CN102286411A - 植物乳杆菌及其在发酵白菜外包叶中的应用 - Google Patents

植物乳杆菌及其在发酵白菜外包叶中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了植物乳杆菌及其在发酵白菜外包叶中的应用。本发明提供了植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5。本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5，其保藏号为CGMCC No.5028。本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028能够快速发酵白菜外包叶，有效抑制大肠杆菌的生长。按5％接种量接种Z5-5发酵白菜外包叶，在30℃条件下发酵24h，发酵菜汁的pH即可达到2.07，且已检测不到大肠杆菌。与自然发酵相比，接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶各种氨基酸的含量都有不同程度的增加，氨基酸总量增加了16.03％，因此，营养价值得到了明显提高。

Description

植物乳杆菌及其在发酵白菜外包叶中的应用
技术领域
本发明涉及植物乳杆菌及其在发酵白菜外包叶中的应用。
背景技术
白菜外包叶为白菜外层老叶，是粗纤维较多、食用品相不太好的部分。白菜外包叶含有丰富的粗纤维、维生素及一些微量元素等，是畜禽良好的饲料来源，但在收获期存在着量大易腐烂的特点，非常不易贮藏。白菜外包叶在我国资源丰富，但除了少部分被利用外，大部分被废弃，以堆积等形式直接倾入环境，造成极大的污染和浪费。
发明内容
本发明的一个目的是提供一种植物乳杆菌。
本发明所提供的植物乳杆菌，为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5，其保藏号为CGMCC No.5028。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028在发酵白菜中的应用也属于本发明的保护范围。
所述白菜为白菜外包叶。
本发明的又一个目的是提供一种发酵白菜的方法。
本发明所提供的发酵白菜的方法，包括以下步骤：用所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜。
所述白菜为白菜外包叶。
所述发酵的温度为25℃-45℃或25℃或30℃或45℃；
所述发酵的时间为24h-72h或24h或48h或72h；
所述发酵的接种量的体积百分比为1％-10％或1％或5％或10％；
所述发酵的体系中起始pH值为6.0-7.0或6.0或6.5或7.0。
本发明的又一个目的是提供一种制备畜禽饲料的方法。
本发明所提供的制备畜禽饲料的方法，包括以下步骤：用所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜，即得到畜禽饲料。
所述发酵的温度为25℃-45℃或25℃或30℃或45℃；
所述发酵的时间为24h-72h或24h或48h或72h；
所述发酵的接种量的体积百分比为1％-10％或1％或5％或10％；
所述发酵的体系中起始pH值为6.0-7.0或6.0或6.5或7.0。
所述白菜为白菜外包叶。
所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028在制备畜禽饲料中的应用也属于本发明的保护范围。
本发明的又一个目的是提供培养所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028的方法。
本发明所提供的培养所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028的方法，包括将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028在用于培养植物乳杆菌的培养基中培养的步骤。
本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028能够快速发酵白菜外包叶，有效抑制大肠杆菌的生长。按5％接种量接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶，在30℃条件下发酵24h，发酵菜汁的pH即可达到2.07，且已检测不到大肠杆菌。与自然发酵相比，接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶各种氨基酸的含量都有不同程度的增加，氨基酸总量增加了16.03％，因此，营养价值得到了明显提高。应用本发明所用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCCNo.5028发酵白菜外包叶具有发酵效率高、成本低廉等优点，可用于生产绿色环保生物饲料。
附图说明
图1为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028菌株在起始pH值为6.5的MRS培养基中生长与产酸曲线。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028的分离、纯化及鉴定
取河南郑州地区自制的泡菜汁5mL，加入45mL蒸馏水，用震荡器震荡5min，10-1-10-5梯度稀释。分别从各梯度取20μL涂布于MRS培养基上，静置厌氧培养48h，挑取菌落形态、大小、颜色和光泽度等有明显差别的单菌落，重复划线，直至得到纯菌落。将菌株接种于MRS液体培养基中发酵24h，10000rpm离心10min后，取上清液，测其pH值，并用1mol/L盐酸和1mol/L氢氧化钠将之pH调为3.0和6.0，以藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonasaeruginosa)和大肠杆菌(Escherichia coli)分别作为指示菌，用牛津杯双层平板法进行抑菌试验，从中筛选出抑菌效果好的Z5-5菌株。
