，迄今为止，对于马铃薯晚疫病仍以选育抗病品种为主、并结合化学药剂进行防治。
国内学者蒋继志等发现洋葱浸出液中的某些水溶性成分、大蒜和丁香等植物离体组织及其提取物，对马铃薯晚疫病菌静止孢萌发、附着孢形成也具有强烈的抑制作用。曹克强等也发现生物洁净剂和大蒜提取物对马铃薯晚疫病菌孢子萌发具有很好的抑制作用，且随着提取物浓度的增加，抑制率也相应增强，最高可达100％。张培花等发现不同溶剂所得到的紫茎泽兰提取物对马铃薯晚疫病菌菌丝生长也具有不同程度的抑制作用，其中石油醚提取物的抑制效果最好，将紫茎泽兰提取物与甲霜灵混配使用的抑制效果更好，其抑制率达95.43％。王树桐等报道知母的水提取物对马铃薯晚疫病菌菌丝生长、游动孢子释放和休止孢萌发表现出很强的抑制作用，还发现在马铃薯离体叶片上，知母提取物对晚疫病具有显著的防治效果，盆栽试验中知母提取物的保护效果达70％以上，持效期可达5天。以上均是从植物中获得抑菌物质，但植物生长受季节、地区等限制，不易迅速大量获得抑菌物质，且提取工艺复杂繁锁、成本高昂，没有得到推广应用。除利用植物及其提取物抑制马铃薯晚疫病菌外，不少学者探索利用微生物及其发酵产物控制马铃薯晚疫病菌。有报道表明拟青霉菌发酵浓缩物YFC对马铃薯晚疫病菌菌丝生长具有明显的抑制作用，2g/L的YFC对菌丝生长的相对抑制率达63.00％；盆栽实验YFC对马铃薯晚疫病的预防和治疗效果分别为83.35％和35.63％；还有人测定了8种真菌发酵液在5种不同浓度下对马铃薯晚疫病菌菌丝生长、游动孢子静止、静止胞萌发、附着胞形成和侵入丝形成等不同阶段的影响，发现立枯丝核菌发酵液的抑制作用最强，浓度为100％时， 对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制率达到90.4％，静止胞萌发率为2.4％，附着胞及侵入丝均未见形成；杨怀文等发现一株嗜线虫致病杆菌的代谢物可抑制马铃薯晚疫病菌菌丝体生长及孢子萌发。以上研究仅是抑菌或盆栽实验所得结果，还未见有实际田间应用的报道，且抑菌率较低。所以提供一种抑菌率更高，在田间应用效果最好，能得到切实推广应用的白色链霉菌就成为该技术领域急需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的就是解决现有技术中存在的上述问题，提供一种白色链霉菌MC-15菌株及其该菌株制备发酵液的方法和应用，由白色链霉菌MC-15菌株制备的发酵液可产生具有强烈抑制马铃薯晚疫病菌的作用及促进马铃薯生长和抗病的活性代谢产物，可用于提高马铃薯抗晚疫病能力和促进马铃薯的增产。
为完成上述目的，本发明的技术解决方案是：
一种白色链霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株，保藏号为CGMCC No.3652。
上述白色链霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株的获得方法如下：
(一)样品的采集
在河北省保定市满城县东马村番茄地中按常规方法采集土样，铲去表层土，用取样器取10-15cm深度处的土样50g装入无菌牛皮纸袋中，带回实验室阴干后采用土壤稀释法进行分离；
(二)样品的梯度稀释与特定功能菌株的分离筛选
(1)单一菌落式分离培养
称取阴干后的土样10g置于内装90mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于100rpm摇床上振荡30min后，静止10min得到土壤悬浮液，取其中0.5mL加入4.5mL无菌水中，再依次稀释成不同浓度的土壤稀释液10-2、10-3、10-4、10-5；用移液器分别吸取上述4种浓度的土壤稀释液100μL加到高氏一号培养基平板上，用无菌玻璃涂布器涂匀，在超净工作台上放置1h后，将培养皿倒置于28℃培养箱中培养7-10d，观察放线菌单菌落的生成；所述的高氏一号培养基的配方如下：按重量比计算：20的可溶性淀粉，1的硝酸钾，0.5的氯化钠，0.5的磷酸氢二钾，0.5的硫酸镁，0.01的硫酸铁，加水定容至1000mL，该培养基的pH为7.2-7.4；
