CN103205376A - 一株适用于发酵饲料的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

一株能够加速饲料发酵并提高发酵饲料的营养价值和饲用品质的植物乳杆菌及其应用。技术方案是：其特征在于：所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Ps-F）是从102株植物乳杆菌中筛选出来的具有良好的耐酸性、生长能力强、产酸速度快的乳酸菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.5684，保藏日期为2011年12月31日。本发明还公开了其使用方法。

Description

一株适用于发酵饲料的植物乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株发酵饲料用植物乳杆菌，具体是一株能够加速饲料发酵并提高发酵饲料的营养价值和饲用品质的植物乳杆菌及其应用。

背景技术

随着我国畜牧业的快速发展，对于饲料，尤其是蛋白质饲料的需求日益增大，对饲料的品质也有了更高的要求。微生物发酵饲料具有的诸多优点使其得到越来越多的关注。微生物发酵饲料是以植物性农副产品为主要原料，通过微生物的代谢作用，降解部分多糖、蛋白质、和脂肪等大分子物质，生成有机酸、可溶性多肽等小分子物质，形成营养丰富、适口性好、活菌含量高的生物饲料，从而使饲料成分变得丰富、营养易于动物吸收，使动物更好的成长。

乳酸菌是指能利用乳糖或者葡萄糖发酵产生乳酸的一类微生物，其在饲料中应用很广泛。乳酸菌发酵饲料时可产生有机酸、降低饲料的pH，同时产生具有抑菌或杀菌效果的肽抗生素，从而有效地抑制病原微生物的滋生，减少有害微生物的数量，进而利于饲料的贮存。乳酸菌发酵后的饲料，具有良好的适口性，同时饲料中的乳酸菌活菌进入动物肠道后，使动物肠道中有益菌数量增加，促进肠道内形成有益优势菌群，从而竞争性抑制病原微生物增殖，保持肠道内微生态平衡，同时对机体的调节免疫产生积极地影响，提高动物的免疫力。因此，乳酸菌发酵饲料具有较大潜力和广阔的发展前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一株能够加速饲料发酵并提高发酵饲料的营养价值和饲用品质的植物乳杆菌及其应用。

本发明是通过下述技术方案实现的。

一株适用于发酵饲料的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Ps-F）是从102株植物乳杆菌中筛选出来的具有良好的耐酸性、生长能力强、产酸速度快的乳酸菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.5684，保藏日期为2011年12月31日。

一株植物乳杆菌的应用，其特征在于：用于加速饲料发酵并提高发酵饲料的营养价值和饲用品质。

一株植物乳杆菌的活化和培养，其特征在于：将冷冻保存的L.plantarumPs-F接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到所述的活化L.plantarum Ps-F菌种；所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

一株植物乳杆菌菌粉制备：将上述活化的菌种离心后，添加菌种保护剂冻干成菌粉，使其含L.plantarum Ps-F活菌数在2.0×10¹¹cfu/g。

一株植物乳杆菌在发酵饲料中的使用方法：向饲料原料中加入煮沸并冷却至室温的自来水，使饲料含水量达到40%。以接种量2×10⁶cfu/g向全价饲料中接种L.plantarum Ps-F菌粉，充分混匀。准确称取50g饲料原料于真空包装袋中，将包装袋压实以尽量排空空气，用封口机将包装袋封口，常温发酵。

发酵饲料的品质检测：饲料在发酵期间，分别于0d，0.5d，1d，1.5d，2d，2.5d，3d，4d，6d和10d取样测定其pH及微生物组成分析等。

本发明提供的植物乳杆菌具有下述的积极效果：

本发明通过乳酸菌对发酵饲料品质的影响、乳酸菌在饲料发酵过程中的动态变化，筛选出一株能够加速饲料发酵并提高发酵饲料的营养价值的菌种L.plantarum Ps-F。

本发明还涉及将本发明菌种添加到饲料中，在发酵前期可以快速降低pH值，乳酸菌数迅速增加，对其中的酵母菌、大肠菌群、霉菌、芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌有良好的抑制效果，并在长时间发酵过程中发酵饲料具有良好的稳定性。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步说明；下述实施例只是说明性的，并不限制本发明的保护范围。

下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法。

一株适用于发酵饲料的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌（Lactobacillusplantarum Ps-F）是从102株植物乳杆菌中筛选出来的具有良好的耐酸性、生长能力强、产酸速度快的乳酸菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.5684，保藏日期为2011年12月31日。