将Z5-5菌株在MRS固体培养基上培养24h后，观察菌落的大小、颜色、边缘状况，革兰氏染色镜检细菌形态。利用API 50CHL检测Z5-5菌株对49种不同碳源的同化能力。Z5-5菌株菌落呈现乳白色，边缘整齐；Z5-5菌株细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；Z5-5菌株接触酶阴性，氧化酶阴性。
Z5-5菌株碳源发酵实验结果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。根据细胞显微形态、碳源发酵实验结果和16S rRNA基因序列数据，将菌株Z5-5鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。
该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5已于2011年07月05日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101)，保藏号为CGMCC No.5028。
表1菌株Z5-5CGMCC No.5028的碳源发酵实验结果
Figure BDA0000084267390000031
注：表1中+为阳性反应，-为阴性反应，W为弱阳性。
实施例2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028的生长及产酸性能
将-80℃保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028接种于MRS固体培养基上培养至长出菌落，得到活化的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z5-5CGMCC No.5028。将活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028接种于MRS液体培养基(蛋白胨10.0g/L，牛肉膏10.0g/L，酵母膏5.0g/L，柠檬酸氢二铵2.0g/L，葡萄糖20.0g/L，吐温-801.0g/L，乙酸钠5.0g/L，磷酸氢二钾2.0g/L，硫酸镁0.58g/L，硫酸锰0.25g/L)中，30℃恒温静置培养，起始pH值为6.5，每隔3h测定发酵液中的pH值，同时用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)，绘制生长曲线及产酸曲线，如图1所示。发酵18h，发酵液pH已降到3.56，24h后菌体进入生长稳定期，发酵液pH值稳定在3.4左右。
实施例3、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028在不同pH值、温度及盐浓度环境条件下的生长情况
用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠将MRS液体培养基的起始pH值分别调至2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0，将活化的Z5-5菌株CGMCC No.5028分别接种于上述培养基中，30℃恒温静置培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z5-5菌株CGMCC No.5028在起始pH2.5条件下生长微弱，在起始pH3～pH9的条件下生长情况良好。
将活化的Z5-5菌株CGMCC No.5028接种于MRS液体培养基，分别在5℃、10℃、15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、42℃和50℃等温度下培养24h，起始pH值为6.5，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z5-5菌株在10℃、5℃和50℃温度环境下呈现微弱生长，在15℃～45℃条件下生长状况良好。
将活化的Z5-5菌株CGMCC No.5028接种于分别含有质量百分比浓度为3％NaCl和6.5％NaCl的MRS液体培养基中在30℃培养24h，起始pH值为6.5，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z5-5菌株CGMCC No.5028在3％NaCl和6.5％NaCl的条件下生长状况均良好。
表2Z5-5菌株CGMCC No.5028在不同环境条件下的生长情况
Figure BDA0000084267390000041
Figure BDA0000084267390000051
注：表2中+为阳性反应，-为阴性反应，W为弱阳性。
实施例4、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶
方法I
将-80℃保存的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028接种于MRS固体培养基上培养至长出菌落，得到活化的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z5-5CGMCC No.5028。将活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028接种于MRS液体培养基中，起始pH值为6.5，于30℃培养24h，得到菌体培养液；所述菌体培养液为培养容器中的所有物质。