(2)具有抑菌功能的单菌落的筛选
挑取上述初步确定的放线菌单菌落，用无菌水进行稀释得到稀释液，将稀释液在高氏一号培养基平板上划线培养，得到纯化的菌株；将纯化后的菌株接种到高氏一号斜面培养基上培养10-14d后，4℃保存备用；
以马铃薯晚疫病菌为靶标菌，利用常规的平板对峙培养法进行拮抗作用的初筛，初筛步骤是：将保存的马铃薯晚疫病菌菌株经黑麦培养基(RSA)20℃活化培养10d后， 取直径1cm的马铃薯晚疫病菌菌饼接于黑麦培养基平板中央，挑取经高氏一号培养基平板28℃活化培养5-7d的放线菌菌落接种于马铃薯晚疫病菌菌饼两侧，20℃对峙培养，观察测定马铃薯晚疫病菌菌落直径，以在马铃薯晚疫病菌另外两侧放置空白琼脂块的为对照，计算抑菌率，抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落半径×100；每个处理重复5次；马铃薯晚疫病菌菌落直径小，抑菌率高的表明接种的放线菌菌株抑菌效果好；
对经过初筛得到的有拮抗作用的放线菌菌株进行摇床发酵培养，发酵液经细菌过滤器除菌后得到无菌体发酵滤液；进一步以滤纸片法测试该无菌体发酵滤液对马铃薯晚疫病菌菌丝生长、孢子萌发的抑制作用和温室防病作用，最终筛选出了性状优良的抑菌单菌落菌株MC-15；
(三)具有抑菌功能的单菌落的纯化培养、菌种初步鉴定与保藏
(1)单菌落的纯化培养
将筛选出的单菌落菌株在高氏一号培养基上进行反复纯化培养3次以上，确保菌落形态一致，将纯化的单菌落菌株接种到高氏一号斜面培养基上培养10-14d后，4℃保存，并定期进行复壮培养和转化活性测定；
(2)对筛选出的纯化的菌株进行菌种鉴定
根据MC-15菌株的形态特征、培养特性、生理生化特性和16SrDNA基因序列等多项指标的分析结果，将分离到的功能放线菌菌株MC-15初步鉴定为白色链霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株。
本发明的白色链霉菌MC-15菌株已于2010年3月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.3652。
本发明的另一目的是提供一种由上述白色链霉菌MC-15菌株制备发酵液的方法。
本发明的上述目的是通过以下技术方案达到的：
一种由上述所述白色链霉菌MC-15菌株制备发酵液的方法，其步骤如下：
(1)菌株活化培养：将保存在高氏一号斜面培养基上的MC-15菌株转接在高氏一号培养基平板上，于28℃培养10-15d，得到活化培养好的MC-15菌株单菌落；
(2)种子液培养：挑取活化培养好的MC-15菌株单菌落，接种于50mL液体高氏一号培养基中，经28℃、150rpm培养3-6d，得种子液；
(3)扩大培养：取种子液1mL接种于装有100mL液体高氏一号培养基的250mL三角瓶中，经28℃、150rpm培养8-12d，得扩大培养后的培养液；
(4)过滤除菌获得发酵液：扩大培养后的培养液经在4℃、15000rpm下离心15min、用瓶顶过滤装置过滤除菌后获得发酵液，将发酵液冷冻干燥后得到发酵产物，备用，使用时，根据需要将发酵产物配成不同浓度的发酵液。
有益效果
本发明的白色链霉菌MC-15菌株通过发酵培养可以产生促进马铃薯生长、抵抗晚疫病并增加产量的活性代谢产物。MC-15菌株的抑菌作用最强，活体和发酵液的抑菌率分别为94.12％和92.22％。用MC-15拮抗菌株的发酵液浸泡或涂抹马铃薯种薯切片和离体叶片后，未发现拮抗菌发酵液对离体组织有不良影响，种薯可正常萌芽、幼芽可正常生长，且接种马铃薯晚疫病菌后的结果表明，发酵液处理后对马铃薯晚疫病菌所致病害的预防作用十分明显，相对保护率达到90％以上；在田间试验中，MC-15菌株发酵液处理种薯后，对种薯出苗、幼苗早期生长、植株抗晚疫病及产量均有不同程度的促进作用，与对照组相比，出苗早2-4天、株高平均高出3.1cm、分枝数多1.6个、叶片数多2.1个，平均增产30％左右。总之，该发酵液不仅表现出强烈的抑制马铃薯晚疫病菌菌丝生长的作用，且在促进马铃薯种薯萌发、幼苗生长、植株生长、抗晚疫病及增加产量方面，效果显著。
