CN102174448A - 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用 - Google Patents
一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN102174448A CN102174448A CN201110049986.8A CN201110049986A CN102174448A CN 102174448 A CN102174448 A CN 102174448A CN 201110049986 A CN201110049986 A CN 201110049986A CN 102174448 A CN102174448 A CN 102174448A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- poly
- polylysine
- dab
- glucose
- fermentation
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 title claims abstract description 36
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 title claims abstract description 36
- 241000972623 Streptomyces albulus Species 0.000 title abstract description 6
- BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 2,2-diaminobutanoic acid Chemical compound CCC(N)(N)C(O)=O BLCJBICVQSYOIF-UHFFFAOYSA-N 0.000 title abstract 4
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 claims abstract description 36
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 claims abstract description 36
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 14
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims abstract description 14
- 238000004321 preservation Methods 0.000 claims abstract description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 42
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 38
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 35
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 21
- 241000187759 Streptomyces albus Species 0.000 claims description 19
- 229940041514 candida albicans extract Drugs 0.000 claims description 16
- 239000012138 yeast extract Substances 0.000 claims description 16
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 11
- QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N nitrogen group Chemical group [N] QJGQUHMNIGDVPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 11
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 claims description 9
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 claims description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 claims description 8
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 claims description 8
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 6
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 claims description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 claims description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 claims description 4
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 claims description 4
- SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N alpha-D-xylose Chemical compound O[C@@H]1CO[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O SRBFZHDQGSBBOR-LECHCGJUSA-N 0.000 claims description 4
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 claims description 4
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 claims description 4
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 claims description 4
- 229960003487 xylose Drugs 0.000 claims description 4
- 229930091371 Fructose Natural products 0.000 claims description 3
- RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N Fructose Chemical compound OC[C@H]1O[C@](O)(CO)[C@@H](O)[C@@H]1O RFSUNEUAIZKAJO-ARQDHWQXSA-N 0.000 claims description 3
- 239000005715 Fructose Substances 0.000 claims description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M Potassium chloride Chemical compound [Cl-].[K+] WCUXLLCKKVVCTQ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 240000008042 Zea mays Species 0.000 claims description 3
- 235000005824 Zea mays ssp. parviglumis Nutrition 0.000 claims description 3
- 235000002017 Zea mays subsp mays Nutrition 0.000 claims description 3
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 claims description 3
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 claims description 3
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 claims description 3
- 150000001868 cobalt Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000005822 corn Nutrition 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M dihydrogenphosphate Chemical compound OP(O)([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 150000003016 phosphoric acids Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000001103 potassium chloride Substances 0.000 claims description 3
- 235000011164 potassium chloride Nutrition 0.000 claims description 3
- 159000000000 sodium salts Chemical class 0.000 claims description 3
- 235000012343 cottonseed oil Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 2
- 235000012054 meals Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 abstract description 11
- 241000640974 Streptomyces albulus PD-1 Species 0.000 abstract description 10
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 abstract 1
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract 1
- 238000000605 extraction Methods 0.000 abstract 1
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 abstract 1
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 abstract 1
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract 1
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 24
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 8
- 238000011218 seed culture Methods 0.000 description 7
- 239000006052 feed supplement Substances 0.000 description 6
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 6
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 5
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 5
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000000034 method Methods 0.000 description 5
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000006227 byproduct Substances 0.000 description 4
- 108020004465 16S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 235000011114 ammonium hydroxide Nutrition 0.000 description 3
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 3
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 3
- 241000204057 Kitasatospora Species 0.000 description 2
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 2
- 229930195722 L-methionine Natural products 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 2
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 2
- 229920001519 homopolymer Polymers 0.000 description 2