取60g白菜外包叶(购自郑州当地蔬菜批发市场的白菜，取其外包叶)和200mL水加入锥形瓶中，加入质量百分比浓度为0.9％的NaCl，按照体积百分比为5％的接种量，再向其中接入上述得到的菌体培养液，在起始pH值为6.0和30℃的条件下进行发酵。同时，以不接入上述菌液为自然发酵作为对照，发酵条件与接入Z5-5CGMCC No.5028菌液的发酵条件相同。分别于24h、48h和72h取样，采用稀释平板计数法测定大肠杆菌和乳酸菌的菌落数，并记录发酵液的pH值。自然发酵与接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶的大肠杆菌和乳酸菌的菌落数结果见表3；自然发酵与接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶的pH值结果见表4。同时对自然发酵和接种Z5-5
CGMCC No.5028发酵的游离氨基酸组成含量进行了比较，结果见表5。
表3自然发酵与接种Z5-5CGMCC No.5028发酵的大肠杆菌及乳酸菌菌落数比较
Figure BDA0000084267390000052
表4自然发酵与接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶的pH值比较
表5自然发酵与接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶的游离氨基酸组成与含量(g/Kg)比较
Figure BDA0000084267390000062
结果表明植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028能够快速发酵白菜外包叶，有效抑制大肠杆菌的生长。发酵24h，接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶的pH值即下降到2.07，发酵菜汁中已检测不到大肠杆菌。同时，与自然发酵相比，接种Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜外包叶各种氨基酸的含量都有不同程度的增加，氨基酸总量增加了16.03％。
方法II
用与方法I相同的方法得到菌体培养液；所述菌体培养液为培养容器中的所有物质。
取60g白菜外包叶(购自郑州当地蔬菜批发市场的白菜，取其外包叶)和200mL水加入锥形瓶中，加入质量百分比浓度为0.9％的NaCl，按照体积百分比为10％的接种量，再向其中接入上述得到的菌体培养液，在起始pH值为6.5和25℃的条件下进行发酵。同时，以不接入上述菌液为自然发酵作为对照，发酵条件与接入Z5-5CGMCCNo.5028菌液的发酵条件相同。分别于24h、48h和72h取样，采用稀释平板计数法测定大肠杆菌和乳酸菌的菌落数，并记录发酵液的pH值。
结果与方法I无显著差异。
方法III
用与方法I相同的方法得到菌体培养液；所述菌体培养液为培养容器中的所有物质。
取60g白菜外包叶(购自郑州当地蔬菜批发市场的白菜，取其外包叶)和200mL水加入锥形瓶中，加入质量百分比浓度为0.9％的NaCl，按照体积百分比为1％的接种量，再向其中接入上述得到的菌体培养液，在起始pH值为7.0和45℃的条件下进行发酵。同时，以不接入上述菌液为自然发酵作为对照，发酵条件与接入Z5-5CGMCC No.5028菌液的发酵条件相同。分别于24h、48h和72h取样，采用稀释平板计数法测定大肠杆菌和乳酸菌的菌落数，并记录发酵液的pH值。
结果与方法I无显著差异。
Figure IDA0000084267490000021

Claims (9)

1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5，其保藏号为CGMCC No.5028。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028在发酵白菜中的应用。
3.一种发酵白菜的方法，包括以下步骤：用权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：
所述发酵的温度为25℃-45℃；
所述发酵的时间为24h-72h；
所述发酵的接种量的体积百分比为1％-10％；
所述发酵的体系中起始pH值为6.0-7.0。
5.一种制备畜禽饲料的方法，包括以下步骤：用权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028发酵白菜，即得到畜禽饲料。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：
所述发酵的温度为25℃-45℃；
所述发酵的时间为24h-72h；
所述发酵的接种量的体积百分比为1％-10％；
所述发酵的体系中起始pH值为6.0-7.0。
7.根据权利要求5或6所述的方法，其特征在于：所述白菜为白菜外包叶。
8.权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028在制备畜禽饲料中的应用。
9.培养权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028的方法，包括将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z5-5CGMCC No.5028在用于培养植物乳杆菌的培养基中培养的步骤。
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