本发明放线菌MC-15菌株发酵液与实验中产生的其它放线菌菌株发酵液对马铃薯晚疫病菌的抑制作用比较显示，本发明对马铃薯晚疫病菌的抑制作用最强，见表1
表1：
附图说明
图1为MC-15菌株发酵液对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用的图片说明，左为被MC-15菌株发酵液处理，右为对照；
图2为MC-15菌株发酵液浸泡处理对马铃薯种薯幼芽生长的影响的图片说明，(黑暗保湿放置20d)，左为MC-15菌株发酵液处理，右为对照；
图3为MC-15菌株发酵液在马铃薯块茎切片上的防病效果的图片说明，1为对照I(未处理)，2为对照II(清水处理)，3为MC-15发酵液处理；
图4为MC-15菌株发酵液在马铃薯离体叶片上的防病效果的图片说明，A为对照(清水处理)，B为MC-15发酵液处理；
图5为MC-15菌株发酵液处理种薯后对出苗的影响的图片说明，左为对照，右为MC-15发酵液处理；
图6为MC-15发酵液处理对幼苗生长的影响的图片说明，左为对照；右为MC-15发酵液处理；
图7为MC-15发酵液处理对马铃薯植株抗晚疫病的影响的图片说明，A和B为对照(发病)；C为MC-15发酵液处理；
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步描述。
一、一种白色链霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株的获得方法如下：
(一)样品的采集
在河北省保定市满城县东马村番茄地中按常规方法采集土样，铲去表层土，用取样器取10-15cm深度处的土样50g装入无菌牛皮纸袋中，带回实验室阴干后采用土壤稀释法进行分离；
(二)样品的梯度稀释与特定功能菌株的分离筛选
(1)单一菌落式分离培养
称取阴干后的土样10g置于内装90mL无菌水和玻璃珠的三角瓶中，于100rpm摇床上振荡30min后，静止10min得到土壤悬浮液，取其中0.5mL加入4.5mL无菌水中，再依次稀释成不同浓度的土壤稀释液10-2、10-3、10-4、10-5；用移液器分别吸取上述4种浓度的土壤稀释液100μL加到高氏一号培养基平板上，用无菌玻璃涂布器涂匀，在超净工作台上放置1h后，将培养皿倒置于28℃培养箱中培养7-10d，观察放线菌单菌落的生成；所述的高氏一号培养基的配方如下：20g的可溶性淀粉，1g的硝酸钾，0.5g的氯化钠，0.5g的磷酸氢二钾，0.5g的硫酸镁，0.01g的硫酸铁，加水定容至1000mL，该培养基的pH为7.2-7.4；
(2)具有抑菌功能的单菌落的筛选
挑取上述初步确定的放线菌单菌落，用无菌水进行稀释得到稀释液，将稀释液在高氏一号培养基平板上划线培养，得到纯化的菌株；将纯化后的菌株接种到高氏一号斜面培养基上培养10-14d后，4℃保存备用；
以马铃薯晚疫病菌为靶标菌，利用常规的平板对峙培养法进行拮抗作用的初筛，初筛步骤是：将保存的马铃薯晚疫病菌菌株经黑麦培养基(RSA)20℃活化培养10d后，取直径1cm的马铃薯晚疫病菌菌饼接于黑麦培养基平板中央，挑取经高氏一号培养基平板28℃活化培养5-7d的放线菌菌落接种于马铃薯晚疫病菌菌饼两侧，20℃对峙培养，观察测定马铃薯晚疫病菌菌落直径，以在马铃薯晚疫病菌另外两侧放置空白琼脂块的为对 照，计算抑菌率，抑菌率(％)＝(对照菌落直径-处理菌落直径)/对照菌落半径×100；每个处理重复5次；马铃薯晚疫病菌菌落直径小，抑菌率高的表明接种的放线菌菌株抑菌效果好；
对经过初筛得到的有拮抗作用的放线菌菌株进行摇床发酵培养，发酵液经细菌过滤器除菌后得到无菌体发酵滤液；进一步以滤纸片法测试该无菌体发酵滤液对马铃薯晚疫病菌菌丝生长、孢子萌发的抑制作用和温室防病作用，最终筛选出了性状优良的抑菌单菌落菌株MC-15；
(三)具有抑菌功能的单菌落的纯化培养、菌种初步鉴定与保藏