一株植物乳杆菌的应用，用于加速饲料发酵并提高发酵饲料的营养价值和饲用品质。

植物乳杆菌的活化和培养，将冷冻保存的L.plantarum Ps-F接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到所述的活化L.plantarum Ps-F菌种；所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

菌粉制备：将上述活化的菌种离心后，添加菌种保护剂冻干成菌粉，使其含L.plantarum Ps-F活菌数在2.0×10¹¹cfu/g。

植物乳杆菌在发酵饲料中的使用方法：向饲料原料中加入煮沸并冷却至室温的自来水，使饲料含水量达到40%。以接种量2×10⁶cfu/g向全价饲料中接种L.plantarum Ps-F菌粉，充分混匀。准确称取50g饲料原料于真空包装袋中，将包装袋压实以尽量排空空气，用封口机将包装袋封口，常温发酵。

实验1：L.plantarum Ps-F可加速全价饲料的发酵

全价饲料配方见表1（原料均为市售），向混合均匀的全价饲料中加入煮沸并冷却至室温的自来水，使饲料含水量达到40%。以接种量2×10⁶cfu/g向全价饲料中接种L.plantarum Ps-F菌粉，充分混匀。准确称取50g全价饲料于真空包装袋中，将包装袋压实以尽量排空空气，用封口机将包装袋封口，常温发酵。全价饲料在恒温发酵期间，在0d，0.5d，1d，1.5d，2d，2.5d，3d，4d，6d和10d分别进行取样测定其pH及活菌数。

表1全价饲料组成（干物质基础）%

从密封袋中准确称取10g发酵饲料样品于装有玻璃珠的250mL灭菌三角瓶中，加入90g灭菌蒸馏水，置于摇床上160r/min摇动15min，取0.5mL稀释液用0.85%（w/v）灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数时，采用MRS琼脂培养基，平板倾注，30℃厌氧培养48h后，对乳酸菌进行计数。取适量上述发酵饲料10倍稀释液测定pH值。平行实验重复3次，取平均值。对L.plantarumPs-F活菌数的测定采用反转录荧光定量PCR技术（RT-qPCR），结果见表2。

表2全价饲料发酵过程中的乳酸菌和pH值动态变化

注：同列肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

由实验结果可知，添加植物乳杆菌的发酵饲料与对照组相比，添加乳酸菌发酵饲料的pH值持续降低，实验组在发酵1d后pH值呈现明显的下降趋势，在发酵10d时pH值达到4.24。而对照组则在10d的发酵期间pH值下降缓慢，发酵10d时pH值为5.75。

采用平板计数法对发酵饲料中的乳酸菌总数进行测定，乳酸菌总数结果显示，发酵组中乳酸菌总数持续增长，其中实验组的乳酸菌总数在发酵4d达到最大值，为9.83log CFU/g。而对照组中的乳酸菌总数分别在发酵3d达到最大值，仅为8.36log CFU/g。同时应用RT-PCR实验组中L.plantarum Ps-F活菌数进行测定，结果显示，实验组在发酵3d时达到最大值，为9.18log CFU/g，后续发酵过程中，实验组中的L.plantarum Ps-F活菌数变化不明显，发酵10d时活菌数为8.97log CFU/g。

实验2：L.plantarum Ps-F可提高发酵全价饲料的品质

向混合均匀的全价饲料中加入煮沸并冷却至室温的自来水，使饲料含水量达到40%。以接种量2×10⁶cfu/g向全价饲料中接种L.plantarum Ps-F菌粉，充分混匀。准确称取50g全价饲料于真空包装袋中，将包装袋压实以尽量排空空气，用封口机将包装袋封口，常温发酵。全价饲料在恒温发酵期间，在0d，0.5d，1d，1.5d，2d，2.5d，3d，4d，6d和10d分别进行取样测定发酵饲料中的微生物组成。

从密封袋中准确称取10g发酵全价样品于装有玻璃珠的250mL灭菌三角瓶中，加入90g灭菌蒸馏水，置于摇床上160r/min摇动15min，取0.5mL稀释液用0.85%（w/v）灭菌生理盐水梯度稀释至一定倍数时，采用各选择培养基，对酵母菌、霉菌、大肠杆菌、芽孢杆菌、梭状芽孢杆菌进行选择计数。