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 2
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 2
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 2
- 238000009423 ventilation Methods 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000186361 Actinobacteria <class> Species 0.000 description 1
- 102000012286 Chitinases Human genes 0.000 description 1
- 108010022172 Chitinases Proteins 0.000 description 1
- 229920000742 Cotton Polymers 0.000 description 1
- 239000001828 Gelatine Substances 0.000 description 1
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 1
- 125000001176 L-lysyl group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C(N([H])[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 102000013275 Somatomedins Human genes 0.000 description 1
- 229920002472 Starch Polymers 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000000843 anti-fungal effect Effects 0.000 description 1
- 230000000845 anti-microbial effect Effects 0.000 description 1
- 229940121375 antifungal agent Drugs 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 238000012262 fermentative production Methods 0.000 description 1
- 239000005452 food preservative Substances 0.000 description 1
- 235000019249 food preservative Nutrition 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 1
- 238000011031 large-scale manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 1
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 1
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 1
- 239000006916 nutrient agar Substances 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 235000016709 nutrition Nutrition 0.000 description 1
- 230000035479 physiological effects, processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 230000029219 regulation of pH Effects 0.000 description 1
- 235000015598 salt intake Nutrition 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012882 sequential analysis Methods 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 239000008107 starch Substances 0.000 description 1
- 235000019698 starch Nutrition 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 241001446247 uncultured actinomycete Species 0.000 description 1
- 229920001351 ε-poly-L-lysine Polymers 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明公开一种小白链霉菌，其分类命名为小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的编号是CCTCC NO：M2011043，保藏日期是：2011年2月21日。本发明还公开了上述小白链霉菌在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用。采用该菌株作为发酵菌株，经一级、二级种子扩大培养，发酵生产，提取后聚赖氨酸产量达30g/L以上，聚二氨基丁酸产量达12g/L以上。该菌株能利用多种碳源和氮源，培养条件粗放，操作方便简单，聚赖氨酸和聚二氨基丁酸产量高，生产成本低。
Description
技术领域
本发明属于发酵工程技术领域，涉及一种高产聚赖氨酸和聚二氨基丁酸的微生物菌株小白链霉菌及其应用。
背景技术
聚赖氨酸(ε-Poly-L-lysine，ε-PL)是L-赖氨酸的同型聚合物，它由α-羧基与ε-氨基形成肽键连接而成，一般ε-PL由20-40个L-赖氨酸残基所构成。ε-PL是一种抗菌谱广(包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌、酵母菌、霉菌均具有良好的抑制作用)、生物安全性高(ε-PL可降解为人体必须氨基酸L-赖氨酸)、热稳定性强(120℃加热20min仍保持抗菌活性)、pH适用范围宽的新型营养型食品防腐剂。ε-PL生产过程中生产效率低、产物浓度低、产物分离难等问题，困扰着ε-PL的工业化生产。目前ε-PL的研究主要处于实验室研究而阶段，仅有日本Chisso公司实现了ε-PL的规模化生产，国内南京轩凯生物科技有限公司、浙江银象生物工程有限公司和郑州拜纳佛生物工程般份有限公司仅有少量生产。
聚赖氨酸 聚二氨基丁酸