(1)单菌落的纯化培养
将筛选出的单菌落菌株在高氏一号培养基上进行反复纯化培养3次以上，确保菌落形态一致，将纯化的单菌落菌株接种到高氏一号斜面培养基上培养10-14d后，4℃保存，并定期进行复壮培养和转化活性测定；
(2)对筛选出的纯化的菌株进行菌种鉴定
根据MC-15菌株的形态特征、培养特性、生理生化特性和16SrDNA基因序列等多项指标的分析结果，将分离到的功能放线菌菌株MC-15初步鉴定为白色链霉菌(Streptomyces albus)菌株。
本发明的白色链霉菌MC-15菌株已于2010年3月5日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.3652。
二、由上述所述白色链霉菌MC-15菌株制备发酵液的方法，其步骤如下：
(1)菌株活化培养：将保存在高氏一号斜面培养基上的MC-15菌株转接在高氏一号培养基平板上，于28℃培养15d，得到活化培养好的MC-15菌株单菌落；
(2)种子液培养：挑取活化培养好的MC-15菌株单菌落，接种于50mL液体高氏一号培养基中，经28℃、150rpm培养5d，得种子液；
(3)扩大培养：取种子液1mL接种于装有100mL液体高氏一号培养基的250mL三角瓶中，经28℃、150rpm培养10d，得扩大培养后的培养液；
(4)过滤除菌获得发酵液：扩大培养后的培养液经在4℃、15000rpm下离心15min、用瓶顶过滤装置过滤除菌后获得发酵液，将发酵液冷冻干燥后得到发酵产物，备用，使用时，根据需要将发酵产物配成不同浓度的发酵液。
三、白色链霉菌MC-15菌株制备的发酵液的应用实例
实施例1：白色链霉菌MC-15菌株制备的发酵液在平板对峙培养中的抑菌作用。
采用滤纸片法测定MC-15菌株与其供试菌株发酵液的抑菌活性，将在黑麦培养基上活化培养5d的马铃薯晚疫病菌菌饼(φ＝10mm)置于黑麦培养基平板(φ＝90mm)中央，在菌饼上下或左右对称两侧各相距25mm处放置1张无菌滤纸片，取经上述方法获得的MC-15菌株和其它菌株的发酵液原液20μL滴加于无菌滤纸片上，以滴加无菌水为对照。 20℃下暗培养，每24h观察记录菌落直径，直到对照菌落长满整个平板，每种发酵液重复5个平板，实验重复3次。结果表明，在所有供试菌株中，MC-15菌株的发酵液对马铃薯晚疫病菌菌丝生长的抑制作用最强，抑菌率可达到91.22％。如图1所示。
实施例2：MC-15菌株发酵液最适抑菌浓度的确定。
将MC-15菌株的发酵液经冷冻干燥后，用无菌水配制成10mg/mL、8mg/mL、6mg/mL、4mg/mL、2mg/mL等不同梯度的溶液，以无菌水为对照进行抑菌试验，方法同实施例1对发酵液的抑菌活性的测定，每种浓度的发酵液重复5个平板，实验重复3次。结果表明以4-6mg/mL浓度的发酵液最为合适，如表2所示。
表2 MC-15菌株最适抑菌浓度的确定
| 发酵液浓度(mg/mL) | 10 | 8 | 6 | 4 | 2 |
| 抑菌率(％) | 79.45a | 85.22a | 91.56a | 90.14a | 56.23b |
表中不同字母表示彼此之间达到显著性差异(p＝0.05)
实施例3：MC-15菌株发酵液对马铃薯种薯切片的影响。
将健康完整的马铃薯种薯清水洗净，在1％的NaClO中浸泡5-10min，无菌水冲洗3-5遍，以无菌滤纸吸去表面水分，用灭菌刀将马铃薯种薯分别切成2cm×1cm×1cm的薄片和适于田间播种用的切块(以每个切块有两个健康完整的芽眼为标准)，取上述制备好的2mg/mL、4mg/mL、6mg/mL、8mg/mL和10mg/mL浓度的MC-15菌株发酵液100μL均匀涂抹于马铃薯薄片上，用10mg/mL浓度的MC-15菌株发酵液浸泡处理种薯切块不同时间，以同体积无菌水涂抹切片和浸泡切块为对照，置于20℃保湿暗培养，逐日观察块茎切片和切块的变化。结果显示，经不同浓度的MC-15菌株发酵液处理和10mg/mL浓度的MC-15菌株发酵液处理不同时间后，马铃薯块茎切片和切块均无明显变色、腐烂或其它病变的迹象，均与无菌水处理的对照一致，表明MC-15菌株的发酵液对马铃薯块茎切片均无明显不良影响，可以用于处理马铃薯块茎切片和种薯切块。