其中：酵母菌和霉菌的选择培养，采用马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基（含0.09%的酒石酸），涂布，30℃培养48h；大肠杆菌的选择培养，采用大肠杆菌显色培养基，涂布，30℃培养24h；在对好氧细菌大肠杆菌、酵母菌、霉菌以及乳酸菌进行微生物分析之后，将稀释液在75℃加热15min之后，分别对芽孢杆菌和梭状芽孢杆菌进行测定，其中芽孢杆菌采用营养琼脂培养基，涂布，30℃培养48h，梭状芽孢杆菌采用梭状芽孢杆菌计数琼脂培养基，涂布，30℃厌氧培养48h。

表3全价饲料发酵过程中的酵母菌、霉菌和大肠杆菌的活菌数

注：ND，未检出。同列肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

通过表3中微生物组成分析可知，与对照组相比，乳酸菌发酵的全价饲料中酵母菌活菌数逐渐减少，在发酵10d时最低，实验组中的酵母菌活菌数分别是3.65log CFU/g，显著低于对照组的5.89log CFU/g（P<0.05）。发酵结束时，乳酸菌发酵饲料中霉菌未被检出。添加乳酸菌发酵4d时，发酵饲料中没有检测到霉菌，而此时对照组中霉菌活菌数为4.89log CFU/g。全价饲料发酵过程中的大肠菌群的活菌数，相比对照组，实验组发酵饲料中的大肠菌群活菌数下降趋势显著（P<0.05），发酵10d时，益生乳酸菌发酵的全价饲料中的大肠菌群未被检出，此时对照组中的大肠菌群活菌数处于较高的水平，为7.82logCFU/g。

表4全价饲料发酵过程中的芽孢杆菌和梭状芽胞杆菌的活菌数

注：ND，未检出。同列肩标不同小写字母表示差异显著（P<0.05）

全价饲料对照组和实验组发酵过程中的芽孢杆菌和梭状芽胞杆菌的活菌数见表4，实验组中的芽孢杆菌活菌数在饲料中呈现先升后降的趋势，在发酵1.5d出现最大值，为5.78log CFU/g，之后持续下降。发酵10d时，实验组的芽孢杆菌活菌数是2.69log CFU/g，显著低于对照组中的4.48log CFU/g（P<0.05）。实验组在发酵期间梭状芽孢杆菌活菌数呈下降的趋势，并显著低于对照组（P<0.05）。发酵10d时，实验组中的梭状芽孢杆菌未被检出，而对照组中梭状芽孢杆菌活菌数分别为2.15log CFU/g。

实验结果表明，添加菌种P8的发酵全价饲料中的芽孢杆菌和酵母菌均有减少，有害菌梭状芽孢杆菌、霉菌和大肠杆菌已经完全被抑制。结果证明添加乳酸菌后可以抑制饲料中的有害菌，从而进一步来提高发酵全价饲料的品质。

Claims (5)

1.一株适用于发酵饲料的植物乳杆菌，其特征在于：所述植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum Ps-F）是从102株植物乳杆菌中筛选出来的耐酸、产酸能力强、生长速度快得乳酸菌；该菌菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号：CGMCC No.5684，保藏日期为2011年12月31日。

2.一株植物乳杆菌的应用，其特征在于：用于加速饲料发酵并提高发酵饲料的营养价值和饲用品质。

3.一株植物乳杆菌的活化和培养，其特征在于：将冷冻保存的L.plantarumPs-F接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养18-22h，如此传代培养2-3次得到所述的活化L.plantarum Ps-F菌种，所述的MRS液体培养基组成如下：10g蛋白胨、5g牛肉膏、4g酵母浸粉、20g葡萄糖、2g磷酸氢二钾、5g乙酸钠、2g柠檬酸三钠、1mL吐温80、0.2g硫酸镁、0.05g硫酸锰加入1000mL蒸馏水，调节pH至6.5，121℃灭菌15min。

4.一株植物乳杆菌菌粉的制备，其特征在于：将活化的菌种离心后，加入适量菌种保护剂冻成干粉，使其含乳酸菌活菌数在2.0×10¹¹cfu/g。

5.一株植物乳杆菌在发酵饲料中的使用方法，其特征在于：向混合均匀的饲料中加入煮沸并冷却至室温的自来水，使饲料含水量达到40%。以接种量2×10⁶cfu/g向饲料中接种L.plantarum Ps-F菌粉，充分混匀。准确称取50g全价饲料于真空包装袋中，将包装袋压实以尽量排空空气，用封口机将包装袋封口，常温发酵。