ε-PL的生产菌株一般为放线菌，主要包括小白链霉菌(Streptomyces albulus)和北里孢菌(Kitasatospora)。放线菌发酵过程中，常伴有副产物的生成而这些副产物通常也是新的有活力的物质。发明人经过大量的研究，在筛选新的具有更高产聚赖氨酸能力的生产菌株的同时，对能产生副产物的菌株进行研究。研究发现一株菌株在分泌聚赖氨酸的同时也大量产生另外一种大分子物质。通过一系列的分离纯化得到此物质的高纯固体，经过表征此物质被鉴定为二氨基丁酸的均聚物——聚二氨基丁酸。
聚二氨基丁酸由L-二氨基丁酸的γ-氨基和α-羧基聚合而成的均聚物。目前研究结果显示，聚二氨基丁酸在热稳定性、水溶性等方面具有与聚赖氨酸类似的性质，值得注意的是，聚二氨基丁酸具有极强的酵母抑制能力，并具有一定的抑制G+菌、G-菌与霉菌活力，是一种潜在的优良生物防腐剂，目前国内还没有有关二氨基丁酸生产的报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一株小白链霉菌，其能够同时高产聚赖氨酸和聚二氨基丁酸。
本发明还要解决的技术问题是提供上述小白链霉菌在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用。
为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
本发明人实验室选育的微生物菌株小白链霉菌(Streptomyces albulus PD-1)，目前该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(简称CCTCC)，地址：武汉武汉大学，邮编：430072，登记入册的编号是CCTCC NO：M2011043，保藏日期是：2011年2月21日。以此菌作为生产菌株。
CCTCC NO：M2011043菌株具有下述性质：
1、菌落形态学特征：
在营养琼脂上，菌丝生长良好33℃培养60h后气生菌丝形成孢子，菌落由白色逐渐变灰最终菌落完全变灰。
2、生理与生化特性：
a.培养温度：28～37℃，最适温度为28℃；
b.在pH 3～7.2范围内生长；
c.色素产生：有
d.明胶液化、淀粉水解、牛奶胨化：阳性。
f.H2S生成：阴性。
g.几丁质酶产生：阴性。
3、16S rDNA序列分析
测得16S rDNA大部分序列1415bp，如SEQ ID No：1所示。将所测序列从GeneBank数据库中的相关种进行比较，构建16S rDNA全序列为基础的系统发育树。结果表明：菌株与小白链霉菌达到99.9％同源。所以认定本发明使用的是小白链霉菌，具体为小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1。
4、营养特征：
小白链霉菌的培养基中不需要添加生长因子，可以利用多种化合物作为碳源，这些物质既可以单独使用，也可以适当的比例复配充当碳源。有机氮或无机氮都可以作为氮源使用。培养基中各组分用量配比按各组分与培养基重量体积百分比计为：碳源用量为培养基的2～10％，氮源用量为培养基的0.2～4％，无机盐用量为培养基的0.01～2％，其余为水。碳源一般采用葡萄糖、木糖、果糖、乳酸和甘油等，氮源可采用牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、豆饼粉、棉子饼粉、尿素以及(NH4)2SO4、NH4C1等，培养基中还包括钾盐、钴盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐、盐酸盐等常用的无机盐类。
上述小白链霉菌在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用。
应用的方法为：将菌株CCTCC NO：M2011043接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养，生成的发酵液经提取可同时得到聚赖氨酸和聚二氨基丁酸。
其中，所述发酵培养基包含如下组分：碳源20～100g/L，氮源2～40g/L，无机盐0.1～20g/L，其余为水，pH6.0～7.0。
其中，所述的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、乳酸、甘油和纤维素水解糖液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4C1中的一种或多种；无机盐为钾盐、钴盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
其中，所述的合适生长的条件是：培养温度为28～37℃，培养时间为48～150小时，其中，当发酵液pH值降低至4.0～4.5时，维持pH值在4.0～4.5直至发酵结束。
其中，发酵结束后，除去菌体的发酵液可提取聚赖氨酸和聚二氨基丁酸。
具体地说：
本发明提供的制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸的方法，是将菌株CCTCC NO：M2011043接种到斜面3～10天后(斜面培养基采用牛肉膏蛋白胨培养基)，在含有碳源、氮源和无机盐的培养基上培养48～150小时，可以生成10～40g/L聚赖氨酸和5～15g/L聚二氨基丁酸，通常发酵条件还包括：培养基为：葡萄糖或甘油2～10％，玉米浆2～4％，(NH4)2SO4 0.01～0.5％，K2HPO4 0.01～0.5％，各组分的含量均为重量体积百分比，即g/100ml，以下同。发酵温度28～37℃，较佳的为26～37℃；培养基的初始pH范围为6.0～7.0，较佳的为6.8～7.0；当发酵液pH值降低至4.0～4.5时，维持pH值在4.0～4.5直至发酵结束；好氧培养。
有益效果：
(1)本发明筛选到一株聚赖氨酸和聚二氨基丁酸生产菌，该菌能利用多种碳源和氮源发酵生产聚赖氨酸和聚二氨基丁酸，操作方便简单，培养条件十分粗放。
(2)可以使用纤维素水解糖液(替代葡萄糖或木糖)和豆饼粉(替代酵母膏或蛋白胨)作为聚赖氨酸和聚二氨基丁酸发酵培养基的碳源和氮源，使发酵原料成本大幅下降。
(3)本发明筛选到的聚赖氨酸生产菌还能副产高价值的聚二氨基丁酸，提高了产品生产利率，经一级、二级种子扩大培养、发酵生产，聚赖氨酸产量可达30g/L以上，聚二氨基丁酸产量可达12g/L以上。
具体实施方式
根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本发明。
实施例1：5L罐游离发酵S.albulus PD-1生产聚赖氨酸及聚二氨基丁酸
斜面培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，利用6mol/LNaOH溶液调pH 7.0
发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4·12H2O 1.58g/L，K2HPO4·7H2O 0.82g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，利用6mol/L NaOH溶液调pH 7.0。