实施例4：MC-15菌株发酵液对马铃薯种薯萌芽及幼芽生长的影响。
健康完整的马铃薯种薯在1％的NaClO中浸泡5-10min，无菌水冲洗3-5遍，以无菌滤纸吸去表面水分，用灭菌刀将其切成适于田间播种用的切块，浸泡于上述制备好的浓度为4mg/mL的MC-15菌株发酵液中30min，以切块完全淹没为准，以淹没于同体积的无菌水中为对照。一部分切块置于20℃保湿暗培养，逐日观察切块萌芽及形成幼苗的环节，待出芽之后给予光照(每日光照16h以上)；另一部分切块种植于室内自然土中，观察切块出苗及苗期生长。
结果显示，带有芽眼的马铃薯种薯切块经浓度为4mg/mL的MC-15菌株发酵液浸泡30min、20℃黑暗保湿放置20d后，切块的发芽时间普遍比未经发酵液处理的对照切块要早1-2d，嫩芽的长势也比对照要好。表明MC-15菌株发酵液对于马铃薯种薯萌芽不但没有不良影响，且有一定的促进作用，适合于进行浸种处理；进一步将在室内条件下已经 萌芽的种薯用MC-15菌株发酵液浸泡处理后，幼芽的长势也明显优于对照，如图2所示。
实施例5：MC-15菌株发酵液在马铃薯离体组织上的防病作用。
马铃薯种薯切片的预处理与上述实施例3相同，在经过预处理的切片上的防病试验以3种处理方式进行：1)预先将浓度为4mg/mL的100μL MC-15菌株发酵液均匀涂抹于种薯切片上，以涂抹同体积无菌水为对照，2d后接种活化培养的直径为0.7cm的马铃薯晚疫病菌菌饼，置于20℃保湿暗培养，逐日观察并记录种薯切片上病菌菌体的生长变化；2)先在种薯切片表面接种活化培养的直径为0.7cm的马铃薯晚疫病菌菌饼，20℃保湿暗培养2d后在种薯切片表面的马铃薯晚疫病菌菌饼四周滴加浓度为4mg/mL的100μLMC-15菌株发酵液，以滴加相同体积无菌水为对照，逐日观察并记录菌饼中种薯切片上病菌菌体的生长变化；3)在种薯切片表面接种马铃薯晚疫病菌菌饼后，随即滴加浓度为4mg/mL的100μL MC-15菌株发酵液，以滴加同体积无菌水为对照，20℃保湿暗培养，逐日观察并记录种薯切片表面病菌菌体生长以及种薯切片自身的变化情况，统计病情指数。
病情指数＝[∑(病级数×该病级的种薯切片数)/(调查总数×最高病级数)]×100
马铃薯离体叶片的预处理方法与实施例3相同，其防病作用的测定也与上述马铃薯种薯切片的方法相同，区别仅仅在于处理后的马铃薯种薯切片暗培养即可，离体叶片则需要光照培养(每日光照时间16h)。
结果显示，在预处理过的马铃薯块茎切片和离体叶片上先滴加MC-15发酵液，2d后接入马铃薯晚疫病菌菌饼，8d后所得保护效果最好，对照组中种薯切片上病菌菌丝生长旺盛，菌饼周围的种薯切片组织变为褐色，叶片则大面积变成褐色(褐色面积超过90％)、并开始腐烂，而经MC-15菌株发酵液处理的种薯切片上菌丝较少，切片组织几乎不变色，叶片也只是轻微变黄但没有腐烂现象。经MC-15菌株发酵液处理的种薯切片和离体叶片上的病情指数均在10％以下，而对照的病情指数均在83％以上，相对保护率达到72％以上。相比之下，先接种马铃薯晚疫病菌后滴加MC-15菌株发酵液、或同时接种马铃薯晚疫病菌和滴加MC-15菌株发酵液虽然也均有一定的治疗作用，但效果均不及预防作用。如图3、图4和表3所示。
表3 不同菌株发酵液处理后对病害的预防效果*
* 表中括号里的数据为相对保护率(％)。
实施例6：MC-15菌株发酵液对马铃薯种薯出苗、生长、抗病及产量的影响
健康完整的马铃薯种薯在1％的NaClO中浸泡5-10min，无菌水冲洗3-5遍，以无菌滤纸吸去表面水分，用灭菌刀将其切成适于田间播种用的切块(以每个切块有两个健康完整的芽眼为标准)，切块完全浸泡于上述制备好的浓度为4mg/mL的MC-15菌株发酵液中30min，以淹没于同体积的无菌水中为对照。切块种植于张家口及承德不同地区的实验地中，观察出苗、苗期生长、人工接种马铃薯晚疫病菌后植株对马铃薯晚疫病菌的抗性及最终产量等性状。
对出苗的影响：经过MC-15菌株发酵液处理的种薯，播种后出苗时间与未经处理的对照以及经清水处理的对照相比，要早2-4d，但在出苗率方面无显著差异，如图5、表4和表5所示。
表4 MC-15菌株发酵液处理种薯对马铃薯田间出苗的影响(2008年度)*
*对照I为未处理，对照II为清水处理，表中数据为播种后30d的调查结果，出苗时间以出苗率达到90％为标准。A-张家口坝上涸源县平顶堡镇河东村；B-张家口市宣化区河子西乡肖家房村；C-承德市围场县银窝沟乡石匣村三组。
表5 MC-15菌株发酵液处理种薯对马铃薯田间出苗的影响(2009年度)*
*同表4。
对幼苗生长的影响：经MC-15菌株发酵液处理的种薯，出苗后45d后的生长势调查表明，在株高、分枝数和叶片数等方面均明显优于对照。发酵液处理后的平均株高为25.2-27.4cm，分枝数为7.1-8.5，叶片数为9.8-11.3，而对照平均株高为17.5-21.5cm，分枝数为5.3-7.6，叶片数为8.4-9.8。如图6、表6和表7所示。
表6 MC-15菌株发酵液处理种薯对幼苗生长的影响(2008年度)*
*播种后45d的调查结果。其余同表4。
表7 MC-15菌株发酵液处理种薯对幼苗生长的影响(2009年度)*
*同表6。
对马铃薯植株抗病的影响：用MC-15菌株发酵液处理种薯后，田间马铃薯植株对人工接种马铃薯晚疫病菌表现出较强的抗性，对照组的病情指数均在76以上，而发酵液处理后的病情指数则均在28以下，平均保护率达到66-80％。如图7、表8和表9所示。
表8 MC-15菌株发酵液处理种薯对马铃薯植株田间抗晚疫病的影响(2008年度)*
*播种后第52d，人工接种马铃薯晚疫病菌孢子囊悬浮液于植株自下而上第4张叶片，每种处理共接种30个植株，接种后及时灌水以保持田间湿度，接种后第5-7d调查病情指数，表中数据为30个植株的平均值。其余同表4。
表9 MC-15菌株发酵液处理种薯对马铃薯植株田间抗晚疫病的影响(2009年度)*
*同表8。
对经济产量的影响：采用MC-15菌株发酵液处理种薯后，对马铃薯经济产量有明显的增加作用，对照组的平均单株重为607g-738g，而发酵液处理的平均单株重为968g-1123g，平均增产率为29％-44％。(表10和表11)。
表10 MC-15菌株发酵液处理种薯对马铃薯经济产量的影响(2008年度)*
*生长后至自然成熟收获产量，表中数据为单株重。其余同表4。
表11 MC-15菌株发酵液处理种薯对马铃薯经济产量的影响(2009年度)*
*同表10。
Claims (3)
1.一种白色链霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株，保藏号为CGMCC No.3652。
2.一种由权利要求1所述的白色链霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株制备发酵液的方法，其步骤如下：
(1)菌株活化培养：将保存在高氏一号斜面培养基上的MC-15菌株转接在高氏一号培养基平板上，于28℃培养10-15d，得到活化培养好的MC-15菌株单菌落；
(2)种子液培养：挑取活化培养好的MC-15菌株单菌落，接种于50mL液体高氏一号培养基中，经28℃、150rpm培养3-6d，得种子液；
(3)扩大培养：取种子液1mL接种于装有100mL液体高氏一号培养基的250mL三角瓶中，经28℃、150rpm培养8-12d，得扩大培养后的培养液；
(4)过滤除菌获得发酵液：扩大培养后的培养液经在4℃、15000rpm下离心15min、用瓶顶过滤装置过滤除菌后获得发酵液，将发酵液冷冻干燥后得到发酵产物，备用，使用时，根据需要将发酵产物配成不同浓度的发酵液。
3.权利要求1所述的白色链霉菌(Streptomyces albus)MC-15菌株制备的发酵液在抑制马铃薯晚疫病中的应用。
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