将小白链霉菌S.albulus PD-1(CCTCC NO：M2011043)在种子培养基、28℃、200r/min的摇床条件下培养24h，将300mL种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有2.7L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行游离培养，培养条件：28℃，400r/min，通气量3L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当pH值降至4.2左右时，开启pH自动控制装置，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值在4.0-4.2之间，发酵150h，聚赖氨酸浓度达32.25g/L，聚二氨基丁酸浓度达13.32g/L。
实施例2：固定化发酵S.albulus PD-1生产聚赖氨酸及聚二氨基丁酸
斜面培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏2g/L，蛋白胨2g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，利用6mol/L溶液调pH 7.0。
发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4·12H2O 1.58g/L，K2HPO4·7H2O 0.82g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，利用6mol/L NaOH溶液调pH 7.0。
将小白链霉菌S.albulus PD-1在28℃、200r/min的摇床条件下培养24h，将300mL种子液按10％(v/v)的种子液接种于预装有2.7L灭菌后的固定化反应器中，固定化反应器参照专利200910030330.4进行构建。培养条件：28℃，400r/min，通气量3L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当pH值降至4.2左右时，开启pH自动控制装置，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值在4.0-4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在10g/L左右，发酵150h，经检测，聚赖氨酸浓度达37.25g/L，聚二氨基丁酸浓度达15.52g/L。
实施例3：重复批次发酵聚赖氨酸及聚二氨基丁酸
斜面培养基：Glucose 1g/L，牛肉膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L琼脂20g/L，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，利用6mol/LNaOH溶液调pH 7.0
发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4·12H2O 1.58g/L，K2HPO4·7H2O 0.82g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，利用6mol/L NaOH溶液调pH 7.0。
发酵过程按如下步骤进行：
步骤一、将小白链霉菌S.albulus PD-1(CCTCC NO：M2011043)在种子培养基、28℃、200r/min的摇床条件下培养24h，将300mL种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有2.7L灭菌后的发酵培养基的发酵罐中进行游离培养，培养条件：28℃，400r/min，通气量3L/min，发酵液的pH值随着发酵的进行逐渐下降，当pH值降至4.2左右时，开启pH自动控制装置，利用10％(v/v)的氨水控制发酵液pH值在4.0-4.2之间，进行补料发酵，发酵130h后步骤一结束。
步骤二、将90％发酵液移出发酵罐，将2.7L新鲜发酵培养基补入步骤一所用的发酵罐中。30℃，400r/min，通气量3.5L/min条件下继续培养。当发酵液的pH值降低至4.2左右时，利用10％(v/v)的NaOH控制发酵液pH值4.0-4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为500g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在12g/L左右，进行补料发酵。
步骤三、发酵120h后重复步骤二的操作，重复进行4次，每次发酵时间均为120h。
对每次操作移出的发酵进行检测，发酵液中聚赖氨酸及聚二氨基丁酸的含量见表1
| 批次 | 聚赖氨酸含量(g/L) | 聚二氨基丁酸含量(g/L) |
| 1 | 32.33 | 14.52 |
| 2 | 34.21 | 15.11 |
| 3 | 33.24 | 14.78 |
| 4 | 33.86 | 13.62 |
| 5 | 31.69 | 13.51 |
实施例4：固定化重复批次发酵聚赖氨酸及聚二氨基丁酸
斜面培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏2g/L，多价胨3g/L，琼脂20g/L，pH 7.0。
种子培养基：葡萄糖10g/L，牛肉膏5g/L，酵母膏5g/L，K2HPO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，利用6mol/LNaOH溶液调pH 7.0
发酵培养基：葡萄糖50g/L，酵母膏5g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4·12H2O 1.58g/L，K2HPO4·7H2O 0.82g/L，MgSO4·7H2O 0.1g/L，利用6mol/L NaOH溶液调pH 7.0。
发酵过程按如下步骤进行：
步骤一、将小白链霉菌S.albulus PD-1(CCTCC NO：M2011043)在种子培养基、28℃、200r/min的摇床条件下培养24h，将300mL种子液按10％(v/v)的种子量接种于预装有2.7L灭菌后的发酵培养基的固定化反应器中，固定化反应器参照专利200910030330.4进行构建。培养条件：28℃，400r/min，通气量3L/min，当pH值降至4.2左右时，开启pH自动控制装置，利用5％(v/v)的NaOH控制发酵液pH值在4.0-4.2之间，进行补料发酵，补料母液浓度为500g/L的葡萄糖，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在12g/L，发酵150h第一步骤结束。
步骤二、将发酵液全部移出并将3L新鲜发酵培养基补入步骤一的固定化反应器中。30℃，400r/min，通气量3.5L/min条件下继续培养。当发酵液的pH值降低至4.2左右时，利用10％(v/v)的NaOH控制发酵液pH值4.0-4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在10g/L时，打开补料装置，将母液浓度为650g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在12g/L左右，进行补料发酵。
步骤三、发酵120h后重复步骤二的操作，重复进行4次，每次发酵时间均为120h。
对每批次发酵液进行检测，聚赖氨酸及聚二氨基丁酸的浓度见表1
| 批次 | 聚赖氨酸含量(g/L) | 聚二氨基丁酸含量(g/L) |
| 1 | 35.56 | 15.35 |
| 2 | 36.35 | 16.64 |
| 3 | 36.73 | 16.85 |
| 4 | 35.85 | 14.24 |
| 5 | 33.16 | 13.75 |
实施例5：10吨发酵罐发酵生产聚赖氨酸及聚二氨基丁酸
斜面培养基：葡萄糖10g/L，酵母膏5g/L，蛋白胨5g/L，琼脂20g/L，pH7.0。
一级发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏2g/L，蛋白胨1g/L，牛肉膏2g/L，(NH4)2SO4 5 g/L，NaH2PO4 0.68g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，NaCl 1g/L，FeSO4·7H2O 0.1g/L，CaCl2·2H2O 0.1g/L，明矾0.01g/L，CuSO4·5H2O 0.01g/L，CoCl2·6H2O 0.1g/L，H3BO3 0.01g/L，ZnSO4·7H2O 0.1g/L，NH4Mo7O24·4H2O 0.01g/L。
二级发酵培养基：葡萄糖20g/L，酵母膏3g/L，牛肉膏2g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4 0.8g/L，KH2PO4 1g/L，Mg/LSO4·7H2O 0.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，pH6.8。
发酵培养基：葡萄糖30g/L，(NH4)2SO4 5g/L，Na2HPO4 0.8g/L，KH2PO4 1g/L，MgSO4·7H2O 0.25g/L，ZnSO4·7H2O 0.05g/L，FeSO4·7H2O 0.01g/L，酵母膏5g/L，pH6.8。
一级种子制备：将小白链霉菌S.albulus PD-1(CCTCC NO：M2011043)制成孢子悬液，调整孢子浓度为108个/mL，按5％(v/v)接种量接种于若干500mL三角瓶液体培养基中，三角瓶装液量150ml 28℃，200r/min培养36小时。
二级种子制备：按5％(v/v)接种量将一级种子接种在250L发酵罐中进行扩大培养通风量为15m3/h搅拌转速为320rpm，28℃下培养48小时，发酵过程中不进行补料及pH调控。
10吨发酵罐生产：按接种量为1％(v/v)将二级种子接种到10吨发酵罐中，通风量270m3/L搅拌转速50rpm，在28℃下培养。当pH值降至4.2左右时，开启pH自动控制装置，利用10％(v/v)的NaOH控制发酵液pH值在4.0-4.2之间，当发酵液中残留葡萄糖在15g/L时，打开补料装置，将母液浓度为300g/L的葡萄糖补入发酵液中，控制发酵液中葡萄糖浓度保持在12g/L，发酵120小时，发酵结束后发酵液中ε-PL浓度达36.45g/L，聚二氨基丁酸浓度达15.25g/L。
Claims (6)
1.一种小白链霉菌，其分类命名为小白链霉菌Streptomyces albulus PD-1，已保藏于中国典型培养物保藏中心，登记入册的编号是CCTCC NO：M2011043，保藏日期是：2011年2月21日。
2.权利要求1所述的小白链霉菌在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于将菌株CCTCC NO：M2011043接种于含有碳源、氮源、无机盐和水的无菌发酵培养基中，在合适生长的条件下进行好氧培养，生成的发酵液经提取可同时得到聚赖氨酸和聚二氨基丁酸。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述发酵培养基包含如下组分：碳源20～100g/L，氮源2～40g/L，无机盐0.1～20g/L，其余为水，pH 6.0～7.0。
5.根据权利要求3或4所述的应用，其特征在于所述的碳源为葡萄糖、木糖、果糖、乳酸、甘油和纤维素水解糖液中的一种或多种；氮源为牛肉膏、蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉、棉籽饼粉、尿素、(NH4)2SO4和NH4Cl中的一种或多种；无机盐为钾盐、钴盐、钠盐、磷酸盐、磷酸二氢盐和盐酸盐中的一种或多种。
6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的合适生长的条件是：培养温度为28～37℃，培养时间为48～150小时，其中，当发酵液pH值降低至4.0～4.5时，维持pH值在4.0～4.5直至发酵结束。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011100499868A CN102174448B (zh) | 2011-03-02 | 2011-03-02 | 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN2011100499868A CN102174448B (zh) | 2011-03-02 | 2011-03-02 | 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN102174448A true CN102174448A (zh) | 2011-09-07 |
| CN102174448B CN102174448B (zh) | 2012-07-25 |
Family
ID=44517706
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN2011100499868A Active CN102174448B (zh) | 2011-03-02 | 2011-03-02 | 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN102174448B (zh) |
Cited By (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102618465A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-08-01 | 南开大学 | 一株链霉菌及其应用 |
| CN105441373A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-03-30 | 南京工业大学 | 一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN106434421A (zh) * | 2016-08-15 | 2017-02-22 | 山东省药学科学院 | 一株ε‑聚赖氨酸高产菌株及生产ε‑聚赖氨酸方法 |
| CN110656065A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-07 | 江南大学 | 一株生产ε-聚赖氨酸的链霉菌及其应用 |
| CN110804572A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-18 | 江南大学 | 一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法 |
| CN115466140A (zh) * | 2022-10-20 | 2022-12-13 | 轩凯生物科技(山东)有限公司 | 一种提高有机肥堆体水分均匀性的秸秆腐熟剂及其应用 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1260004A (zh) * | 1997-04-23 | 2000-07-12 | 智索股份有限公司 | 大量产生ε－聚－L－赖氨酸的菌株和生产方法 |
| CN101671703A (zh) * | 2009-07-01 | 2010-03-17 | 天津科技大学 | 一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法 |
| CN101928685A (zh) * | 2010-03-11 | 2010-12-29 | 王家琛 | 白色链霉菌mc-15菌株及该菌株制备发酵液的方法和应用 |
-
2011
- 2011-03-02 CN CN2011100499868A patent/CN102174448B/zh active Active
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1260004A (zh) * | 1997-04-23 | 2000-07-12 | 智索股份有限公司 | 大量产生ε－聚－L－赖氨酸的菌株和生产方法 |
| CN101671703A (zh) * | 2009-07-01 | 2010-03-17 | 天津科技大学 | 一种提高ε-聚-L-赖氨酸产量的新方法 |
| CN101928685A (zh) * | 2010-03-11 | 2010-12-29 | 王家琛 | 白色链霉菌mc-15菌株及该菌株制备发酵液的方法和应用 |
Cited By (10)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102618465A (zh) * | 2012-03-26 | 2012-08-01 | 南开大学 | 一株链霉菌及其应用 |
| CN102618465B (zh) * | 2012-03-26 | 2014-02-19 | 南开大学 | 一株链霉菌及其应用 |
| CN105441373A (zh) * | 2015-12-04 | 2016-03-30 | 南京工业大学 | 一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN105441373B (zh) * | 2015-12-04 | 2019-01-18 | 南京工业大学 | 一株小白链霉菌基因工程菌及其构建方法与应用 |
| CN106434421A (zh) * | 2016-08-15 | 2017-02-22 | 山东省药学科学院 | 一株ε‑聚赖氨酸高产菌株及生产ε‑聚赖氨酸方法 |
| CN106434421B (zh) * | 2016-08-15 | 2019-06-11 | 山东省药学科学院 | 一株ε-聚赖氨酸高产菌株及生产ε-聚赖氨酸方法 |
| CN110656065A (zh) * | 2019-10-25 | 2020-01-07 | 江南大学 | 一株生产ε-聚赖氨酸的链霉菌及其应用 |
| CN110804572A (zh) * | 2019-12-04 | 2020-02-18 | 江南大学 | 一株链霉菌及其制备ε-聚赖氨酸的方法 |
| CN115466140A (zh) * | 2022-10-20 | 2022-12-13 | 轩凯生物科技(山东)有限公司 | 一种提高有机肥堆体水分均匀性的秸秆腐熟剂及其应用 |
| CN115466140B (zh) * | 2022-10-20 | 2023-09-22 | 轩凯生物科技(山东)有限公司 | 一种提高有机肥堆体水分均匀性的秸秆腐熟剂及其应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN102174448B (zh) | 2012-07-25 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103141666B (zh) | 一种利用白酒酒糟生产微生物饲料益生菌剂的方法 | |
| CN102174448B (zh) | 一种小白链霉菌及其在制备聚赖氨酸和聚二氨基丁酸中的应用 | |
| CN103173371B (zh) | 酿酒酵母与嗜酸乳杆菌的饲料用复合微生物制剂的生产 | |
| CN101885640B (zh) | 一种利用微生物复合菌制备蘑菇培养基质的方法 | |
| CN102796673A (zh) | 一株阿魏酸酯酶生产菌株及应用该菌株生产阿魏酸酯酶的方法 | |
| CN103483021B (zh) | 一种利用em菌群转化冬虫夏草发酵残液制备液体肥料的方法 | |
| CN102783565B (zh) | 一种虫草饲料添加剂的制备方法 | |
| CN110373359A (zh) | 一种白色链霉菌X-18及利用该菌生产ε-聚赖氨酸的方法 | |
| CN101831481A (zh) | 一种新的伊枯草菌素a及其同系物的制备方法 | |
| CN102286413A (zh) | 一种苏云金杆菌液态发酵培养基的制备方法 | |
| CN101933439A (zh) | 一种利用植物油提高桑黄液体培养菌丝量的方法 | |
| CN102994430B (zh) | 一株细菌纤维素产生菌株及其应用 | |
| CN104388341A (zh) | 一种胶质芽孢杆菌菌株及其在海藻降解中的应用 | |
| CN103535525B (zh) | 一种富含氨基酸蛋白生物饲料添加剂的生产方法 | |
| CN103756922A (zh) | 一种生命结合态有机酵母蛋白硒产品生产方法和应用 | |
| CN110129225A (zh) | γ～聚谷氨酸产生菌及选育、制备γ～聚谷氨酸的方法 | |
| CN105713851B (zh) | 一株拜氏梭菌及其应用 | |
| CN101974455B (zh) | 高产γ-氨基丁酸的大肠杆菌菌株及其γ-氨基丁酸生产方法 | |
| CN103013863B (zh) | 一种鞘氨醇单胞菌及其在制备鼠李糖胶中的应用 | |
| CN102766663A (zh) | 桑黄活性多糖的制备方法 | |
| CN105368887B (zh) | 一种ε-聚-L-赖氨酸的发酵生产工艺 | |
| CN102978142B (zh) | 一株高效降解木质素的水稻内生菌 | |
| CN101643712B (zh) | 高效转化谷氨酰胺合成l-茶氨酸的大肠杆菌菌株及其应用 | |
| CN103451162A (zh) | 一种米曲霉分泌制备锰过氧化物酶的方法 | |
| CN102286411A (zh) | 植物乳杆菌及其在发酵白菜外包叶中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant |